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药物化学类论文 具有免疫调节活性真菌多糖的筛选、结构表征及机制的初步研

2018-12-16 15:50:35来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要

  目的:比较5种食用真菌粗多糖的免疫调节活性;筛选活性最好的进行分离、纯化出均一多糖,研究其理化性质、化学结构及对RAW264.7细胞的免疫调节作用初步机理;建立一种新的生物体内检测多糖含量的方法,初步考察该多糖在大鼠体内的吸收分布情况。

  方法:1.采用水提醇沉法、Sevage法分别得到白玉菇等五种食用真菌粗多糖;采用苯酚-硫酸法、间羟基联苯法、Lowry法分别测定它们总糖、酸性糖和蛋白质含量;经PMP柱前衍生化HPLC法对单糖组成进行分析;采用MTT法体外考察它们对小鼠脾细胞增殖的影响,对NK细胞的杀伤作用及对巨噬细胞吞噬作用的影响;筛选出免疫调节活性最强的粗多糖,进行下一步的分离纯化。

  2.采用混合离子交换树脂、Sephadex G-50对粗多糖进行分离纯化出均一多糖,测定其理化性质,采用甲基化结合GC-MS、IR、LC-MS、NMR等方法研究其结构。

  3.采用MTT比色法、吞噬中性红实验、Griess法测定多糖对RAW264.7细胞的增殖、吞噬能力以及NO的释放影响,采用ELISA法测定IL-1、IL-6和TNF-α等细胞因子的释放量;采用Western blot法来检测蛋白的表达。

  4.采用FITC标记多糖形成复合物后再与NaI反应,采用ICP-MS测定该复合物中碘的含量,从而间接反映多糖的含量;采用大鼠灌胃碘代多糖,分别在1h、2h、3h及3h考察吸收入血及在各主要脏器的分布情况。

  结果:1.白玉菇、杏鲍菇、真姬菇、口蘑、平菇五种真菌粗多糖,它们的总糖、酸性糖、蛋白质含量分别为49.3%、48.1%、51.2%、56.7%、53.9%;1.59%、0.84%、1.68%、

  2.27%、2.33%;1.25%、1.68%、0.31%、0.58%、1.6;它们的组成糖均含有甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Gcl),但比例不同,且都是Gcl的含量最高。除杏鲍菇外,它们都含有少量酸性糖。通过免疫调节活性的实验我们可以看出,这五种真菌粗多糖都具有一定的免疫调节活性,且活性相近,当它们的浓度为10µg/mL时,均无明显的调节作用,当浓度为100µg/mL、1000µg/mL时,五种真菌粗多糖对淋巴细胞的增殖、NK细胞的杀伤及巨噬细胞的吞噬作用均具有显着性或极显着性的影响。

  2.从杏鲍菇粗多糖中分离纯化得到两个均一多糖,PEPI1和PEPI2。总糖的含量分别为96.85%、98.22%,酸性糖、蛋白质含量几乎为零。PEPI1由Man、Glc和Gal组成,比例为2.2:1.1:3.2。PEPI2仅由Glc构成。IR显示,PEPI1为吡喃型聚糖。甲基化结果表明,PEPI1由7种糖残基组成,PEPI1以→1)-Manp为非还原末端,→1,3,6)-Manp和→1,2,6)-Galp为分支位点,主链核心部分主要由→1,6)-Galp和→1,3)-Glcp构成,并用NMR信息来进一步验证甲基化结果;PEPI2具有两种糖残基,通过LC-MS可知为1→6连接的葡萄二糖。

  3.当浓度在25~100μg/mL时,PEPI-1能够极显着地提高RAW264.7细胞吞噬中性红的能力;当浓度在25~100μg/mL时,能够极显着地促进RAW264.7 NO释放;当浓度在25~100μg/mL时,能够显着地促进RAW264.7释放IL-1、IL-6和TNF-α的释放;Western blot结果显示,PEPI-1明显地促进RAW264.7细胞p38,ERK和JNK蛋白的磷酸化,从而激活MAPK信号通路,发挥免疫调节作用。

  4.测定了三批碘代多糖PEPI1-FI的碘代率分别为0.66%、0.73%、0.68%,此方法简单可行。大鼠给药后1h时吸收入血率最低,随着时间的增加,入血率也随之增加,3h吸收入血率趋于稳定,达到6.27%。PEPI1-FI 3h时在各脏器中均有一定的分布,主要脏器中PEPI1-FI分布由高到低顺序是肝>肾>脾>肺>心。内脏碘代多糖的含量为总计3.81mg,脏器中的药物吸收率为2.00%

  结论:从杏鲍菇提取出来的PEPI-1可以提高RAW264.7细胞的吞噬能力,促进释放NO、IL-1、IL-6和TNF-α,免疫调节作用,促进RAW264.7细胞p38,ERK和JNK蛋白的磷酸化,从而激活MAPK信号通路,发挥免疫调节作用。建立的一种新的生物体内测定多糖的方法简单可行,对其它多糖药代动力学的研究打下了基础。

  关键词:真菌多糖;理化性质;化学结构;免疫调节;碘代多糖;ICP-MS;吸收与分布

  前言

  近年来,多糖具有良好的药理作用,很小的毒性。且随着一些疗效好的多糖类药物的使用,越来越多的科研工作者关注多糖类化合物。

  真菌多糖是真菌类的主要活性成分,其中常见的杏鲍菇味道鲜美,含有维生素、氨基酸、多糖等多种生物活性物质,具有很高的营养价值,被誉为“菇中之王”,药理作用研究广泛,但是目前为止,研究其免疫调节活性的相关报道不多。本课题从杏鲍菇多糖分离纯化出均一多糖,该多糖的组成糖、分子量范围、结构等信息均与已发表的文献不同;我们又研究了它刺激巨噬细胞免疫活性因子释放的影响及简单的机理;本课题还研究了该多糖在大鼠体内的分布,并建立了一种新的测定生物体内多糖的方法。多糖类物质在生物体内的检测一直是难点且已经成为药代动力学的瓶颈问题,最常用的生物体内多糖的检测方法有同位素标记、荧光标记法。放射性同位素标记法灵敏度非常高,但是同位素污染不易除去,影响结果的准确性,且要求的实验条件及环境极高,测试样品成本高,在现有的条件下,该方法的广泛使用有一定的困难。荧光标记法灵敏度低,且生物体内的物质对其干扰严重,以上两种方法均不是检测的理想方法。本课题建立了一种新的检测方法,它将多糖碘代后,再用ICP-MS的方法测定样品中的碘含量,将碘代多糖与ICP-MS检测技术相结合,有望建立一种新的简单、方便、可靠、适用范围广的糖复合物示踪和测定方法。

  本课题的研究为杏鲍菇的进一步开发利用打下基础,为多糖类化合物药代动力学的研究提供新的方法。

  文献综述

  第一章真菌多糖的研究进展

  真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体以及发酵液中经分离而得到的具有活性的代谢产物,是由十个以上的单糖连接而成的天然高分子聚合物,其以β-1,3和β-1,6糖苷键连接为主。目前,国内外研究学者已从300多种真菌中分离筛选出200多种具有生物活性的多糖物质[1]。

  常见的真菌多糖有香菇多糖、白玉菇多糖、灵芝多糖、银耳多糖、真姬菇多糖、金针菇多糖、口蘑多糖、云芝多糖等。在现代药理研究表明,真菌多糖具有抗溃疡、抗氧化,调节自由基水平、抗病毒、抗肿瘤、降血压血脂、抑菌消炎、保湿等生物学活性,国际上,被称为“生物反应调节剂(biological response modifier,BRM)”[2]。由于强大的生物活性和较低的毒副作用等优势,人们在分子生物学和医药学等领域对真菌多糖进行了更多的研究。近年来随着科学技术的不断发展,真菌多糖现已被开发研制成多种功能性药物和保健食品添加剂。

  1真菌多糖的来源

  真菌多糖种类繁多,其中真菌菌丝体的细胞壁和细胞质中的多糖占大多数[3],常见的有香菇多糖、猴头菌多糖、银耳多糖、灵芝多糖、冬虫夏草多糖、金针菇多糖、云芝多糖、灰树花多糖等。多糖是真菌中重要的活性成分之一,如果要利用较低的生产成本产出大量的目标产物以达到产业规模化等,就不能采取常用的从真菌的子实体中提取得到真菌多糖的方法,应采用较实用的液体深层发酵法[4]。根据其提取部位的不同分为两种,从发酵液中提取的多糖为胞外多糖,从菌丝中提取的多糖为胞内多糖。

  自1958年Brander报道了酵母胞壁多糖(Zymosan)具有抗肿瘤作用以来,真菌多糖引起了广大学者的研究兴趣[5]。从上世纪90年代以来,药用真菌多糖的研究取得很大的成果,Nandan[6]等提取出双环蘑菇多糖。Amaral[7]等从无柄灵芝子实体中分离出一种水溶性β-葡聚糖。Santos—Neves[8]等从佛罗里达侧耳子实体中提取出一种能够形成凝胶的β-葡聚糖。与此同时,研究发现,真菌中特定结构的多糖和蛋白质结合而成的多糖体具有抗肿瘤活性。由此,食药用真菌多糖的研究开发和应用越来越适应现代社会的需求。

  2真菌多糖的构效关系

  真菌多糖的构效关系是指真菌多糖的结构与活性之间的关系。多糖的结构对活性的影响很大,影响真菌多糖活性的结构因素主要有分子量、糖苷键类型、分支度、化学修饰、空间结构等方面。一般来说,真菌多糖主链上的β-1,3糖苷键是其活性的基础结构。Ho Young Jung[9]等的研究表明,在同等条件下,硫酸化的杏鲍菇多糖的抗肿瘤活性强于非硫酸化的杏鲍菇多糖;此外,还有研究表明,硫酸化的真菌多糖的抗HIV活性与其硫酸基团的分布无关,只与其分支度有关,当其DB大于1.3时,随着分支度的增大,其抗HIV活性明显提高[10]。

  3真菌多糖的生物学活性

  3.1免疫调节活性

  现代药理学研究表明,真菌多糖具有较强的免疫调节功能,其调节活性主要与真菌多糖的提取方法、分子量及化学结构有关[11]。其作用机制主要是通过调节机体先天免疫和获得性免疫系统来发挥作用,其具体机制主要有[12],(1)促进免疫细胞发育,如茶树菇多糖、黑灵芝多糖;(2)促进体液免疫,多糖能够促进机体内抗体的提高,激活B细胞从而促进体液免疫;(3)增强T细胞功能,发挥细胞免疫作用(4)活化巨噬细胞及提高红细胞功能,如冬虫夏草多糖、姬松茸多糖(5)影响淋巴细胞信号转导,如灵芝多糖、毛木耳多糖等。(6)调节网状内皮系统,如云芝多糖。其中,研究最早、作用最好的是香菇多糖。

  香菇(Lentinus edodes(Berk)Sing)隶属于侧耳属的担子菌,是我国最常见的一种药食同源的食用菌之一,其主要的活性成分是香菇多糖(Lentinan)。最早研究香菇多糖的是日本学者千原吴郎,他利用热水从香菇子实体中分离得到6中胞外多糖。紧接着,Sasaki利用动物实验首次发现其能显着抑制S180实体瘤的增殖。随着科技的不断发展,现代药理学研究表明,香菇多糖的免疫调节作用并不是直接攻击抗原,而是通过激活各免疫细胞,通过调节免疫系统而发挥作用[13]。目前香菇多糖已开发为药品广泛应用于临床中,如香菇多糖片、香菇多糖注射液、多糖王口服液等。

  3.2抗溃疡作用

  胃溃疡是现代社会的常见病、高发病。其发病机理复杂,各方说法不一。有研究表明长期紧张抑郁的情绪会引发胃溃疡,所以有学者把胃溃疡归结于“情志类疾病”的一种。随着当今社会人民生活水平的提高,生活压力也日趋增大,胃溃疡的发病率高发不下,且该病病程缠绵,复发率高,由胃溃疡引起的继发症胃出血、胃穿孔会给患者带来极大的痛苦。目前公认的胃溃疡机制是,积极因素与胃黏膜防御系统之间有一种微妙的平衡,一但失去这种平衡侵袭因素占有主导位置时就会导致胃溃疡的发生[14]。研究表明,真菌多糖在抗溃疡方面具有很强的效用,如,耙齿菌多糖[15],树舌多糖、猴头菇多糖等,其中,猴头菇在治疗胃溃疡方面作用显着,主要的作用机制为改善胃黏膜循环状况,减轻微血管损伤及降低血管通透性,增强胃黏膜屏障功能,修复损伤的胃黏膜,增加胃黏膜血流量进而增强胃黏膜的防御机能[16-19],其上市的药品为胃乐新颗粒。

  3.3降血糖、血脂作用

  虽然真菌多糖不能使生物体内的胰岛素含量增加,但是它可以提高某些酶的生物活性,使得人体血浆中的甘油三酯和胆固醇的水平下降,还能够增强血管弹性,抑制血栓形成,从而降低血糖、血脂发挥药效[20]。研究表明,香菇多糖通过提高胆固醇代谢而使血脂含量大大降低。宗灿华[21]等的研究表明,黑木耳多糖能够显着降低糖尿病小鼠模型的“三多一少”症状,并且能够提高糖耐量,从而发挥降血糖作用。段县平[22]等通过实验证明低剂量的姬松茸多糖能够显着地降低四氧嘧啶性糖尿病模型小鼠的血糖含量,其降糖机制为增强胰岛素的敏感性,保护胰岛β细胞。此外,能够降低血糖浓度的还有竹荪多糖、香菇多糖、冬虫夏草多糖等。

  3.4保肝作用

  药理实验表明,真菌多糖能够通过改善机体细胞的免疫功能,促进体内有害物质的加快排出,从而减轻肝损伤而发挥保肝作用。Ooi VEC[23]等通过实验证明灰树花多糖能够显着降低4-乙酰氨基酚肝损伤模型小鼠的SGOT和SGPT水平,进而发挥保肝作用。Chen J J[24]等也通过实验证明杏鲍菇多糖具有较强的保肝及降血脂作用。此外,具有保肝作用的真菌多糖还有虎乃菌多糖、金针菇多糖、槐耳多糖、茯苓多糖、竹黄多糖等。

  3.5抗辐射作用

  近年来,随着科学技术的不断进步,智能时代加速袭来,手机、电脑、微波炉等在生活中的广泛应用,随之而来的越来越多的辐射也在渐渐地侵蚀着人类的健康,因此,开发具有抗辐射的药物就显得尤为重要。陈月月[25]等通过建立GyX射线辐射损伤小时模型来检测松茸多糖PIM的抗辐射作用,结果显示,PIM能显着保护模型小鼠损伤的免疫机能,并能提高其抗氧化能力,说明PIM具有一定的抗辐射作用。目前报道具有抗辐射作用的真菌多糖还有银耳多糖、茯苓多糖、黑木耳多糖等。

  3.6其他作用

  真菌多糖除具有以上这些生物活性外,在其他很多方面也都有作用,如口蘑多糖、灵芝多糖、平菇多糖等具有抗氧化作用[26-27];雷丸多糖、黑木耳多糖等具有抗炎作用[28];银耳多糖、槐耳多糖、云芝多糖等具有抗肿瘤作用[29-31];安络小皮伞多糖具有活血、祛湿、止痛作用[32]。近年来,国内外对糖化学的研究引起越来越多的关注,今后真菌多糖将会在更多领域发挥其特有的优势。

