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动力学类论文 硅胶柱层析纯化灵菌红素的工艺优化及动力学研究

2018-12-13 11:51:08来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要

  灵菌红素是具有由三个吡咯环重组的甲氧基吡咯架子结构的次级代谢物。出于它拥有特殊的抗癌活性被广大研究机构重视。距今为止,紫外分光光度计法是依然是测定灵菌红素的首要方法。想要快速精准的测定发酵液中灵菌红素的含量,本实验过程中采纳的流动相体系是水和甲醇的高效液相色谱法来快速测定灵菌红素,同时利用制备型高效液相色谱少量制备高纯度样品。

  本课题的研究目的是通过对硅胶柱层析纯化灵菌红素的动力学过程进行研究,指导使用制备型高效液相色谱提纯出纯度较高的灵菌红素。

  (1)通过对灵菌红素的吸附性能进行实验研究与分析,利用Langmiur模型灵菌红素的等温吸附曲线进行较好了拟合,相关系数R2可以达到0.9866,洗脱曲线能较好拟合灵菌红素的洗脱过程,洗脱率可达93.45%。

  (2)通过对灵菌红素吸附动力学探讨,从而指导制备型高效液相色谱最佳条件研究,通过对流动相、流速、上样量、温度等条件的调节与摸索,结论:SB-C18(9.4mm×25cm,5×10-3mm)的制备型高效液相色谱的最好制备条件是流动相结构(甲醇:水=51:49)、流动相速率(2×10-3 L/min)、上样量(2×10-5 L)、温度(25℃)。制备灵菌红素的纯度较高,速度较快。

  关键词:灵菌红素;动力学;等温吸附曲线;洗脱曲线;制备型高效液相色谱

  第1章文献综述

  1.1灵菌红素概述

  灵菌红素它具有Prodiginin的基本构造,包涵3个吡咯环结构,它内部的一个吡咯环第二个碳上包含一个甲基,戊基在第三个碳上面。灵菌红素的颜色为深红色。能够制造灵菌红素的自然界细菌中主要有粘质沙雷氏菌(Marcecens of serratia),此外还有些海洋细菌、以及少数的放线菌(Streptomyces coelicolor)能够生产灵菌红素。

  自然界中灵菌红素归类为两类通过对灵菌红素的C吡咯环上的某些基团结构相关变化分析,包括环状prodigiosin与非环状prodigiosin;环状灵菌红素概括:MAMPDM,cyclo-nonyl prodigiosin,metacylo prodigiosin,甲基环丁基灵菌红素,streptor-ubin B等;不为环状灵菌红素包含:prodigiosin of undecyl,灵菌红素(prodigiosin)。另外还涵括在大自然中生成的近似灵菌红素聚合物,比如蓝色四吡咯物质(tetrapyrrole of blue),tambjemine类聚合物。最近研讨显示,在一定浓度限度内的灵菌红素类聚合物展现出优异的免疫抑制能功能及抗癌能力,以及完全不同于当前的临床药物引起细胞凋亡的机理。

  随着这些年对灵菌红素的研究,发现其有良好的抗癌效果,越来越来的机构和组织开始研究灵菌红素的功效。灵菌红素及其家族类似物能很好的凋亡癌细胞而对正常细胞基本没有毒性,是很有前景的抗癌药物。同时发现,除了诱导癌细胞凋零死亡,灵菌红素能有效地抑制癌细胞侵袭和转移。灵菌红素可以和细胞外表的特异位点接合,阻隔信号转移的γ链,从而表现出免疫抑制癌细胞的活性。灵菌红素能对T细胞介导的免疫反应起抑制作用,同时对B细胞无明显影响。有研究表明,灵菌红素与当前常见的免疫药物有不同的抑制免疫机制。另外,灵菌红素也表现出抗菌、防疟疾等多种效果。由于这种新颖结构灵菌红素新化合物具有的抗肿瘤活性,对正常细胞的低毒性,已经是抗癌药物首选之一,并且有合成许多相关衍生物。