  4真菌多糖的研究方法

  真菌多糖的研究方法与一般多糖的研究方法基本一致,包括提取、分离的方法及结构研究的方法。多糖的结构一直是多糖研究的难点,随着科学的进步及仪器设备的发展,多糖结构的研究也越来越深入。

  多糖作为生物大分子,同核酸和蛋白质一样,也具有三维的空间结构,即一级结构和空间结构[33]。但由于单糖种类较氨基酸多、连接位点也多,构型等因素,因此其空间结构也较蛋白质复杂。多糖的高级结构可分为二级、三级和四级结构。多糖的二级结构是指多糖主链间以氢键为主要次级键而形成的有规则构象,只涉及多糖分子中主链的构象,不涉及支链的空间排布。多糖的三级结构是指在多糖二级结构的基础上进一步盘曲、折叠而形成的具有一定形状和大小的空间构象。多糖的四级结构是指多聚链间以非共价键结合形成在空间相对定位的聚合体。多糖的生物活性与多糖的结构具有密切的关系,因此,解析多糖的结构对于其构效关系的研究是十分重要的。

  4.1多糖一级结构测定

  多糖的一级结构包括组成多糖的糖残基的组成、排列顺序、相邻糖基的连接方式、端基构型以及糖链有无支链、分支的位置与长度等。研究多糖一级结构的方法主要有水解法、高碘酸氧化以及Smith降解、酶解、光谱法、甲基化分析、组成糖分析、生物学分析方法等。目前,最常用的方法有组成糖分析、甲基化法及光谱法。

  4.1.1组成糖分析

  多糖的组成糖分析方法主要有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、高效毛细管电泳法(HPCE)等。

  TLC操作简单、快捷,但分辨率不高,故常用来作为多糖的定性分析。

  GC要求样品具有较好的挥发性和热稳性,由于多糖类物质挥发性较差,因此,对样品进行糖腈衍生化、三甲基硅醚衍生化、三氟乙酸酐衍生化以及糖醇乙酸酯衍生化等[34]方法衍生化,使其转化为易挥发、热稳定性成分再进行分析。

  HPLC具有灵敏度高、分离效果好、检测限低等优点而被广泛应用于多糖的定性及定量分析中,但由于多糖类物质在紫外区域没有吸收,因此,需要将样品进行衍生化处理,使其转变为具有发光基团的衍生物,从而被检测出来[35]。

  HPCE是最近几年应用起来的用于测定多糖组成糖的方法,具有高效率、高灵敏度、低耗能等优点。其基本原理是多糖水解后得到的单糖中的羟基与缓冲液形成带负电荷的络离子,利用带点粒子在高压电场中迁移率的不同来确定单糖的组成。梁加贝[36]等采用HPCE法对灵芝多糖进行组成分析,显示灵芝多糖由Glc、Gal、Xyl、Man组成。

  4.1.2分子量测定

  随着凝胶技术的发展,逐步发展起来的测量分子量的方法有高效凝胶渗透层析(GPC)法、凝胶渗透色谱激光光散射联用等方法,其中,因GPC法具有分辨率高、灵敏度好、重现性高等优点而被广泛应用。金鑫[37]等采用GPC法测定仙人掌多糖OP的重均分子量为1.73×105,具有较强的活性。

  4.1.3甲基化分析

  甲基化的方法是目前多糖结构测定中应用的最为广泛的方法,它可以提供多糖结构中糖残基的种类、比例、分支点等重要的结构信息。

  甲基化反应是在碱性条件下将多糖的游离羟基先经碘甲烷(CH3I)转化为甲氧基,然后水解成为各甲氧基单糖,经还原后得到阿尔迪醇,再乙酰化,最终得到部分甲基化部分乙酰化的糖醇产物,采用GC—MS的方法进行分析,判断糖苷键的连接位置及构型[38]。甲基化的方法主要有Purdie法、Hamorth法、Menzies法、Hakomori法等。

  4.1.4光谱法

  光谱法[39]主要有紫外全波长扫描(UV)、红外(IR)、质谱(MS)、核磁共振(NMR)。其中,NMR应用的最为广泛,利用1D/2D-NMR可以很清楚的分辨某些特征基团,如=O、OCH3、CH3等;确定多糖的糖苷键构型、糖残基种类以及糖残疾的连接位置、顺序等,但由于糖的信号往往比较集中,信号严重重叠,仅通过COSY谱无法进行氢谱的归属,需要结合DQF-COSY、TQF-COSY、TOCSY、NOESY等图谱结合起来分析。

  4.2多糖的高级结构分析

  目前,解析多糖高级结构的方法主要有核磁共振光谱法(NMR)、原子力显微镜观察法(AFM)、X-射线衍射法(X-R)、圆二色散(CD)、理论算法等[40]。由于各个糖配基之间连接方式的不同使得糖苷键两端的氢原子发生化学位移、电子耦合等,所以多糖的二级结构常用核磁共振光谱法测定,而更高级的构象则需要与理论算法相结合,通过一定的理论计算研究其结构。

  第二章杏鲍菇多糖的研究进展

  杏鲍菇(Pleurotus eryngii),也称为刺芹侧耳,学名Pleurotus eryngii(DC.Ex Fr.)Quel,隶属于担子菌亚门(Basidiomycotina),担子菌纲(Basidiomycetes),无隔担子菌亚纲(Homobasidiomycetidae),伞菌目(Agaricales),侧耳(口蘑)科(Pleurtaceae),侧耳属(Pleuroty)[39],是一种十分重要的药食同源的珍稀食用菌,目前在我国现在已经成为继金针菇之后的第二大工业化栽培品种[40]。杏鲍菇子实体颜色雪白,质地鲜嫩,又被称为“雪茸”、“干贝菇”、“平菇王”、“草原上的牛肝菌”等,因其同时具有杏仁香味和鲍鱼风味,因此又被称为杏仁鲍鱼菇[41]。

  杏鲍菇子实体和菌丝体的营养丰富,目前有报道称杏鲍菇中含有的营养成分主要有水分、灰分、还原性糖、蛋白质、脂肪、游离性氨基酸等[42]物质。其中蛋白质及氨基酸含量极高,可作为机体补充氨基酸的途径;总糖和脂肪含量相对较低,又具有较高的膳食纤维,特别适合于老年人食用。

  为了更好地开发和利用这种药食两用食用菌的食用价值,充分发挥其药用价值的潜在效用,研究杏鲍菇的营养成分和多糖就显得特别重要。本文对杏鲍菇多糖的提取、分离纯化及生物活性做一综述,旨在为杏鲍菇在医药和食品领域的运用提供理论依据。

  1杏鲍菇多糖的提取

  目前,多糖的提取方法包括溶剂提取法、酶提取法、超声提取法、微波辅助提取法等。其中最为常用的方法是溶剂提取法,包括热水浸提、酸提取、碱提取等。杏鲍菇多糖的提取一般采用热水、酸、碱、乙醇等作为介质进行提取,具有操作简单、条件温和、对设备要求低等优点。

  1.1水提醇沉法

  水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。利用多糖易溶于水、不溶于乙醇的性质,使多糖从提取液中沉淀出来。应用此方法提取的多糖得率较高。张彩莹[43]等采用均匀试验的方法,研究温度、时间、料液比对提取杏鲍菇子实体多糖的影响,结果表明,在料水比为1:50、100℃下提取2h,此时多糖得率最高,为4.35%。郭守军[44]等采用正交试验优化提取杏鲍菇子实体多糖的条件,研究结果表明:提取的最佳条件为:料水比为1:20、提取温度为90℃、提取时间为4h,并且在醇析浓度为90%时多糖得率最高。

  水提醇沉法为传统的多糖提取方法,具有操作简单、条件温和、对设备要求低等优点,但同时也存在着提取时间长、收率低等缺点。

  1.2超声提取法

  超声提取法是利用超声波在液体中产生的空化效应而使植物细胞壁及整个生物体瞬间破裂,从而加速有效成分溶出的一种提取方法[45]。其优点是保护其有效成分的结构不受破坏、提取时间短、提取效率高。

  高娟娟[46]等采用单因素、正交试验的方法优化超声波提取杏鲍菇多糖的条件,结果表明:影响多糖得率的主要提取因素顺序为:超声波功率>浸提时间>处理时间,提取最佳条件为,在超声波功率为600W时处理4min后90℃浸提30min,此时,多糖得率为20%,可见,经超声波处理后可以显着缩短提取时间,提高其多糖产率。

  1.3碱提取法

  杏鲍菇多糖可分为水溶性中性多糖和碱溶性酸性多糖,目前有许多关于水溶性中性多糖的报道,而对碱溶性酸性多糖的报道则很少。梁涛[47]等采用稀碱溶液提取杏鲍菇多糖,相对分子质量为450kDa,为浅黄色海绵状固体,易溶于水,不溶于乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂。

  应用稀碱溶液进行浸提,有利于提取出一些新颖的多糖组分,同时也会显着提高多糖得率,为杏鲍菇功能性食品和药品的开发提供了新的思路。

  1.4酶提取法

  杜敏华[48]等以杏鲍菇子实体为试验材料,先用适量的木瓜蛋白酶进行酶解,提取杏鲍菇中水溶性多糖及碱溶性多糖,结果表明:加入木瓜蛋白酶后虽然不能影响碱溶性多糖的收率及多糖含量,但却能明显提高水溶性多糖的产率。

  2杏鲍菇多糖的结构

  多糖的生物活性与结构具有密切的关系,因此,分析多糖的结构是十分重要的。研究多糖结构的方法主要有物理方法、甲基化分析、NMR、高碘酸氧化以及Smith降解、酶解法等。研究多糖的结构主要包括研究多糖的分支度、糖苷键、糖残基种类等,因多糖大分子结构复杂,给研究工作带来许多困难。目前研究杏鲍菇多糖结构报道最多的方法是采用甲基化分析的方法来进行分析。

  Zhang A Q[49]等从杏鲍菇子实体中提取出一种水溶性杂多糖,并采用DEAE Sepharose柱层析对其进行纯化得到PEPS1,糖醇乙酰酯GC分析得知此多糖由甘露糖和半乳糖组成,甲基化及NMR等方法分析得知,具有两个基本骨架,其一为α-D-(1→6)-Galactopyranan骨架,在2,6-di-O-substituded-D-Galactosyl单元的O-2位上具有β-D-Mannosyl单元;第二个骨架为α-(1→6)-3-O-Me-D-Galactosyl单元,其具有α-3-O-Me-D-Galactosyl,2,3,6-α-D-Galactopyranan单元和4-β-D-Mannopyranan残基。Yang Z Y[50]等通过采用DEAE纤维素柱对提取得到的杏鲍菇子实体多糖进行纯化得到PEPw,PMP衍生化HPLC法分析其单糖组成及应用甲基化方法分析其结构,结果表明:杏鲍菇多糖由阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖组成,其摩尔比为1.2:2.3:6.2,多糖骨架主要由1,6-linked-Galp、1,2,6-linked-Galp和1,4-linked-Manp残基组成,其中,1,4-linked-Manp残基上连接的Araf末端连接在1,2,6-linked-Galp的O-2位上。张化朋[51]等采用热水浸提法提取得到杏鲍菇子实体多糖,并通过DEAE-52阴离子交换柱和Sepharose G-150对其纯化得到均一多糖WPP2,糖腈乙酰酯衍生化GC分析和甲基化分析得知:其主要由葡萄糖组成,每个重复单元存在两个支链,→1,2,3)-β-D-Manp和→1,2,6)-β-D-Manp位于支链位点,支链由→1,6)-β-D-Glcp和→1,6)-β-D-Galp构成,非还原末端为→1)-β-D-Glcp,主链由→1,3)-β-D-Glcp,→1,6)-β-D-Glcp,→1,3)-β-D-Manp糖残基组成。

  3杏鲍菇多糖的生理作用

  对杏鲍菇的研究已有多年的历史,试验证明杏鲍菇的主要活性物质是多糖,对其进行了研究,其多糖的生理作用主要有抗肿瘤、抗病毒、抑菌、抗衰老及抗氧化、降血脂作用。

  3.1抗肿瘤活性

  目前,许多抗肿瘤药物在杀死肿瘤细胞的同时都会对机体内正常细胞产生细胞毒性,包括抑制造血功能、产生免疫毒性等。从天然产物中提取得到的多糖是一种有效的、相对无毒的抗肿瘤物质,能够直接或间接杀死肿瘤细胞而发挥其免疫调节作用。张化朋[51]等分离纯化得到的WPP2具有一定的抗肿瘤活性,当质量浓度为400μg/mL时,24h对人白血病K562细胞的抑制率为45%,48h抑制率为55%,72h的抑制率达到65%。Yang Z Y[50]等也通过大鼠实验证明杏鲍菇多糖具有较强的抗肿瘤活性,其作用机制可能是参与肿瘤大鼠的免疫应答的过程。

  3.2抗病毒活性

  许多研究表明多糖对多种病毒有抑制作用,如艾滋病病毒(HIV—1)、单纯疱疹病毒(HSV—1、HSV—2)、流感病毒、逆转录病毒等。迟桂荣[52]等从杏鲍菇子实体多糖经分离纯化得到两种多糖A1和A2,并对其进行体外病毒试验。结果表明:杏鲍菇多糖对HSV—1的抑制作用明显,在同等浓度下,抑制作用与一线抗病毒药物阿昔洛韦相当。

  3.3抗衰老及抗氧化作用

  随着中国老年化进程的加快,衰老已经成为日益严重的医疗和社会问题,近年来,人们越来越关注衰老和抗氧化的问题。氧化衰老作用主要是由于机体内氧自由基的增加,而体内代谢和外界因素作用都会产生自由基。目前,已经发现很多真菌多糖能够清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化活性,从而保护生物膜和延缓衰老,对杏鲍菇多糖的抗氧化作用的研究有很多。

  杨立红[53]等对杏鲍菇子实体多糖的抗氧化作用进行研究,结果表明,杏鲍菇多糖对力竭小鼠的骨骼肌和肝脏具有显着的抗氧化、抗损伤疗效。姚冰薇[54]等测试杏鲍菇菌丝体多糖对D—半乳糖衰老小鼠模型的影响。结果表明:杏鲍菇多糖能够减轻脑和肾质量的增龄性下降、延缓脑、肾衰老的过程。郑素玲[55]等也通过实验证明杏鲍菇子实体多糖具有明显的延缓D—半乳糖致衰老小鼠模型的疲劳作用,并且具有较强的延缓胸腺衰老的作用。张俊会[56]等,对杏鲍菇多糖采用亚铁离子和Fenton诱导的TBA法、碘量法、体外抗脂质过氧化进行抗氧化研究。结果表明:杏鲍菇对于离体肝脏组织的脂质过氧化、亚油酸和菜油氧化具有抑制作用。马静[57]等提取杏鲍菇子实体中多糖,并进行体外清除羟自由基实验,结果表明,杏鲍菇多糖具有一定的体外抗氧化活性,质量浓度为0.4mg/mL的杏鲍菇多糖清除羟自由基的清除率可达35.76%,同等浓度下略低于Vc的清除率。此外,Liu X N[58]等也通过试验证明杏鲍菇多糖具有很强的抗氧化功能。

  3.4保湿活性

  在近些年的研究中发现,多糖是一种天然的、无刺激的保湿剂。张志军[59]等对超声波提取的杏鲍菇粗多糖进行保湿性能的研究,并与甘油进行对比,结果表明:1%的杏鲍菇粗多糖的保湿性能优于5%的甘油,证明其保湿性能良好。如果将杏鲍菇多糖应用到化妆品行业中去,将会大大增加其附加值,有利于杏鲍菇产品的进一步开发应用,具有重要的学术价值和应用价值。

  3.5抑菌作用

  张丽[60]等采用传统的水提醇沉法提取杏鲍菇菌丝体中的多糖,采用滤纸片法对供试菌抑菌圈的大小进行测定,结果显示:杏鲍菇多糖对白色链球菌和产气杆菌具有较强的抑制作用,而对其他细菌及霉菌无抑制作用。

  3.6降血脂、胆固醇作用

  杏鲍菇多糖降血脂、胆固醇作用的机制可能是由于其含有羟基、羧基等吸脂性基团的作用,从而阻止了对脂类的吸收,同时又能与胆酸结合,促进胆酸的排出,阻断肝肠循环从而降低血脂。Chen J J[61]等以杏鲍菇子实体为试验材料,采用热水浸提其多糖,并通过动物实验进行降血脂、胆固醇作用的研究。结果表明:杏鲍菇多糖能够显着降低血清胆固醇、油脂、甘油三酯和低密度脂蛋白的含量,而且,还能显着提高高密度脂蛋白的含量,证明其降血脂、胆固醇作用明显。并且,Alam N H[62]等也通过实验证明了杏鲍菇多糖具有显着的降低胆固醇的功效。

  此外,还有研究表明:杏鲍菇多糖具有免疫增强[63]、滋润肠道、抑制脂肪积累[64]、抗炎、抗溃疡和美容等生物活性。大部分人均可食用杏鲍菇,目前,杏鲍菇虽已开发饮料、罐头、酸奶、杏鲍菇脯等产品,但其食品种类比较单一,还有待于进一步的研究与开发。

  第三章多糖在生物体内检测方法的研究进展

  随着科学的不断进步和科学仪器的发展,对多糖类物质的研究已经取得了很大的进步,包括多糖的提取分离手段、多糖的结构鉴定、高级结构的表征,但是,多糖类化合物本身没有吸收基团和发色团,分子量大,结构复杂,极性大难以分离,且生物样品中浓度低,测定受到样品中生物源成分干扰。因此,多糖类物质在生物体内的检测一直是多糖类物质研究的难点,以至于极大的制约了多糖类物质药代动力学方面的研究,与其它小分子物质相比,多糖类的药代动力学研究比较滞后[65]。寻找和建立简单、方便的示踪和测定方法,是在糖复合物药代动力学,包括生物利用度研究中的关键技术,也是糖复合物研究中亟待解决的关键科学问题之一。

  目前,多糖在血液等生物样品中的检测的方法主要有:色谱法[66]、放射性同位素标记法[67]、分光光度法、荧光光度法[68]和生物测定方法[69]。

  1放射性同位素标记法

  用放射性同位素标记多糖后,可以通过X线胶片或储存磷光屏感光在生物样品中的放射性,从而测定生物体内多糖的吸收及分布,通过产生的放射性强弱还可以可间接表征样品浓度的高低。常用的放射性同位素有3H、2H、125I、124I和14C等。通过腹腔注射小鼠经过3H标记后的甘露聚糖,测定了该样品在小鼠尿液、血液、组织、和粪便中含量的变化以及多糖在各脏器中的分布[70]。2H标记的壳聚糖棒经手术植入大鼠胫骨中,通过局部组织的放射性动态变化可测算壳多糖的吸收情况[71]。此外,放射性标记法还用于分析测定链球菌肽聚糖经腹腔注射后在大鼠体内的降解和保留[72],以3H和125I标记分别标记银耳多糖,测定了口服给药后的血药浓度和器官分布及静脉给药后的血药浓度即器官分布。且得出结论,3H标记多糖分子量变化小,标记比较稳定,更适宜测定血药浓度,而125I标记易测定标记物在组织和器官中的分布[73]。特别地,Lendvai等[74]采用了同位素标记法研究了新型隐球菌多糖在小鼠体内分布以及相关的免疫机制。

  然而采用此种方法考察器官分布时,还应该考虑降解的影响,可以结合其它的方法结合矫正。综上,射性同位素标记法灵敏度非常高,但是同位素污染不易除去,影响结果的准确性,但是该方法对实验条件要求苛刻和成本高、易造成放射性污染,在现有的条件下,该方法的广泛使用有一定的困难。

  2荧光光度法

  多糖本身不含有易被检测的基团,通常与荧光物质结合后具有激发和发射波长的特点,通过荧光光度法来进行生物样品的检测。唐惠玲等[75]考察了对草多糖与酪胺、FITC荧光标记时的最佳反应条件,包括与酪胺反应中的时间、温度、pH和酪胺的用量进行了考察。结果,反应时间越长,温度在60℃,p H为8时反应率最高,为其他多糖的荧光标记提供借鉴。康迪等[76]测定大鼠血浆中海胆黄多糖的研究中也是采用FITC进行荧光标记的方法来测定,并用此方法测定了海胆黄多糖在体内的半衰期、消除速率常数、最大血药浓度、药时曲线等药代学的常见参数。荧光标记物Polymer-H能特异结合硫化多糖,且复合物的荧光强度与多糖浓度存在显着的量效关系[77]。

  3分光光度法

  通过静电作用,探针天青A可以与大鼠血浆中的茯苓硫酸酯化多糖结合,产生变色效应,且吸收度在一定的浓度范围内呈现负线性相关[78]。相似的,基于硫化多糖与1,9-二甲基亚甲蓝结合的比色法也能有效测定多糖在大鼠尿液和血液中的浓度[79]。郭咸希[80]等建立了采用分光光度法测定羧甲基茯苓多糖在血浆中的含量的方法并进行了方法学考察,实验还考察了血浆的处理方法等对实验结果有影响的重要因素。分光光度法的灵敏度低,在实际操作中误差较大。

  4 HPLC法

  为了提高HPLC检测多糖的灵敏度,常采用衍生化试剂标记使其生成具有荧光性的复合物,典型的荧光试剂如盐酸胍(Gu HCl)、2-氰基乙酰胺和异硫氰酸荧光(FITC)。硫酸多糖916与盐酸胍生成衍生物,通过HPLC法及荧光检测器检测动物血清中该衍生物的含量。并以此方法测定了药代学的各项参数。因为生物样品中的干扰较大且多糖本身不易分离,所以对此方法的色谱条件包括色谱柱的要求极高,不易操作。

  除了上述方法外,还有一些其它的检测方法,如生物测定法等。

  第四章本课题的研究目的及意义

  1研究目的意义

  真菌多糖活性好,毒性小,越来越吸引多糖研究人员的关注。如香菇多糖、银耳多糖都是真菌多糖被成功开发的典范。在本课题中我们选择了五种真菌多糖,比较了它们粗多糖的免疫调节活性,并选择了其中活性最好的杏鲍菇作为研究对象。杏鲍菇,有“菌中之王”的美誉,其营养价值很高,现代药理学研究表明杏鲍菇具有抗肿瘤、抗病毒、抑菌、抗衰老及抗氧化、降血脂等作用。但是目前为止,研究其免疫调节活性的相关报道不多。本课题从杏鲍菇多糖分离纯化出均一多糖,该多糖的组成糖、分子量范围、结构等信息均与已发表的文献不同;我们又研究了它刺激巨噬细胞免疫活性因子释放的影响及简单的机理;本课题还研究了该多糖在大鼠体内的分布,并建立了一种新的测定生物体内多糖的方法。多糖类物质在生物体内的检测一直是难点且已经成为药代动力学的瓶颈问题,最常用的生物体内多糖的检测方法有同位素标记、荧光标记法。放射性同位素标记法灵敏度非常高,但是同位素污染不易除去,影响结果的准确性,且同位素标记要求的实验条件及环境极高,测试样品成本高,在现有的条件下,该方法的广泛使用有一定的困难。荧光标记法灵敏度低,且生物体内的物质对其干扰严重,以上两种方法均不是检测的理想方法。本课题建立了一种新的检测方法,它将多糖碘代后,再用ICP-MS的方法测定样品中的碘含量,将碘代多糖与ICP-MS检测技术相结合,有望建立一种新的简单、方便、可靠、适用范围广的糖复合物示踪和测定方法。

  2研究内容

  本课题比较了5种食用真菌多糖的免疫调节活性的影响及它们的理化性质;从中选择了一种活性最好的杏鲍菇粗多糖进行分离纯化,纯化出均一多糖,通过甲基化、核磁等手段对它们结构进行表征;并考察了该多糖对RAW264.7细胞释放相关免疫调节因子的影响,及对MAPK通路的影响;建立了一种新的生物样品中检测多糖的方法,并考察样品在大鼠体内的分布情况。

  3展望

  目前,对于杏鲍菇结构及活性的研究为杏鲍菇的进一步开发利用打下基础,下一步我们将在此研究的基础上,进行构效关系的研究;建立的一种新的生物体内检测多糖含量的方法,为其它多糖的药店研究提供新的方法,我们下一步将对此方法进一步完善,并深入多糖的药代动力学研究。

  实验研究

  第一章白玉菇等五种真菌粗多糖免疫调节活性的比较

  免疫调节是多糖的主要生物活性之一。据报道,多糖类物质可以增强免疫细胞的活性,能够激活巨噬细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞细胞等,通过促进相关免疫细胞因子的分泌及多种其它相关途径,从而提高机体的免疫力。淋巴细胞是免疫系统中最重要的细胞,在免疫应答中起关键作用。淋巴细胞又包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞细胞等。各类淋巴细胞及其亚群在免疫应答中相互协作和制约,共同完成对有害物质和异己物质的识别、应答和清除,以维持机体内环境的稳定。

  本章采用小鼠脾脏淋巴细胞增殖以及巨噬细胞增殖吞噬作用等体外细胞试验,对五种真菌粗多糖的体外免疫调节活性进行评价和比较,并筛选出活性最佳的粗多糖,进行下一步分离纯化、结构等研究。

  

  1试剂与仪器

  杏鲍菇,购自吉林农业大学菌菜基地(菌种编号:2601),真姬菇、平菇、口蘑、白玉菇均购自超市,以上五种真菌均由高其品教授鉴定。葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖等9种单糖标品、牛血清白蛋白、间羟基联苯标准品均购自美国Sigma公司;Grace Apollo C18色谱柱(5μm,250×4.6 mm),美国奥泰公司;无水乙醇、硫酸、苯酚、四硼酸钠、酒石酸钾钠、钨酸钠等均为分析纯,北京化工厂;脂多糖(LPS)、中性红(Neutral red),美国Sigma公司;胎牛血清、RPMI 1640培养基、10000U/mL青霉素-10000μg/mL链霉素双抗,美国Gibco公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)、胰蛋白酶、EDTA,美国Amresco;二甲基亚砜(DMSO),分析纯。

  1.2仪器

  仪器及型号生产厂家

  754紫外可见分光光度计上海菁华科技仪器有限公司TDL-5-A型离心机上海安亭科学仪器厂电热恒温水浴锅北京市永光明医疗仪器有限公司立式压力蒸汽灭菌锅上海博迅实业有限公司医疗设备厂ZW-A型微量振荡器江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司倒置光学显微镜上海蔡康光学仪器有限公司MK-3酶标仪美国Thermo公司MCO-15AC CO2恒温培养箱日本SANYO公司SW-CJ-2D双人净化工作台苏州净化设备有限公司96孔/6孔细胞培养板美国Costar公司2实验方法

  2.1白玉菇等五种真菌粗多糖的提取

  采用多糖传统的提取方法--水提醇沉法。白玉菇等五种食用菌,切成小块,室温风干,粉碎,备用。以白玉菇粗多糖的提取为例,称取1Kg,加入10倍量水煎煮,煎煮3次,每次2h,合并水煎液,浓缩至一定体积,冷却至室温,缓缓加入无水乙醇,不断搅拌,至乙醇浓度为80%,静止过夜。离心,沉淀反复清洗3次,挥干乙醇,加水溶解。采用Sevage法除去蛋白,即将提取液与Sevage试剂(氯仿:正丁醇=5:1(V/V))5:1混合,振荡,离心除去沉淀,反复多次,上清回收,冻干,即得白玉菇粗多糖(PNP),计算收率。其它四种食用菌均按此方法处理,分别得杏鲍菇粗多糖(PEP),口蘑粗多糖(TLP),真姬菇粗多糖(HMP),平菇粗多糖(POP)。

  白玉菇子实体

  剪碎、风干

  加10倍量水煎煮3h

  提取3次,离心(5000r/min,3min)

  残渣提取液

  浓缩至小体积,冷却,

  缓慢加入无水乙醇至醇浓度为80%,

  静置过夜,离心

  上清液沉淀

  回收乙醇挥至无醇味

  加水溶解、冻干

  上清液白玉菇粗多糖(PNP)

  图1-1白玉菇粗多糖的提取流程图

  Fig1-1 Flow chart of extraction of crude polysaccharide of Pleurotus Nebrodensis

  2.2五种真菌粗多糖理化性质、组成糖的测定

  2.2.1总糖含量的测定:苯酚—硫酸法[81]

  2.2.1.1标准溶液的制备

  精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品10.0 mg,置100 mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀得到浓度为100.0μg/mL的葡萄糖标准溶液。

  2.2.1.2标准曲线的绘制

  精密吸取标准品溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0 mL,分别置试管中,分别加水至1.0 mL,再各加入5%苯酚水溶液1.0 mL,摇匀,快速加入浓硫酸5.0 mL,摇匀,放至室温。以标准品溶液0mL管为空白,在490 nm波长处测定吸光度,以葡萄糖μg为横坐标x,以对应的吸收度A为纵坐标y绘制标准曲线,计算回归方程及回归系数。

  2.2.1.3样品的测定

  精密称取真菌粗多糖的干燥粉末各50.0mg,置50mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,得浓度为1.0mg/mL的供试品溶液,分别精密吸取0.4mL,0.8mL,置试管中,其吸光度在标准曲线的范围内,加水至1 mL,照2.2.1.2标准曲线的制作项下自“再加入5%苯酚溶液1.0 mL”起,依法进行以下操作,在490 nm处测定其吸光度,根据标准曲线计算各样品中性糖的含量。

  2.2.2酸性糖含量的测定:间羟基联苯法[81]

  2.2.2.1标准溶液的制备

  精密称取干燥至恒重的葡萄糖醛酸标准品25.0 mg,置500 mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,得浓度为50μg/mL的葡萄糖醛酸标准溶液。

  2.2.2.2标准曲线的绘制

  精密吸取标准品溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL,加水补充至0.4 mL,混匀,在冰水浴中加入2.4 mL 0.0125 mol/L四硼酸钠-硫酸溶液,混匀,沸水浴中加热5 min,取出迅速冷却至室温,加0.15%问羟基联苯40µl,立即混匀。以标准品0mL管为空白,在525nm波长处20min内测定吸收度,以葡萄糖醛酸μg为横坐标x,以其对应的吸光度(A)为纵坐标y绘制标准曲线,计算回归方程及回归系数。

  2.2.2.3样品的测定

  精密称取真菌粗多糖粉末各100 mg,加蒸馏水溶解并定容至100mL量瓶中,摇匀即得1mg/mL供试品溶液。精密吸取供试品溶液0.4mL,照2.2.2.2标准曲线的制作项下自“在冰水浴中加入2.4mL 0.0125mol/L四硼酸钠-硫酸溶液”起,依法进行以下操作,在525nm波长处测定吸光度,根据标准曲线计算样品溶液中的酸性糖含量。

  2.2.3蛋白含量测定【82】(Lowry法)

  2.2.3.1标准曲线的制作

  精密称取干燥至恒重的牛血清白蛋白对照品25.0mg,加蒸馏水溶解并定容至100mL量瓶中,摇匀即得0.25mg/mL牛血清白蛋白溶液。精密吸取标准品溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL,加水至1mL,加5mL福林-酚试剂甲,混匀后在室温放10分钟,再加入0.5mL试剂乙,立即混匀,室温放置30分钟,以试剂管为空白,然后在660nm处测定吸光度,以牛血清白蛋白mg数为横坐标,对应吸光值为纵坐标,绘制标准曲线,并计算回归方程及回归系数。

  2.2.3.2样品的测定

  精密称取真菌粗多糖样品100mg,加蒸馏水溶解并定容至100mL量瓶中,摇匀即得1mg/mL供试品溶液。精密吸取供试品溶液0.5mL,加水至1mL,照2.2.3(1)标准曲线的制作项下自“加5mL福林-酚试剂甲”起,依法进行以下操作,在660nm波长处测定吸收度,计算样品溶液中的蛋白质含量。

  其中,试剂甲、试剂乙为本实验室配制。配制方法如下:

  试剂甲(A):10g碳酸钠、2g氢氧化钠和0.25g酒石酸钾钠加蒸馏水配成500mL溶液。

  试剂甲(B):0.5g硫酸铜溶解于100mL蒸馏水中,每次用时将50份(A)与1份(B)混合即为试剂甲。

  试剂乙:在1.5L容积的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠、25g钼酸钠及700mL蒸馏水,再加入50mL 85%磷酸和100mL浓HCl充分混合,接上冷凝回流管以小火回流10h。回流结束后,加入150g硫酸锂、50mL蒸馏水以及数滴液体溴,开口继续沸腾15min以驱除过量的溴,冷却后溶液呈黄色。稀释至1L,过滤,滤液于棕色瓶中保存,用前稀释一倍即为试剂乙。

  2.2.4组成糖分析:PMP柱前衍生化HPLC法[82]

  2.2.4.1单糖标准品衍生物的制备

  精密称取葡萄糖(Glc)、葡萄糖醛酸(GlcA)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、半乳糖醛酸(GalA)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、岩藻糖(Fuc)对照品各2mg,置于大试管中,各加入2mL水溶解。向其加入0.3mol/L NaOH溶液1mL,再向其中加入1.2mL 0.5mol/L PMP甲醇溶液,混匀,至70℃水浴反应30min,取出,冷却至室温。分别向其加入1mL 0.3mol/L HCl溶液进行中和,加入5mL氯仿进行萃取,重复3次,取上层水相。吸取9种单糖衍生物各100μL,混匀,过0.45μm滤膜,备用。

  2.2.4.2供试品衍生物的制备

  精密称取供试品5mg于具塞试管中,加入2mol/L三氟乙酸溶液,密封,至100℃烘箱中进行水解,水解8h。取出后,吹干,加入1mL甲醇溶液以吹尽多余的三氟乙酸。水解产物加2mL水溶解,按2.4.1项下自“向其加入0.3mol/L NaOH溶液1mL”起,依法操作,得到供试品PMP衍生物,过0.45μm滤膜,备用。

  2.2.4.3色谱条件

  Agilent 1200高效液相色谱仪;Grace Apollo C18色谱柱(5μm,250×4.6 mm);柱温:40℃;检测波长:250 nm;流速:0.8 mL/min;流动相A为0.025 mol/L磷酸盐缓冲溶液(KH2PO4-NaOH,pH6.8)—乙腈(85:15),流动相B为0.025 mol/L磷酸盐缓冲溶液(KH2PO4-NaOH,pH6.8)—乙腈(60:40),梯度洗脱比例见表1-1。

  表1-1梯度洗脱比例

  Table1-1 Gradient elution ratio

  Time(min)mobile phase A(%)mobile phase B(%)0→10100→920→810→3092→708→3030→40703040→5070→10030→02.3真菌粗多糖免疫活性的比较

  2.3.1 MTT法测定小鼠脾淋巴细胞增殖

  2.3.1.1小鼠脾脏淋巴细胞悬液的制备

  将小鼠脱颈椎处死,在无菌环境下取出脾脏,置于具有无血清RPMI 1640培养液(含青霉素100U/mL和链霉素100µg/mL)的平皿中,洗净血污。用注射器针芯轻轻研磨脾脏,过200目筛网,离心,收集细胞。用红细胞裂解液裂解红细胞,离心。用磷酸盐缓冲液(PBS)将获得的淋巴细胞洗涤2次,将细胞重悬于适量RPMI 1640培养液中,调整细胞数为5×106个/mL,0.4%台盼蓝染色判断活细胞百分率>95%。

  2.3.1.2 MTT检测脾淋巴细胞增殖活力

  实验分为3组,空白对照组、ConA对照组及不同浓度给药组,将制备好的细胞悬液接种到96孔板上,每孔100µL,空白对照组每孔再加入100µL培养基;ConA对照组再加入100µL 5µg/mL ConA溶液;不同浓度给药组加入不同浓度的多糖溶液(浓度分别10µg/mL、100µg/mL、1000µg/mL),置于培养箱中培养48h,向其加入10µL MTT溶液,继续培养4h,倾去液体,每孔加入150µL DMSO,振荡均匀后置于酶标仪上于490nm处测定吸光度A值。

  2.3.2对NK细胞杀伤活性的影响

  靶细胞悬液的制备:取Yac-1作为NK细胞的靶细胞。将Yac-1细胞提前24h进行传代培养,离心,弃去上清的死细胞,向沉淀中加入2mL RPMI 1640培养基,吹匀,1500rpm离心5min,弃去上清,再向其加入培养基调整细胞浓度为5×105/mL,备用。

  实验分为4组,分别为空白组、给药组、靶细胞组和效应细胞组,每组5个复孔。除靶细胞组外,其余各组加入上述制备好的淋巴细胞悬液置于96孔板中,每孔100µL。空白组再加入100µL培养基;给药组加入不同浓度的多糖溶液(浓度分别10µg/mL、100µg/mL、1000µg/mL);效应细胞组加入100µL培养基,置于培养箱中培养24h后,离心,弃去上清,除空白组和效应细胞组外,其他各组分别加入已传代培养24h的Yac-1细胞悬液100µL(效靶比为20:1),1000rpm离心5min,置于培养箱中继续培养2h后,每孔分别加入10µL MTT溶液,继续培养4h,倾去液体,每孔加入150µL DMSO,振荡均匀后置于酶标仪上于490nm处测定吸光度A值,根据A值计算杀伤指数。

  2.3.3中性红法测定RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力

  2.3.3.1 MTT法测定RAW264.7巨噬细胞增殖

  取对数生长期的巨噬细胞RAW264.7,胰酶消化后,细胞计数,调整细胞浓度为1×105个/mL。用移液枪吹打均匀后接种于96孔板,每孔100µL,于5%CO2、37℃的培养箱进行培养,培养24h后,弃去培养上清液,用PBS洗去未贴壁细胞,分别加入100µL RPMI 1640培养液和不同浓度样品(浓度分别10µg/mL、100µg/mL、1000µg/mL),10µg/mL LPS作为阳性对照。每组设5个复孔,置于5%CO2、37℃的培养箱中培养24h。弃去培养液,换成100µL无血清RPMI 1640培养液,每孔加入10µL MTT溶液,继续培养4h后,弃去上清液,每孔加入150µL DMSO,于振荡仪振荡10min后,用酶标仪在490nm下测各孔A值。

  2.3.4中性红法测定RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力

  细胞浓度和加药方式同2.3.2。细胞培养24h后,每孔加入无菌0.075%中性红生理盐水溶液100µL,继续培养4h,吸弃孔内培养液,用PBS洗3遍,每孔加200µL细胞裂解液(冰醋酸:无水乙醇=1:1,v/v),静置过夜,用酶标仪在540nm下测各孔A值,根据A值计算吞噬指数(pinocytotic index,PI)。

  吞噬指数=A样品/A空白

  结果与讨论

  1.真菌粗多糖的提取

  采用多糖最常用的提取方法-水提醇沉法提取五种真菌粗多糖,除蛋白采用常用的Sevage法,分别得到粗多糖的提取部位,计算收率,分别得杏鲍菇粗多糖(PEP;收率:20.5%),口蘑粗多糖(TLP;收率:21.2%),真姬菇粗多糖(HMP;收率:25.3%),平菇粗多糖(POP;收率:19.6%),白玉菇粗多糖(PNP;收率:22.6%)。

  2.真菌粗多糖理化性质的测定

  2.1中性糖含量测定结果

  表1-2葡萄糖标准溶液吸收值

  Table 1-2 The absorption vlue of glucose standard solution

  content/mg0.000.020.040.060.080.10Absorption value(%)0.0000.1920.3780.5720.7690.944根据以上数据,以葡萄糖含量作为横坐标,以相应的吸光值作为纵坐标,绘制标准曲线(见图1-2),得到回归方程为y=9.4929x+0.0012,相关系数R2=0.9998,由此可知,葡萄糖在0.00-0.10mg范围内,线性关系良好。根据此标准曲线计算五种真菌粗多糖的中性糖含量,结果见表1-3。

  图1-2葡萄糖标准曲线

  Fig.1-2 The standard curve of glucose

  表1-3真菌粗多糖中性糖含量

  Table 2-3 The content of neutral sugar of crude polysaccharides in fungi

  crude polysaccharidesTLPPEPPOPHMPPNPcontent(%)49.348.151.256.753.9

  2.2酸性糖含量测定结果

  表1-4酸性糖标准溶液吸收值

  Table 1-4 The absorption vlue of glucose acid standard solution

  content/mg0.0000.0050.0100.0150.02Absorption value(%)0.0000.1500.2960.4610.628根据以上数据,以葡萄糖醛酸含量作为横坐标,以相应的吸光值作为纵坐标,绘制标准曲线(见图1-3),得到回归方程为y=31.34x-0.0064,相关系数R2=0.9991,由此可知,葡萄糖醛酸在0.000~0.020mg范围内,线性关系良好。根据此标准曲线计算五种真菌粗多糖的酸性糖含量,见表1-5,结果酸性糖的含量较低,粗多糖主要由中性糖组成。

  图1-3葡萄糖醛酸标准曲线

  Fig.1-3 The standard curve of glucose acid

  表1-5真菌粗多糖的酸性糖含量

  Table1-5 The content of acid sugar of crude polysaccharides in fungi

  crude polysaccharidesTLPPEPPOPHMPPNPcontent(%)1.590.841.682.272.33

  2.3蛋白含量测定结果

  表1-6牛血清白蛋白标准溶液吸收值

  Table 1-6 The absorption vlue of BSA standard solution

  content/mg0.000.050.100.150.200.25Absorption value(%)0.0000.0210.0470.0710.0950.119根据以上数据,以牛血清白蛋白的含量作为横坐标,以相应的吸光值作为纵坐标,绘制标准曲线(见图1-4),得到回归方程为y=0.4806x-0.0012,相关系数R2=0.9995,由此可知,牛血清白蛋白在0.00~0.25mg范围内,线性关系良好。根据此标准曲线计算五种真菌粗多糖的蛋白质含量,见表1-7,结果蛋白含量非常低。

  图1-4牛血清白蛋白标准曲线

  Fig.1-4 The standard curve of BSA

  表1-7真菌粗多糖的蛋白质含量

  Table 1-7 The content of protein of crude polysaccharides in fungi

  crude polysaccharidesTLPPEPPOPHMPPNPcontent(%)1.251.680.310.581.6

  2.4组成糖分析结果

  采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化法检测。多糖组成糖常用的方法有糖醇乙酸酯衍生物、糖醇乙酸酯酰胺衍生物气相色谱法及柱前衍生高效液相色谱法。两种方法的原理均是将多糖水解成单糖,再进行衍生化后,经过气相/液相进行分析。但前两者衍生化处理步骤比较复杂,而PMP-HPLC法操作简便,分离效果好,目前多用于组成糖分析。PMP衍生化的过程见图1-5。

  图1-5 PMP与葡萄糖的反应过程

  Fig.1-5 Glycan derivatization reaction with PMP

  如果所示,单糖与PMP反应生成的衍生物在紫外250nm有吸收,且极性变小,在C18色谱柱上有比较好的分离。

  分别取衍生化后的混合单糖对照品溶液和样品溶液,照上述实验方法的色谱条件进行测定,HPLC色谱图见图2-6,5种真菌多糖中的组成糖分析见表2-8。

  A Standard sugars

  B白玉菇

  C平菇

  D杏鲍菇

  E口蘑

  F真姬菇

  图1-6标准单糖混合物及真菌粗多糖水解产物的衍生化物HPLC色谱图

  (1-甘露糖2-葡糖糖醛酸3-半乳糖醛酸4-鼠李糖5-葡萄糖6-半乳糖7-木糖8-阿拉伯糖9-岩藻糖)

  Fig.1-6 The HPLC chromatograms of derivatives of standard sugars and crude polysaccharide in fungi

  (1-Man 2-GlcA 3-GalA 4-Rha 5-Glc 6-Gal 7-Xyl 8-Ara 9-Fuc)

  表1-8真菌粗多糖的单糖组成及摩尔比

  Table 1-8 The sugar composition and mole ration of crude polysaccharide in fungi

  samplesTLPPEPPOPHMPPNPMan0.260.080.310.150.52GlcA0.03-0.03--GalA0.07-0.060.040.03Rha-----Glc1.001.001.001.001.00Gal0.680.080.880.520.81Xyl---0.08-Ara-----Fuc0.16-0.230.07-由上表可知,五种真菌粗多糖的组成糖不完全相同,但均含有甘露糖、半乳糖、葡萄糖,且都是葡萄糖的含量最高。除杏鲍菇外,它们都含有酸性糖,但酸性糖的含量很低。

  3真菌粗多糖的免疫活性比较

  3.1真菌多糖对脾脏淋巴细胞增殖的影响

  真菌粗多糖对脾脏淋巴细胞增殖的影响见图1-7。如图所示,五种真菌粗多糖及对照ConA均能促进脾脏淋巴细胞的增殖。当它们的浓度均为10µg/mL时,对淋巴细胞的增殖均没有明显的作用。当它们的浓度为100µg/mL、1000µg/mL时,五种真菌粗对淋巴细胞的增殖均具有显着性或极显着性的影响。其中,杏鲍菇的作用活性最好。

  图1-7真菌粗多糖对脾脏淋巴细胞增殖的影响

  Fig.1-7 Effect on the proliferation of splenic lymphocytes of crude polysaccharide from fungi

  3.2对NK杀伤活性的影响

  真菌粗多糖对NK细胞杀伤活性的影响见图1-8。如图所示,五种真菌粗多糖均能促进脾脏淋巴细胞的增殖。当它们的浓度均为10µg/mL时,对淋巴细胞的增殖均没有明显的作用。当它们的浓度为100µg/mL、1000µg/mL时,五种真菌粗多糖对淋巴细胞的增殖均具有显着性或极显着性的影响。其中,杏鲍菇的作用活性最好。

  图1-8真菌粗多糖对NK细胞杀伤活性的影响

  Fig.1-8 Effect of crude polysaccharide from fungi on NK cell activity

  3.3真菌多糖对巨噬细胞吞噬功能的影响

  真菌多糖对巨噬细胞增殖作用的影响见图1-9。当样品浓度为10~1000µg/mL对增殖无显着作用,故中性红吞噬实验选取的浓度为10~1000µg/mL。

  图1-9真菌粗多糖对巨噬细胞增殖的影响

  Fig.1-9 Effect on the proliferation of macrophage of crude polysaccharide from fungi

  真菌粗多糖对巨噬细胞吞噬功能的影响见图1-10。如图所示,五种真菌粗多糖均能促进巨噬细胞的吞噬作用。当它们的浓度均为10µg/mL时,对吞噬功能均没有明显的作用。当它们的浓度为100µg/mL、1000µg/mL时,五种真菌粗对淋巴细胞的增殖均具有显着性或极显着性的影响。其中,杏鲍菇粗多糖促巨噬细胞的吞噬作用最强。

  图1-10真菌粗多糖对巨噬细胞吞噬功能的影响

  Fig.1-10 Effect of crude polysaccharide from fungi on phagocytosis of macrophage

  结论

  本章采用传统的水提醇沉法、Sevage法除蛋白分别得到白玉菇、杏鲍菇、真姬菇、口蘑、平菇五种真菌粗多糖,它们的总糖、酸性糖、蛋白质含量分别为49.3%、48.1%、51.2%、56.7%、53.9%;1.59%、0.84%、1.68%、2.27%、2.33%;1.25%、1.68%、0.31%、0.58%、1.6;它们的组成糖均含有甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Gcl),但比例不同,且都是Gcl的含量最高。除杏鲍菇外,它们都含有少量酸性糖。

  体外免疫调节活性实验结果表明,五种真菌粗多糖均能够促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖,对NK细胞具有一定的杀伤作用及促进巨噬细胞的吞噬作用,当它们的浓度为100µg/mL-1000µg/mL时,五种真菌粗多糖对淋巴细胞的增殖、NK细胞的杀伤及巨噬细胞的吞噬作用均具有显着性或极显着性的影响;其中杏鲍菇粗多糖的免疫调节活性最好,其它四种真菌粗多糖活性相近。

  下一章,我们对活性最好的杏鲍菇粗多糖进行分离纯化。

  第二章杏鲍菇粗多糖PEP的分离纯化

  我们将免疫调节活性最好的杏鲍菇粗多糖PEP,采用两种常规的分离纯化手段,继续分离纯化,得到均一多糖,并测定两种多糖的理化性质、组成糖、分子量分布等信息。

  材料与方法

  1试剂与仪器

  1.1试剂与材料

  右旋糖酐(Dextran)对照品(分子量180-25000),美国Sigma公司;717型阴离子交换树脂、732型阳离子交换树脂,上海绿宝树脂厂;Sephadex G-50,GE Healthcare;OHpak SB-802.5 HQ(8mm×300mm)凝胶柱,日本,Shodex;磷酸二氢钾、氢氧化钠,津市光复精细化工研究所;三氟乙酸(TFA),上海市化学试剂三厂;无水硫酸钠盐酸、氯仿,北京化工厂。

  1.2仪器

  仪器及型号生产厂家分析天平德国Sartorius公司旋转蒸发仪日本EYELA公司Agilent 1200高效液相色谱仪美国Agilent公司PB-10 pH计德国Sartorius公司DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱上海一恒科技有限公司2实验方法

  2.1混合树脂对粗多糖PEP的初步分离

  2.1.1混合离子交换树脂预处理

  称取适量717强碱型阴离子交换树脂,用去离子水浸泡过夜,漂洗至无色,倒掉上清液,用2%的NaOH溶液浸泡4h,去离子水洗至中性,再用4%的盐酸浸泡4h,去离子水洗至中性。

  称取适量732强酸型阳离子交换树脂,用去离子水浸泡过夜,漂洗至无色,倒掉上清液,用4%的浓盐酸浸泡4h,去离子水洗至中性,再用2%的NaOH溶液浸泡4h,去离子水洗至中性。

  将以上处理好的树脂等比例混合均匀,用蒸馏水洗至中性,装柱(Ф10×80cm),备用。

  2.1.2上样及洗脱

  称取杏鲍菇粗多糖50g,用150mL水溶解,经过混合树脂层析柱,纯水作为流动相,流速10mL/min,收集8个柱体积的洗脱液,将洗脱液浓缩至小体积,干燥,备用,命名为PEPI。

  2.1.3 PEPI理化性质的测定

  分别按第二章2.2.1,2.2.4项下理化性质的研究的测定方法测定PEPI的理化性质。

  2.2 Sephadex G-50凝胶柱分离PEPI

  2.2.1 Sephadex G-50的预处理及装柱

  称取Sephadex G-50 30g,用去离子水泡8h,使其充分溶胀。缓缓倒入柱(Ф5×50cm)中,装满后,连接中压,流速为1mL/min,用水洗脱48h,再将柱子顶部用凝胶补足。

  2.2.2内水(Ve)、外水体积(V0)的测定

  分别称取葡萄糖和蓝色葡聚糖对照品10mg,混合,加5mL蒸馏水溶解,经过上述中压柱,流速为1mL/min,每管收集10mL,隔管以苯酚-硫酸法监测中性糖,以收集的洗脱液的管数为横坐标,对应的吸光度值作为纵坐标绘制洗脱图。

  2.2.2上样及洗脱

  称取PEPI 20mg,用5mL水溶解,离心,过0.45μm微孔滤膜,上中压柱,流动相为水,流速为1mL/min,每管收集10mL,共收集104管。隔管以苯酚-硫酸法监测中性糖,以收集的洗脱液的管数为横坐标,对应的吸光度值作为纵坐标绘制洗脱图。

  2.3 PEPI-1、PEPI-2理化性质的测定

  分别按第一章2.2.1项下理化性质的研究的测定方法分别测定PEPI-1、PEPI-2的总糖、葡萄糖醛酸、蛋白质的含量;按第二章2.2.4项下的实验方法分别测定PEPI-1、PEPI-2的单糖组成。

  2.4 PEPI-1、PEPI-2分子量测定

  采用高效凝胶分子排阻色谱法[82]进行测定。

  2.4.2供试品溶液的制备

  取样品适量,加入流动相配制成浓度为5mg/mL的溶液,过0.45μm微孔滤膜,作为供试品溶液,备用。

  2.4.3色谱条件

  色谱柱为Shodex OHpak SB-802.5 HQ(8mm×300mm)凝胶柱,流动相为0.7%硫酸钠溶液,柱温35℃,流速为0.5mL/min,进样量20μL,示差折光检测器。

  2.4.1标准曲线及样品的测定

  精密称取已知分子量的Dextran T180、T1000、T5000、T12000、T25000的葡聚糖对照品,加流动相配制成每1mL含5mg的溶液,按上述色谱条件进样,由GPC专用软件绘制标准曲线,以标准分子量的对数值为纵坐标,以相应的色谱峰的保留时间作为横坐标进行线性回归,得到回归方程。此方法得到的标准曲线线性良好,相关系数为0.9998。

  样品按上述色谱条件进样,根据供试品的保留时间计算样品各组分的重均分子量。

  结果与讨论

  混合树脂对粗多糖的初步分离

  717+732离子交换树脂,分别为717阴离子交换树脂及732阳离子交换树脂的等量混合物,它可以去除酸性物质,碱性物质、蛋白及色素等杂质。粗多糖经过混合离子交换树脂后,多糖的含量大幅提高(见表2-1),PEPI颜色由原来的浅褐色变成灰白色,且此种方法上样量大,洗脱速度快,除杂效果好,适合多糖的初步分离。

  我们也比较了多糖分离常用的DEAE-CM 52离子交换色谱,将样品经过DEAE-CM 52离子交换色谱,分别用水及不同浓度的NaCl洗脱,得到水洗及盐洗两个洗脱部位。结果,水洗脱部分的理化性质与混合离子交换树脂分离的结果一致,而盐洗脱部位得到的洗脱部分收率很低,只有1%左右,因为盐洗脱下来的是酸性糖及蛋白,在杏鲍菇粗多糖中,酸性糖及糖蛋白的含量很低,故盐洗脱部位的收率很低,与前述结果相吻合。但此种方法上样量小,分离速度慢,就本样品而言,混合离子交换树脂更适合杏鲍菇粗多糖的初步分离。

  PEPI理化性质的测定结果见表2-1,组成糖结果见图2-1。

  表,2-1 PEPI中性糖、酸性糖、蛋白质含量和组成糖的测定结果

  Table 2-1 The content of neutral sugar,uronic acid,protein and

  composition of sugar and molar ratio

  sampletotal sugaracid sugarpoteincomposition of sugar and molar ratioManGlcGalcontent(%)96.450.090.110.051.000.07

  图2-1 PEPI的单糖衍生化图谱

  Fig.3-1 The Chromatogram of derivatization monosaccharide

  由上述结果可以看出,PEP经过混合离子树脂分离后,中性糖含量大幅提高,说明通过此方法除去了大量的杂质,使多糖样品得到了富集;样品PEPI由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,此结果与PEP的组成糖及摩尔比基本一致,说明经过离子交换树脂初步纯化粗多糖后,多糖的组成种类及比例基本没有变化。

  2.Sephadex G-50对样品PEPI的分离

  Sephadex G-50凝胶柱色谱是多糖分离纯化常用的手段,它的原理是分子筛,根据待分离组分分子量大小进行分离。

  内外水体积及Sephadex G-50分离纯化PEPI洗脱图见图2-2。

  图2-2 PEPI经Sephadex G-50凝胶柱洗脱图

  Fig.2-2 The elution diagram of PEPI by Sephadex G-50

  根据内外水体积及洗脱图形,将两个峰分别收集,浓缩,冻干,分别得PEPI-1和PEPI-2。根据内外水体积可判断,PEPI1分子量较大,PEPI-2的分子量较小。

  PEPI-1、PEPI-2理化性质及组成糖的测定结果

  PEPI-1、PEPI-2理化性质测定结果见表2-2。PEPI-1、2的PMP衍生物的HPLC图见图2-3。

  表2-2 PEPI-1、PEPI-2中性糖、酸性糖、蛋白质含量和组成糖的测定结果

  Table 2-2 The content of neutral sugar,uronic acid,protein of PEPI-1and PEPI-2

  sampletotal sugaracid sugarpoteincomposition of sugar and molar ratioManGlcGalPEPI-196.850.020.032.21.13.2PEPI-298.220.040.02—1.00—

  图2-4 PEPI-1和PEPI-2的单糖衍生化图谱(A-PEPI-1 B-PEPI-2)

  Fig.2-4 The Chromatogram of derivatization monosaccharide of PEPI-1and PEPI-2

  (A-PEPI-1 B-PEPI-2)

  PERI经过凝胶柱分离后,得到的PEPI-1、PEPI-2的组成糖不相同,PEPI-1含有甘露糖、葡萄糖和半乳糖三种单糖,且半乳糖的含量最高;而PEPI-2只含有葡萄糖一种单糖。

  4.PEPI-1、PEPI-2的分子量测定结果

  标准曲线、PEPI-1、PEPI-2的分子量分布结果见图2-5、2-6。

  由图可知,PEPI-1为单一峰,提示为均一多糖,根据标准曲线计算PEPI-1的分子量为9.9×104Da,PEPI-2的分子量为273Da,提示为寡糖。

  图2-5标准曲线

  Fig.2-5 The standard curve

  图2-6 PEPI-1、PEPI-2的GPC色谱图(A-PEPI1、B-PEPI2)

  Fig.2-6 The chromatograms of GPC of PEPI-1 and PEPI-2(A-PEPI1、B-PEPI2)

  结论

  本章将杏鲍菇粗多糖PEP分别经过混合离子交换树脂和Sephadex G-50凝胶柱色谱分离纯化,得到均一多糖PEPI-1和PEPI-2。

  717强碱型阴离子交换树脂和732强酸型阳离子交换树脂等量混合可除去样品中的盐分、蛋白以及色素等小分子物质,本实验采用混合离子交换树脂对PEP进行纯化,纯化后,中性糖含量明显提高,由原来的48.1%提高至88.45%;蛋白质含量明显降低。对PEPI进行组成糖分析,结果显示,PEPI主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,单糖组分摩尔比为0.05:1:0.07,组成糖结果几乎与未纯化前没有变化。因此,混合离子交换树脂对PEP粗多糖具有很好的分离作用,且混合离子交换树脂上样量大,分离速度快,适合杏鲍菇粗多糖的初步分离。

  PEPI经Sephadex G-50葡聚糖凝胶进行分离得到2个组分PEPI-1和PEPI-2。分别对其进行理化性质测定,结果显示,PEPI-1、PEPI-2的中性糖含量分别为95.7%、92.9%,糖醛酸及蛋白质含量为零;组成糖分析结果显示,PEPI-1主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,且半乳糖额含量最高;而PEPI-2仅由葡萄糖组成;PEPI-1和PEPI-2分别经过凝胶色谱柱进行分子量分析,根据标准曲线及GPC软件计算,PEPI-1的分子量为,9.9×104Da,PEPI-2的分子量为273Da,提示为寡糖。

  在下一章中,我们对PEPI-1和PEPI-2的结构进行研究。

  第三章PEPI-1、PEPI-2的结构研究

  多糖的结构分为一级结构及高级结构,我们在本章重点研究多糖的一级结构,包括多糖的糖残基种类及连接顺序等信息,目前甲基化仍然是最常用的方法,NMR作为结构研究的重要手段可以与甲基化的结果相互佐证。

  材料与方法

  试剂与仪器

  1.1试剂与材料

  二甲基亚砜(DMSO)、氯仿、碘甲烷、硼氢化钠、氢氧化钠等均为分析纯。4A分子筛(钠-A型分子筛),国药集团化学试剂有限公司;

  1.2仪器

  仪器及型号生产厂家气-质联用仪6890N-5973MSD美国Agilent公司箱式电炉(马弗炉)SX2型上海浦东荣丰科学仪器有限公司液-质联用仪1100-6320 MS美国Agilent公司核磁共振仪Bruker AVANCEШ美国Varian公司傅里叶变换红外光谱仪FTS135型美国Bio-Rad公司2实验方法

  2.1 PEPI-1、PEPI-2的甲基化分析

  2.1.1脱水DMSO的制备

  4A分子筛置于马弗炉中300℃烘干3h,冷却(在马弗炉中)至40℃后加入DMSO密封搅拌过夜,放置静止后取上清液,备用。

  2.1.2 NaOH-DMSO混悬液的制备

  称取5g NaOH,溶于5mL蒸馏水中,加入15mL脱水DMSO,时时振摇,混匀,离心,弃去上清。重复此操作15次。向沉淀中加入15mL脱水DMSO并涡旋混匀,4℃保存,备用。

  2.1.3甲基化

  称取样品5mg置具塞试管中,放置减压干燥器(含五氧化二磷及变色硅胶)中减压真空干燥24h,加入脱水DMSO 0.5mL,向其中充满氮气后密封搅拌过夜。加入0.5mL NaOH-DMSO混悬液,充满氮气密封搅拌6h,再加入0.3mL碘甲烷,充满氮气密封搅拌过夜,室温下吹尽其中的碘甲烷。向试管中加2mL水,再加入3mL氯仿,反复萃取3次,弃去水层,合并氯仿层,吹干。

  2.1.4水解还原乙酰化

  甲基化样品加入2mol/L三氟乙酸1mL,密封,置烘箱121℃水解反应1.5h,取出吹干。残渣加1mL甲醇溶解,吹干甲醇,此操作重复三次。加1mol/L氨水0.5mL,硼氢化钠20mg,放置室温下反应1.5h,滴加醋酸终止反应,吹干样品。残渣加10%醋酸甲醇溶液1mL,吹干,反复三次。样品置干燥器中干燥过夜,加0.5mL吡啶,1mL脱水醋酸酐密封,置121℃烘箱中3h,取出吹干。残渣加甲醇1mL,吹干,反复三次。残渣溶解于3mL蒸馏水中,向其中加入3mL氯仿,萃取,取氯仿层,吹干,残渣加少量丙酮溶解,过0.45μm滤膜,备用。

  2.1.5 GC-MS分析

  分析条件:DB-1 MS石英毛细管柱(30m×0.32mm),进样口温度为200℃,离子源温度为250℃。升温程序:140℃保持7.5min,以2℃/min程序升温至250℃,保持20min,流速为1mL/min,进样量1µL,分流比为50:1。

  2.2 PEPI-1的IR分析

  取适量多糖样品,KBr压片,在4000-400 cm-1范围内进行红外光谱扫描。

  PEPI-1的NMR分析

  50mg PEPI-1,加D2O溶解,通过Bruker AVANCEШ600 MHz进行一维及二维NMR测定。

  PEPI-2的MS分析

  PEPI-2加入50%甲醇-水,配制成浓度为0.5mg/mL的溶液,经过0.45μm微孔滤膜,通过质谱仪。

  质谱条件:离子源:电喷雾源,喷雾电压4KV,壳气为氦气,流速60arb,辅助气(N2)10arb,金属毛细管温度为280℃。

  结果与讨论

  PEPI-1的结构分析

  PEPI-1的甲基化结果分析

  甲基化是多糖结构研究中非常重要的一种手段。它可以提供多种信息,如糖残基的种类及各糖残基的数目。本实验采用改良的Hakomori法,该方法以DMSO为溶剂,用

  DMSO与NaOH的反应产物甲基亚磺酰负离子CH3SOCH2­为强碱,因CH3SOCH2­易与氧、水或二氧化碳反应而降解,所以整个过程应在氮气保护和无水条件下进行。其甲基化的过程如下图3-1。

  图4-1甲基化反应原理

  Fig.3-1 The process of methylation reaction

  甲基化衍生物的裂解规律为:

  ●各种单糖甲基化衍生物的基峰均为43,为CH3CO+;

  ●相邻甲氧基的两个碳原子中间的化学键最易发生断裂,形成正离子;其次是连接乙酰基和甲氧基之间的碳原子的化学键;连接两个乙酰基的碳原子之间的化学键最难断裂,以至于基本看不到碎片峰。

  以1,5­Di­O­acetyl­2,3,4,6­Tetra­O­methyl­manactitol为例,主要碎片峰为117.161.205,这些碎片离子不稳定,继续发生断裂,产生相应的碎片峰,由此可知,实际所得碎片为:45.71.87.101.117.129.145.161.205。具体见下图。

  多糖PEPI经过上述甲基化、水解、乙酰化等一系列过程,得到部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物,经GC­MS获得总离子流图(Fig.3-2)和相应的质谱图(Fig.3­3),通过与参考文献对照[83],得甲基化分析结果,列于表3­1。

  图4-2总离子流图

  Fig.4-2 Total ion chromatogram of PEPI-1

  A 1,5–二-乙酰基-2,3,4,6-四甲基-甘露糖醇

  A 1,5­Di­O­acetyl­2,3,4,6­Tetra­O­methyl­Manactitol

  B 1,3,5–三-乙酰基-2,3,4,6-三甲基-甘露糖醇

  B 1,3,5-Tri-O­acetyl-2,4,6-Tri-O­methyl­Manactitol

  C 1,3,5–三-乙酰基-2,4,6-三甲基-半乳糖醇

  C 1,3,5-Tri-O­acetyl-2,4,6-Tri-O­methyl­Galactitol

  D 1,5,6–三-乙酰基-2,3,4-三甲基-甘露糖醇

  D 1,5,6-Tri-O­acetyl-2,3,4-Tri-O­methyl­Mannitol

  E 1,5,6–三-乙酰基-2,3,4-三甲基-半乳糖醇

  E 1,5,6-Tri-O­acetyl-2,3,4-Tri-O­methyl­Galactitol

  F 1,5,6–三-乙酰基-2,3,4-三甲基-甘露糖醇

  F 1,3,5,6-Tetra­O­acetyl-2,4-Di-O­methyl­Mannitol

  G 1,2,5,6–四-乙酰基-3,4-二甲基-半乳糖醇

  G 1,2,5,6-Tetra­O­acetyl-3,4-Di-O­methyl­Galactitol

  图3-3 PEPI1部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物的质谱图(A-G)

  Fig.3-3 The MS spectrum of PEPI1 of partially O-methylated alditol acetate(A-G)

  表3-1 PEPI-1甲基化结果

  Fig.3-1 Methylation analysis data of PEPI-1

  Retention timeMethylated sugarMolar ratioDeduced linkage pattern17.0002,3,4,6-Me4-Man1.5T-Manp-(1→20.1512,4,6-Me3-Glc1.1→3)-Glcp-(1→21.4242,4,6-Me3-Gal0.2→3)-Galp-(1→22.2812,3,4-Me3-Man0.2→6)-Manp-(1→23.9202,3,4-Me3-Gal2.0→6)-Galp-(1→26.5362,4-Me3-Man0.5→3,6)-Manp-(1→27.8553,4-Me2-Gal1.0→2,6)-Galp-(1→结果显示,PEPI-1主要包含7种糖残基,其中有1个末端,2个分支点,末端和分支点之和的数量相等且糖残基中甘露糖、半乳糖、葡萄糖的比例也和上述组成糖的结果一致,以上分析说明甲基化的结果是合理的。

  PEPI-1的IR分析

  IR是多糖结构分析的一种辅助手段,主要用于确定苷键的构型,观察特征的官能团。IR光谱图见图3-4。

  图3-4 PEPI-1 FT-IR光谱图

  Fig.3-4 The spectrogram of IR of PEPI-1

  由图可知,宽峰3330 cm-1是O-H的伸缩振动,是多糖类化合物的特征吸收;2930 cm-1为C-H的伸缩振动峰;1610 cm-1为C-O的伸缩振动峰;1408 cm-1处的吸收峰是C-H的变角振动;1025 cm-1处的吸收峰表明PEPI-1包含吡喃糖类型的结构[84];另外,是多糖中的C-O、C-O-C的伸缩振动和C-OH的弯曲振动特征峰;852 cm-1、744 cm-1处于950-700 cm-1之间,说明具备α-和β-两种构型[85]。

  1.3 NMR分析

  随着科学技术的发展,NMR已经成为分析多糖结构的必不可少的有力工具,1D/2D NMR可以提供很多结构信息,包括糖残基的数量、种类、构型及连接顺序。

  PEPI-1的13C NMR、1H NMR、2DNMR见附图。13C NMR中,信号集中在60-110ppm范围内,而1 H NMR中,信号都聚集在3.0-5.2ppm范围内,以上是多糖的典型特征,且并不含有—COOH、—OCH3等多糖结构中常见的基团。13C NMR中,在80-110ppm范围内是异头碳的信号区域,共有7个信号,它们分别为97.428、97.262、97.856、98.232、101.253、101.253、102.579ppm,60-80ppm是糖环上的碳信号。在1H NMR中,5.1-4.4ppm是端基氢质子信号区域,分别为4.432、4.931、5.064ppm其中4.931、5.064ppm的积分为2,它们分别代表2个端基质子信号,3.0-4.4ppm为H2-H6的糖残基质子信号,且这一区域重叠严重。从HSQC中,我们可以看到端基碳和端基氢的相关信息,包括5.064/98.232,4.931/97.262,4.931/97.428,4.432/102.579,5.064/97.856,4.770/101.253和4.770/101.253 ppm。其中氢谱中4.77ppm因为溶剂D2O峰(4.8ppm)的干扰,只有通过HSQC能够看到,并且有两个碳信号和它相关,这就解释了为什么在氢谱中只有5个端基质子信号。从以上分析我们可以得出结论,PEPI-1结构中共有7种糖残基,这一结论与甲基化结果分析一致。

  在1 H NMR中,有5个信号的化学位移低于5.0ppm,因此为β-构型的糖残基,;相反,有2个α-构型的糖残基[86]。

  通过以上对PEPI-1结构的综合分析,包括单糖结构、核磁特征和甲基化结果等,我们推断了一种可能的重复结构单元,见图4-5。

  图3-5 PEPI-1的结构

  Fig.3-5.A possible structure of PEPI-1

  PEPI-2的结构分析

  PEPI-2的甲基化结果

  甲基化的分析结果表3-2。质谱图见图3-6

  A 1,5­二乙酰基2,3,4,6-四甲基-葡萄糖醇MS图

  A 1,5­Di­O­acetyl­2,3,4,6­Tetra­O­methyl­Glucitol

  B 1,5,6–三乙酰基-2,3,4-三甲基-葡萄糖醇

  B 1,5,6-Tri-O­acetyl-2,3,4-Tri-O­methyl­Glucitol

  图3-6 PEPI2部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物的质谱图(A-B)

  Fig.3-6 The MS spectrum of PEPI2 of partially O-methylated alditol acetate(A-B)

  表3-2 PEPI-2甲基化结果

  Fig.3-2 Methylation analysis data of PEPI-2

  Retention time(min)Methylated sugarMolar ratioDeduced linkage pattern16.7202,3,4,6-Me4-Glc→1)-Glcp0.9618.5382,3,4-Me3-Glc→1,6)-Glcp1.00结果显示,PEPI-2主要包含了2种糖残基,且比例为1:1,初步判断为→1,6)-Glcp。

  PEPI-2的MS分析

  ESI-MS(electron spray ionization mass spectrometry)是质谱众多电离技术中在溶液中电离效率最高一的种软电离方式,它可以测定天然的糖链,而且灵敏度很高,因而无需衍生化就能测定糖链的单糖组成、残基之间连接方式、聚合度以及分支信息等,尤其适合对寡糖的分析。

  PEPI-2的MS结果见下图3-7。

  A负离子模式

  B正离子模式

  图3-7 PEPI-2的ESI-MS质谱图

  Fig.3-7 The ESI-MS spectrum of PEPI-2

  在PEPI-2的ESI-MS中,正离子模式m/z 365.2、381.2和707.3分别为[M+Na]+,[M+K]+,[2M+Na]+;负离子模式m/z 341.2、377.2、683.4分别为[M-1]-,[M+2H2O-1]-,[2M-1]-。在质谱图中未见三糖、四糖等特征碎片峰。综合以上信息,PEPI-2=342,为二糖,此结果与上述甲基化结果一致。

  结论

  本章通过采用IR、NMR、MS、甲基化等方法分别对PEPI-1、PEPI-2结构进行研究,结果显示1、PEPI-1以→1)-Manp为非还原末端,→1,3,6)-Manp和→1,2,6)-Galp为分支位点,主链核心部分主要由→1,6)-Galp和→1,3)-Glcp构成;

  2、PEPI-2为二糖,连接方式为1→6连接。

  研究多糖PEPI-1及PEPI-2的结构,为它们的活性研究及构效关系打下基础。

  第四章对RAW264.7细胞免疫活性研究

  材料与方法

  1试剂与仪器

  小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞株,购自中国科学院上海细胞库;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、中性红(Neutral red),美国Sigma公司;胎牛血清、RPMI 1640培养基、10000U/mL青霉素-10000μg/mL链霉素双抗,美国Gibco公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)、胰蛋白酶、EDTA,美国Amresco;二甲基亚砜(DMSO),分析纯,国药集团化学试剂有限公司;小鼠Griess试剂盒,美国Promega公司;小鼠IL-1、IL-6、TNF-α试剂盒,美国Biolegend公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒,碧云天生物技术研究所;PVDF膜,美国Bio-Rad公司;ECL显色液,美国Millipore公司。

  仪器及型号生产厂家立式压力蒸汽灭菌锅上海博迅实业有限公司医疗设备厂ZW-A型微量振荡器江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司倒置光学显微镜上海蔡康光学仪器有限公司MK-3酶标仪美国Thermo公司MCO-15AC CO2恒温培养箱日本SANYO公司SW-CJ-2D双人净化工作台苏州净化设备有限公司低温离心机美国Beckman公司96孔/6孔细胞培养板美国Costar公司2实验方法

  2.1 RAW264.7细胞的培养

  向RAW264.7细胞培养瓶中加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(内含1%双抗),置于37℃、5%CO2培养箱中培养。1~2天更换一次新鲜培养液,待细胞长满瓶底80%后用含有0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA的消化液进行消化,传代。

  2.2细胞活力检测

  取处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔细胞培养板上,细胞密度为1×105个/mL,每孔100μL,四周为PBS,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。取各时间点为4h、12h、24h、48h、72h、96h、120h,每孔加入10μL MTT溶液,继续培养4h,倾去液体,每孔加入150μL DMSO,振荡10min,置于酶标仪于492nm下测定吸光度(A)值,以时间为横坐标、吸光度为纵坐标绘制细胞生长曲线。

  2.3 LPS对RAW264.7细胞增殖的影响

  取处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔细胞培养板上,细胞密度为1×105个/mL,每孔100μL,四周为PBS,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h后,倾去培养液,加入浓度分别为0.5、1、5、10、20、50、100、200μg/mL的LPS溶液,每组5个复孔,培养24h后每孔加入10μL MTT(5μg/mL)溶液,继续培养4h,倾去液体,每孔加入150μL DMSO,振荡10min,置于酶标仪于492nm下测定吸光度(A)值。

  2.4 PEPI-1对RAW264.7细胞增殖的影响

  取处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔细胞培养板上,细胞密度为1×105个/mL,每孔100μL,四周均为PBS,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。实验分为3组,分别为空白组、对照组和给药组,培养24h后,空白组每孔加入100μL培养基;对照组每孔加入100μL浓度为10μg/mL的LPS溶液,给药组每孔加入100μL PEPI-1,浓度分别为1.5、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200μg/mL,每组各5个复孔,继续培养24h后每孔加入10μL MTT(5μg/mL)溶液,培养4h后倾去液体,每孔各加入150μL DMSO溶液,振荡10min,置于酶标仪于492nm下测定吸光度(A)值。

  2.5 PEPI-1对RAW264.7细胞吞噬活性的影响

  取对数生长期的细胞,加培养基将细胞稀释至1×105个/mL,接种于96孔板中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。实验分为3组,空白组、给药组和对照组,空白组每孔加入100μL培养基,给药组加入不同浓度PEPI-1(1.5、3.13、6.25、12.5、25、50、100μg/mL)100μL,对照组每孔加入10μg/mL LPS溶液,每组设置5个复孔。培养24h后倾去液体,每孔加入0.075%的中性红溶液进行染色,1h后倾去染色液,用PBS清洗3次,每孔各加入100μL醋酸乙醇(V/V=1:1)细胞溶解液,室温放置过夜,次日于酶标仪492nm下测定吸光度值。细胞对中性红吞噬能力用吞噬指数(pinocytotic index,PI)表示。

  吞噬指数=A样品/A空白

  2.6 PEPI-1对RAW264.7细胞释放NO的影响

  取对数生长期的细胞,加培养基将细胞稀释至1×106个/mL,接种于6孔板中,每孔接种1mL,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。实验分为3组,空白组、给药组和对照组,空白组加入培养基,给药组加入浓度分别为1.5、3.13、6.25、12.5、25、50、100μg/mL的PEPI-1溶液,对照组加入10μL LPS溶液,培养24h后吸取培养上清液,离心,用Griess试剂盒检测NO的含量。

  2.7 PEPI-1对RAW264.7细胞释放IL-6、IL-1、TNF-α的影响

  细胞处理及分组同上。收集培养上清液,采用IL-1、IL-6、TNF-α试剂盒检测细胞分泌IL-1、IL-6、TNF-α的含量。

  2.8 Western blot法检测RAW264.7细胞p38,JNK,ERK蛋白的表达

  蛋白的提取

  取对数生长期的细胞,加培养基将细胞稀释至5×106个/mL,接种于25cm2培养瓶中,每瓶接种1mL,加入适量培养基后置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。实验分为3组,空白组、给药组和对照组,空白组加入培养基,给药组加入浓度分别为25、50、100μg/mL的PEPI-1溶液,对照组加入10μL LPS溶液,培养24h后,弃去上清液,用4℃预冷的PBS洗3遍,然后加入1mL PBS,用细胞刮刀刮取细胞,1000rpm离心5min,弃去上清液,收集细胞。分别向其加入200μL含有PMSF的裂解液(裂解液:PMSF=100:1),于冰上震荡裂解30min,裂解后于4℃12000rpm离心15min,收集上清液,即得蛋白。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度,保存于-80℃冰箱中。

  免疫印迹反应

  将上述所提取的蛋白样品与等体积的上样缓冲液于100℃煮沸5min进行灭活。取适量蛋白样品于12%SDS-PAGE,恒压条件下进行分离。然后用转移电泳槽100V恒压转膜2-4h将蛋白转移至0.45μm的PVDF膜上。取下PVDF膜,做好标记,室温下用5%脱脂牛奶封闭1h后,用TBST洗PVDF膜5次,将膜置于小鼠单抗p38,JNK,ERK(1:2000)和GAPDH(1:2000)抗体稀释液中4℃孵育过夜。次日,用TBST洗涤5次(5min/次),加二抗(1:2000)孵育2h,TBST洗5次,最后将PVDF膜用ECL显色液检测,用凝胶成像仪观测并拍照,最后用Image J软件分析。

  2.9统计学分析

  采用SPSS统计软件进行分析,计量数据用±S表示,用单因素方差分析组间差异,以P<0.05具有统计学意义。

  结果与讨论

  1 RAW264.7细胞的生长曲线

  RAW264.7细胞的生长曲线见下图23。

  图4-1 RAW264.7细胞生长曲线

  Fig.4-1 Growth curve of RAW264.7cell

  由以上生长曲线说明本细胞处于正常的生长状态,72小时左右细胞呈稳定的状态,24-72小时细胞处于对数期生长。

  2不同浓度LPS对RAW264.7细胞增殖的影响

  LPS直接作用于RAW264.7细胞时,对其细胞增殖的影响如图4-1所示,由图可知,在实验剂量范围内LPS均能促进细胞增殖,并呈剂量依赖关系,其中,0.5~50μg/mL LPS作用于细胞与空白组无明显差异;100μg/mL LPS能显着促进细胞增殖;200μg/mL LPS能极显着促进细胞增殖。

  Note:*compared with the blank group P<0.05,**compared with the blank group P<0.01

  图4-2不同浓度LPS对细胞的影响

  Fig.4-2 Effects of LPS on cells

  3 PEPI-1对RAW264.7细胞增殖的影响

  PEPI-1直接作用于RAW264.7细胞时,对其细胞增殖的影响如图4-3所示,由图可知,在实验剂量范围内PEPI-1均能促进细胞增殖。其中,在质量浓度为1.5~100μg/mL时,PEPI-1作用于细胞与空白组无明显差异;200μg/mL PEPI-1能极显着促进细胞增殖。

  Note:*compared with the blank group P<0.05,**compared with the blank group P<0.01

  图4-3 PEPI1对细胞的影响

  Fig.4-3 Effects of PEPI1 on cells

  4 PEPI-1对RAW264.7细胞吞噬活性的影响

  采用RAW264.7细胞吞噬中性红的方法来评价PEPI-1体外对巨噬细胞吞噬作用的影响,结果如图4-4所示。结果显示,与空白组相比较,LPS组能极显着促进细胞吞噬中性红,其吞噬指数为1.91;随着PEPI-1浓度的增加,其吞噬指数逐渐升高,100μg/mL的PEPI-1作用于细胞的吞噬指数为1.82,略低于LPS组。质量浓度在25~100μg/mL的PEPI-1能够极显着地提高RAW264.7细胞吞噬中性红的能力,提示PEPI-1可以显着活化RAW264.7细胞,提高其吞噬能力。

  图4-4 PEPI-1对细胞吞噬作用的影响

  Fig.4-4 Effects of PEPI1 on cells phagocytosis

  5 PEPI-1对RAW264.7细胞释放NO的影响

  NO是一种新型的生物活性信息递质,具有重要的免疫学功能,在免疫、神经和唿吸等多个系统中均发挥着重要作用,并且广泛参与到机体的免疫反应、炎症反应等多种生理和病理过程中,与获得性免疫、细胞因子的分泌以及自身免疫病都密切相关。

  NO标准曲线见图4-5,LPS和PEPI-1作用RAW264.7细胞分泌NO的能力见图4-6。从图可知,PEPI-1能够激活RAW264.7细胞,促进RAW264.7细胞中NO的释放,且随剂量的增加,NO的分泌量逐渐升高,说明PEPI-1能够通过显着促进NO的释放从而有效地调节RAW264.7细胞的免疫功能。

  图4-5 NO标准曲线

  Fig.4-5 Standard curve of NO

  图4-6 PEPI1对264.7细胞释放NO的影响

  Fig.4-6 Effects of PEPI1 on the production of NO in RAW 264.7 cells.

  6 PEPI-1刺激RAW264.7细胞释放IL-1、IL-6、TNF-α的含量

  细胞因子(CK)是由多种细胞释放的小分子蛋白或糖蛋白,能够广泛地参与细胞生理功能、免疫应答、介导炎症及传染病等过程中,还可以在细胞间传递生物学信息,提高机体免疫力。所以,探讨细胞因子对于从分子水平上阐明免疫调节机制具有重要的意义。

  白介素(IL)是由巨噬细胞分泌的一种细胞因子。它可以促进T细胞活化、B细胞增殖和抗体的分泌、传递信息;还可以诱发炎症反应及调节多种免疫功能。

  肿瘤坏死因子(TNF)是一种能直接杀死肿瘤细胞,引起肿瘤组织出血坏死的小分子蛋白。一般有TNF-α和TNF-β两种类型。TNF-α主要由巨噬细胞分泌,而活化的T细胞是分泌TNF-β的场所。目前,已有大量文献报道证实,TNF能促进T细胞及其他杀伤细胞杀灭肿瘤细胞,提高机体免疫功能。

  TNF-α、IL-1、IL-6的标准曲线见图4-8、4-9、4-10,不同浓度PEPI-1刺激RAW264.7细胞释放TNF-α、IL-1、IL-6的含量见图4-11、4-12、4-13。

  由图可知,LPS作用于细胞,能够极显着促进IL-1、IL-6、TNF-α的释放,随着PEPI-1浓度的增加,RAW264.7细胞释放TNF-α、IL-1、IL-6的含量也逐渐升高,在质量浓度为1.5~12.5μg/mL时,与空白对照组相比,无明显差异;在质量浓度为25~100μg/mL时,与空白对照组相比,具有显着性差异,提示PEPI-1能够显着提高RAW264.7细胞释放细胞因子,从而进一步调节机体的免疫功能。

  图4-8 IL-1标准曲线

  Fig.4-8 Standard curve of IL-1

  图4-9 IL-6标准曲线

  Fig.4-9 Standard curve of IL-6

  图4-10 TNF-α标准曲线

  Fig.4-10 Standard curve of TNF-α

  图4-11 PEPI1对264.7细胞释放TNF-α的影响

  Fig.4-11 Effects of EPA-1 on the production of TNF-αin RAW 264.7 cells.

  图4-12 PEPI1对264.7细胞释放IL-1的影响

  Fig.4-12 Effects of EPA-1 on the production of IL-1 in RAW 264.7 cells.

  图4-13图4-6 PEPI1对264.7细胞释放IL-6的影响

  Fig.4-13 Effects of EPA-1 on the production of IL-6 in RAW 264.7 cells.

  7 PEPI-1对MAPK信号通路的影响

  MAPK是一类广泛存在于多种真核细胞内的Ser/Thr蛋白激酶,是通过磷酸化进而激活调节细胞应答的重要途径。目前的研究证实,MAPK信号转导通路能将细胞外的刺激信号转导入细胞及其核内,并诱发各种生物学反应的发生[68]。MAPK家族是与细胞生长、分化、凋亡等密切相关的信号传导途径中的关键信号分子,其主要成员包括细胞外调控激酶(ERK)、Janus激酶(JNK)、p38激酶。MAPK通路是细胞内介导胞外刺激的信号转导通路之一,存在于所有的真核细胞中,其重要功能就是介导细胞对外环境变化做出反应。

  本研究为探讨MAPK通路是否参与了PEPI-1活化RAW264.7细胞的过程,我们采用western blot的方法检测了MAPK信号通路中关键蛋白的磷酸化水平的表达情况。结果见图4-14。

  结果显示,与空白组相比,LPS对照组的p-p38、p-JNK、p-ERK蛋白表达均显着提高;随着PEPI-1的剂量增加,p-p38、p-JNK、p-ERK蛋白表达水平也随之上升,且效果显着,提示MAPK信号通路参与了PEPI-1调节机体免疫的过程。

  图4-14 PEPI1对p-p38、p-JNK、p-ERK蛋白表达的影响

  Fig.4-14 Effects of EPA-1 on MAPKs(p38,ERK and JNK).

  结论

  巨噬细胞在免疫系统中具有十分重要的地位,在生命有机体的免疫防御、自身稳定、免疫监视过程中中都起着重要的作用。激活的巨噬细胞不但可以直接杀伤病原微生物,清除凋亡细胞和树突细胞,还可分泌的TNF、IL、NO等免疫活性分子,在先天性免疫防御和获得性免疫应答中起着不可替代的作用,是机体免疫应答、免疫调节中的重要环节。

  实验结果显示,PEPI-1能够提高RAW264.7细胞吞噬中性红的能力,在质量浓度为100μg/mL时,其吞噬指数为1.82,略低于LPS组。PEPI-1能够促进RAW264.7细胞释放NO、IL-1、IL-6、和TNF-α,100μg/mL PEPI-1作用于细胞的释放量,与空白组相比分别增加327.69%、42.61%、25.08%、25.46%;10μg/mL LPS作用于细胞的释放量,与空白组相比分别增加526.54%、40.54%、29.06%、35.00%,PEPI-1明显地促进了p38,ERK和JNK蛋白的磷酸化,从而激活了MAPK信号通路,表明PEPI-1具有良好的免疫调节活性,是一种良好的免疫调节剂。

  第五章PEPI-1碘代样品的制备、测定及多糖在大鼠体内的分布

  多糖类化合物在生物体内的检测一直是多糖类化合物研究的瓶颈问题,它严重制约着多糖化合物的药代动力学的研究。本章建立了一种新的生物体内测定多糖的方法,糖肽类复合物因其含有胺基或酪氨酸可同碘发生取代反应;对于不含有胺基的多糖类化合物,可通过制备它的FITC衍生物后,再进行碘代反应,生成稳定的、对糖类结构影响较小的碘代化合物。在同位素标记法进行糖的药代动力学研究中,以碘的放射性同位素对糖肽和多糖类化合物进行标记是经典的方法。

  本章采用碘代多糖的方法,通过ICP-MS测定碘的含量从而间接反应多糖的含量,有望建立一种新的简单、方便、可靠、适用范围广的糖复合物示踪和测定方法。

  材料与方法

  1试剂与仪器

  1.1试剂与材料

  吡啶、氯胺T、碘化钠、碘化钾、偏重硫酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾,均为北京化工厂;分析纯。异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC),成都西亚化工;Sephadex G-10,GE公司;四甲基氢氧化铵水溶液(TMAH),国药集团化学试剂有限公司;过氧化氢(H2O2),广东省精细化学品工程技术研究开发中心;铟标准溶液,中国计量科学研究院;水合氯醛;NaI,北京化工厂;20ml顶空进样小瓶,压盖器,瓶盖,均为美国安捷伦公司;

  1.2仪器

  仪器及型号生产厂家

  HZ-L台式恒温振荡器太仓市试验设备厂

  TL-5.0型台式离心机上海市离心机械研究所

  EYELAN-100旋转蒸发仪东京理化器械株式会社

  FD-1C真空冷冻干燥机北京德天佑科技发展有限公司

  SHB-循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司

  中压快速分离纯化制备系统Agela天津博纳尔杰公司

  754型紫外-可见分光光度仪上海佑科仪器仪表有限公司

  红外分光光度计美国珀金埃尔默公司

  漩涡振荡器北京海地清科技术服务仪器责任有限公司

  万分之一分析天平赛多利斯仪器有限公司

  电感耦合等离子体-质谱仪Angilent7100美国安捷伦公司

  KQ-250型超声波处理器昆山市超声仪器有限公司

  漩涡振荡器沃信仪器

  万分之一分析天平赛多利斯仪器有限公司

  2实验方法

  2.1 PEPI1的FITC标记

  PEPI-1样品1g,置具塞锥形瓶中,加10mL DMSO超声混匀,再滴加几滴吡啶。加入FITC 0.1g,再加入二月桂酸二丁基锡20mg,摇匀,95℃混合加热2h,放冷,乙醇沉淀到醇浓度85%,离心,弃去上清,反复清洗沉淀,干燥,得到复合物PEPI-1-FITC。

  2.2 PEPI1-F碘代物的制备

  样品1g,加5mL水,超声使之溶解,加入0.5mol/L NaI溶液2mL,震荡混匀,再加入氯胺T缓冲溶液(1g→10mL)5mL,震荡混匀1min,再加入偏重亚硫酸钠(1g→10mL)5mL,震荡混匀,最后加入碘化钾(1g→10mL)5mL,震荡混匀,离心(5000r/min,5min),取上清,备用。

  缓冲液的配制:磷酸氢二钠(71.6g→1000mL)溶液81mL和磷酸二氢钠(31.2g→1000mL)溶液19mL定容至1000mL量瓶中。

  PEPI1-F碘代物的纯化

  混合物通过中压色谱仪进行分离。上述上清液30mL,经过Sephadex G-10凝胶色谱柱(Ф5×50cm),水为流动相,流速1.0ml/min,20mL/管收集洗脱液。隔管以苯酚-硫酸法测定吸收度,以吸光度为纵坐标,管数为横坐标作图,按照洗脱图收集,回收,冻干,将碘代物命名为PEPI1-F-I。

  2.4 PEPI1-F-I的IR分析

  将PEPI-1、PEPI-1碘化物和KBr分别置真空干燥器中干燥24h,然后将样品分别与KBr研细,压片。

  PEPI-1碘代率ICP-MS的测定及方法学建立

  2.5.1样品处理

  称取PEPI1-F-I样品0.05g,置顶空进样小瓶,加入4ml水,依次加入3ml 25%TMAH和0.1mLH2O2,混匀,压盖器旋紧顶盖,80℃下超声30min,放冷,转移反应液至25ml量瓶,用1%TMAH溶液定容至25ml,摇匀,再取1mL上述溶液加1%TMAH定容至100mL量瓶,即得,样品溶液在进样前经过0.45µm滤膜过滤。

  2.5.3 ICP-MS条件及测定

  ICP-MS仪器的参考工作条件见表5-1。

  表5-1 ICP-MS仪器的参考工作条件

  Table 5-1 Reference working conditions of ICP-MS instrument

  Instrument parametervalue射频功率1550 W取样锥/截取锥1/0.4mm采样深度8mm雾化室温度2℃碰撞反应池气体5.0mL/min内标加入方式在线加入内标等离子体流量15 L/min稀释气流量0.60 L/min扫描方式跳峰载气流量/min测定当仪器真空度达到要求时,用调谐液调整仪器各项指标,使仪器灵敏度、氧化物、双电荷、分辨率等各项指标达到测定要求,引人在线内标Te,测定标准系列及样品溶液。

  其中,质谱调谐液配制:7Li、59Co、89 Y、140Ce、205Ti浓度均为10μg/l;

  铟标准溶液[编号:中国计量科学研究院]浓度为1.0 mg/ml,使用前用1%HNO3稀释为1.0 mg/l做内标溶液。

  2.5.4标准曲线

  取NaI适量,加1%TMAH溶液配制成1mg/ml的NaI标准储备溶液。再将标准储备溶液分别稀释至5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml碘标准工作溶液。按照上述色谱条件进样,记录数值,以碘的含量为横坐标,数值为纵坐标,绘制标准曲线。

  2.5.5精密度

  准确称取0.05g样品PEPI1-F-I,处理过程同2.5.1,重复测定7次,记录数值。

  稳定性

  上述精密度的样品分别在0、2、8、16、24h分别测定,记录数值,计算RSD,考察样品溶液的稳定性。

  重现性

  取同一批次碘代后的多糖样品,准确称取0.05g,共6份,按照2.5.1方法处理,计算碘代率。

  2.5.7加标回收率

  本方法以碘代银耳多糖为试样进行回收率实验,准确称取0.05g碘代银耳多糖,共6份,选择其中三个离散较小原始数据进行计算,每份添加1mg/ml碘化钠标准溶液0.5ml,每份处理过程同3.3.1.2,但将3.3.1.2步骤中滤液稀释100倍改为稀释1000倍,进样。

  三批碘代多糖样品的测定

  PEPI1分别经过三次碘代的过程,得到三批碘代多糖。按照样品处理的方法处理样品,通过ICP-MS检测。

  2.6 PEPI1-FI在生物样品中的含量及分布

  2.6.1实验步骤

  SD大鼠,适应性喂养3天后,随机进行实验。实验前禁食12h,自由饮水分为实验组和空白对照组,每组10只大鼠,实验组灌胃给予PEPI1-FI(第一批),给药剂量为0.1g/100g;空白组给予生理盐水。1h、2h时分别眼眶取血约1mL,3h时腹腔注射10%水合氯醛麻醉后,腹主动脉取血约1mL,取心、肝、脾、肺、肾。称量鲜脏器后,将上述脏器和血液分别冻干。

  2.6.2血液样品及脏器样品的处理

  将冻干后的脏器分别称重,将脏器研磨。取血液1mL,各脏器粉末分别取100mg,分别置顶空进样小瓶,按照2.5.1项下处理,至“用1%TMAH溶液定容至25ml,摇匀”,即得,样品溶液在进样前经过0.45µm滤膜过滤,按照2.5.3项下条件测定。

  结果与讨论

  1.碘代多糖的制备

  1.1 PEPI1的FITC标记

  糖蛋白中的酪氨酸与NaI可以发生反应,PEPI1中不含有蛋白,不能与NaI反应,故本实验先将多糖与FITC反应后,再将多糖-FITC复合物与NaI反应。本实验中PEPI1与FITC反应后,醇沉得到多糖-FITC复合物,为了去除未反应完全的FITC及其它试剂,反复清洗沉淀,干燥,该物质呈黄绿色。

  1.2 PEPI1-F的制备及纯化

  碘代后的样品经过凝胶柱洗脱,去除小分子物质,包括没有碘代上的游离碘,以免干扰后续的测定。绘制洗脱曲线(图5-1),图中外水体积出有1个峰,分子量大的物质,为碘代多糖,小分子物质应在内水体积处,与碘代多糖有较好的分离。

  图5-1 PEPI1-FI洗脱曲线

  Fig.5-1 The elution curve of PEPI1-FI

  2 PEPI-1碘代率的ICP-MS测定及方法学建立

  2.1样品处理方法的考察

  生物样品在测定之前要进行消解,本试验采用TMAH-H2O2消解液进行超声提取,其提取液澄明度较好;我们还曾考察过微波消解法,测定的结果与上述方法基本一致,故我们选择了TMAH-H2O2提取液消解的方法,此方法完全可以消解生物样品,且操作简单,重复性好。

  2.2标准曲线

  实验结果见表5-2和图5-2,测得工作曲线的标准方程为y=1.0058×+0.1001 R=0.9999,说明,NaI在0-300ng范围内线性范围较好。

  表5-2标准曲线测定结果

  Table 5-2 The results of standard curve

  concentration(ng/ml)Measured concentration(ng/ml)0054.8821010.1165051.42710099.801300301.95

  图5-2标准曲线

  Fig.5-2 Standard curve

  2.3精密度

  实验结果见表5-3。结果,RSD为2.94%,说明仪器的精密度良好。

  表5-3精密度测定结果

  Table 5-3 The precision result

  Times123456RSD(%)Value(ng/mL)130.8131.16132.98133.27138.26140.452.94

  2.4稳定性

  实验结果见表5-4。结果,RSD为2.69%,说明样品稳定性24h之内良好。

  表5-4稳定性测定结果

  Table 5-4 The stability result

  Time(h)02.08.016.024.0RSD(%)Value(ng/mL)135.36138.97140.12135.47132.282.69

  2.5重现性

  实验结果见表5-5,由结果可知,平均的碘代率为0.69%,相对标准偏差为4.8%。说明此方法重现性良好。

  表5-5重现性测定结果

  Table 5-5 The reproducibility result

  Times123456RSD(%)Value(ng/mL)145.13131.23138.52130.98146.69137.94138.424.80

  2.6回收率

  实验结果见表5-6,从表可知,加标回收率均在80%-120%之间,RSD值小于5%。

  表5-6加标回收率测定结果

  Table 5-6 The result of recovery rate

  加标量(mg)原始测定值(ng/ml)折算值(mg/50mg)回收率(%)0.527.050.689889.010.526.510.676087.220.527.630.704690.920.525.980.662585.48

  2.7样品的测定

  三批样品的测定结果见表5-7。

  表5-7三批样品的测定结果

  Table.5-7 Determination results of three batches of samples

  Batchs123Value(ng/mL)136.89145.78132.01138.23Iodine substitution rate(%)0.680.730.66

  以上结果说明,三批碘代多糖的碘代率基本一致,故进一步说明此方法具有可行性。

  3.PEPI1在大鼠体内的分布

  3.1不同时间大鼠血液中PEPI1-FI的含量结果

  一般情况下,大鼠的血容量占体重的7.4%,大鼠平均体重190.20g(给药量:192.20mg),故大鼠体内全血量为14.1ml,不同时间血液中PEPI1-FI的含量如表5-8。

  表5-8不同时间大鼠全血中PEPI1-FI含量

  Table 5-8 The content of PEPI1 in whole blood of ratsat different time

  Time1h2h3hIodine content*(µg/ml)0.150±0.520.230±0.630.230±0.84Iodine content/1mL(µg)3.7525.7605.755PEPI1-FI content/1mL(mg)0.550.850.85Whole blood content(mg)7.7811.9411.92The absorption rate of PEPI1-FI4.09%6.28%6.27%Note:*the value have been deducted from the value of the blank control.

  结果如上表可知,大鼠给药后1h时吸收入血率最低,随着时间的增加,入血率也随之增加,3h吸收入血率趋于稳定。

  3.2碘代多糖3h后在大鼠脏器中的分布情况

  大鼠给药3小时后,PEPI1-FI在大鼠内脏中的分布情况见表5-9。

  表5-9 PEPI1-FI在3小时大鼠各中的分布

  Table 5-9 Distribution of PEPI1-FI in the visceral organs of rats in 3 hours

  visceraheartliverspleenlungkidneyDry weight of viscera(g)0.14±0.211.79±0.450.15±0.362.10±0.560.41±0.72Iodine content*(ng/ml)7.771±0.6932.210±1.0263.471±0.913.627±0.5667.673±0.25Iodine content/100mg(µg)0.1940.8051.5870.0911.692PEPI1-FI content/100mg(µg)28.57118.43233.3313.33248.78PEPI1-FI content/viscera(mg)0.042.120.350.281.02Note:*the value have been deducted from the value of the blank control.

  如上表所示,PEPI1-FI在3h时在各脏器中均有一定的分布,主要脏器中PEPI1-FI分布由高到低顺序是肝>肾>脾>肺>心。主要内脏碘代多糖的含量为3.81mg,脏器中的药物吸收率为2.00%

  结论

  1.本实验建立了一种在生物体内测定多糖含量的方法。此种方法采用将多糖碘代后,通过ICP-MS来测定碘的含量来间接反映生物体内多糖的含量。此种方法操作简单,检测限低,重现性好。目前最常用的测定生物体内多糖的方法有放射性同位素标记法及荧光光度法。放射同位素法虽然检测灵敏,但是对实验要求的条件极高,且同位素污染不易去除,影响测定的准确度;荧光光度法样品干扰严重。

  2.通过我们建立的生物样品中并进行了方法学考察,标准曲线为0-0-300ng,测得工作曲线的标准方程为y=1.0058×+0.1001,R=0.9999。说明线性范围良好,通过精密度、稳定性、重现性、回收率的考察,RSD均在合理范围内,我们测定了三批碘代多糖样品,其碘代率分别为0.68%、0.73%、0.66%,碘代率基本一致,说明此方法具有可行性。

  3.我们分别测定了1h、2h、3h大鼠血液中碘代多糖的含量及3h时碘代多糖在大鼠各主要脏器的分布情况。结果表明大鼠给药后1h时吸收入血率最低,随着时间的增加,入血率也随之增加,3h吸收入血率趋于稳定,为6.27%。PEPI1-FI在3h时在各脏器中均有一定的分布,主要脏器中PEPI1-FI分布由高到低顺序是肝>肾>脾>肺>心。主要内脏碘代多糖的含量为3.81mg,脏器中的药物吸收率为2.00%

  结论

  1、采用传统的水提醇沉法、Sevage法除蛋白分别得到白玉菇、杏鲍菇、真姬菇、口蘑、平菇五种真菌粗多糖,它们的总糖、酸性糖、蛋白质含量分别为49.3%、48.1%、51.2%、56.7%、53.9%;1.59%、0.84%、1.68%、2.27%、2.33%;1.25%、1.68%、0.31%、0.58%、1.6;五种真菌粗多糖的组成糖均含有Man、Glc、Gal,但比例不用,Glc的含量均最高,除杏鲍菇粗多糖外,它们都含有酸性糖,但酸性糖的含量很低。体外免疫调节活性实验结果表明,五种真菌粗多糖均能够促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖,对NK细胞具有一定的杀伤作用及促进巨噬细胞的吞噬作用,且当它们的浓度均为10µg/mL时,对均没有明显的作用。当它们的浓度为100µg/mL、1000µg/mL时,五种真菌粗多糖对淋巴细胞的增殖、NK细胞的杀伤及巨噬细胞的吞噬作用均具有显着性或极显着性的影响;其中杏鲍菇粗多糖在上述三种作用中活性最好。

  2、将杏鲍菇粗多糖通过混合离子交换树脂及和Sephadex G-50进行分离纯化得到两个均一多糖PEPI-1和PEPI-2。PEPI-1和PEPI-2总糖含量分别为85.75%、92.79%,几乎不含有酸性糖及蛋白质;组成糖结果显示,PEPI-1由Man、Glc、Gal组成,且比例为2.1:1.1:3.2,PEPI-2仅由Glc组成;HPGPC结果表明,PEPI-1和PEPI-2均为均一多糖。

  3、通过IR、甲基化、LC-M、NMR等方法研究PEPI-1的结构,结果表明,PEPI-1主链核心部分主要由→1,6)-Galp和→1,3)-Glcp构成,→1,3,6)-Manp和→1,2,6)-Galp为分支位点,→1)-Manp为非还原末端;PEPI-2为1→6连接的葡萄二糖。

  4、PEPI-1的免疫活性表明,不同浓度的PEPI-1能促进RAW264.7细胞的吞噬能力,当浓度为10µg/mL时,可以促进免疫相关因子NO、IL-1、IL-6和TNF-α的释放。Western blot结果显示,PEPI-1明显地促进了p38,ERK和JNK蛋白的磷酸化,从而激活了MAPK信号通路,从分子水平上调节了免疫分子的表达水平,进一步发挥了免疫调节作用。

  5、本实验建立了一种新的生物体内检测多糖的方法,该方法通过多糖与FITC反应生成多糖-FITC复合物,再与NaI反应生成多糖-FITC-I复合物,该复合物通过ICP-MS测定样品中碘含量来反映多糖的含量并通过了方法学验证。该方法测定了三批碘代多糖的碘代率分别为0.66%、0.73%、0.68%。我们分别测定了1h、2h、3h大鼠血液中碘代多糖的含量及3h时碘代多糖在大鼠各主要脏器的分布情况。结果表明大鼠给药后1h时吸收入血率最低,随着时间的增加,入血率也随之增加,3h吸收入血率趋于稳定,为6.27%。PEPI1-FI在3h时在各脏器中均有一定的分布,主要脏器中PEPI1-FI分布由高到低顺序是肝>肾>脾>肺>心。主要内脏碘代多糖的含量为3.81mg,脏器中的药物吸收率为2.00%

  结语

  白玉菇等五种真菌粗多糖,它们的理化性质相近,均具有一定的免疫调节活性,其中杏鲍菇粗多糖的活性最好;对它进一步分离纯化,得到两个均一多糖,我们将结构进行表征,并初步探讨了活性多糖对RAW264.7具有免疫调节作用的机理;建立了一种新的生物体内测定活性多糖的方法,并初步考察了活性多糖吸收入血及脏器分布的情况。

  通过对以上问题的研究,为杏鲍菇的进一步开发利用及构效关系的研究打下了基础。建立了一种新的生物体内检测多糖含量的方法,为药代动力学的瓶颈问题提供了新的手段和方法。

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