  1.1.1灵菌红素化学结构概论

  灵菌红素(Prodigiosin,PG)的生物合成途径分为独立的两部分MBC(2’-三吡咯-5-乙醛,3-乙氧基-2)和—MBP(3-乙基-4-正丙基-吡咯)合成方法。2-锌稀醛是MAP起源,经丙酮酸盐脱羧,最后形成环,经过氧化产生。β羟基丙氨酸、吡咯烷酮羧酸、思美泰和乙酸盐是MBC最初的原料,由丙二酰辅酶A的脱羧作用,羟基甲基化由思美泰,β羟基丙氨酸的缩合而形成。MBC和MAP结合生成PG。

  1.1.2灵菌红素理化性质

  (1)抑菌效能:对许多细菌及真菌PG的体外试验显示,都有抵制细菌生长的能力。PG在合适的浓度下能抵制肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae),酿脓链球(Streptococcus pyogenes),唾液链球菌(Streptococcus salivarius),金黄色葡萄球状菌(S.aureus),杆菌(E.coli),假白喉棒状杆菌(Pseudodiphtheria bacillus)等的生长。研究表明34株福氏志贺氏菌和14株金黄色葡萄球菌对PG表现强烈的抵制作用[4]。

  (2)抗癌效用:肌动蛋白结构的重组可以由PG能够引发,特别显著的抑制效果是对乳腺癌,肝癌,肠癌细胞株和骨髓白细胞等。最近的研究表明,PG对黑素瘤的LC50为0.04 mM,同时对61种人癌细胞的LC50值为2.2nM,该研究结果显示出抑制作用具有的高效性。同时有学者发现(IC50=225 nM)PG对血癌细胞系研究表明的增殖具有抵制作用,凋亡蛋白酶(caspase)与此抵制作用有联系。引导细胞凋亡还对H+-ATP酶(V-ATP酶)的质子转运活性与其介导H+/Cl-的跨膜协同运输从而解偶联,从而癌细胞pHi改变。在Cl-存在的条件下,选择性地转移H+和Cl是由PG能根据胞内外Cl-浓度决定,从而导致引起细胞凋亡是,由于胞内外的pH发生改变。而有关研究发现当PG在低浓度时(<100nM),而不引细胞的凋亡(能可逆的引起pHi的改变);灵菌红素在高浓度时(大于49 nM),可以造成细胞消亡而且不可逆转的。虽然这种机理还需要进一步研究说明,但新型药物研发的基础可建立在这种抗癌机理模型的上。

  (3)感光性:灵菌红素在光照条件下不稳定,有学者的研究已经表明PG具有感光性,未来可用于光启活的抗癌药物应用。放在日光下5 h的PG,会在日光下与氧气反应,(IC50=2.5+0.2 mM)表现具有抑制现象对于早幼粒白细胞,在无可见光的情况,灵菌红素IC50仅为6.6+0.1 mM。在含有电子的吡咯骨架Cu2+存在下,使去质子化与Cu2+的PG结合产生Cu·(PG)2,通过π-自由基阳离子形成核酸酶活性。PG与Cu2+结合的能插入DNA链中并引起双链的解链是其作用机制。此时均以氢键与金属离子结合的PG中的三个N原子与Zn2+不同的,进一步产生过氧化氢(H2O2)是由该结构过氧化阴性带电离子(O2-)是由水溶液中的分子形态的氧气(O2)产生,Cu·(PG)2与双氧水的彼此间的化学反应促使DNA分解。

  图1.1灵菌红素及生产菌株

  Table.1.1 Prodigiosin and production strains

  1.2天然产物分离提纯技术

  1.2.1液-固萃取法

  液-固萃取法又称浸取法、浸出法,又包含的是索氏提纯法(Soxhlet extraction)、超声波提纯法(ultrasonic extraction)、浸取法(maceration)和微波提纯法(microwave extraction)等等。其中,分别借助微波和超声波所提供的能量来提高萃取溶剂效能的提取法是微波和超声波提取是。索氏提取法是采纳索氏提取器作为提取手段的方法。索氏提取法和溶剂浸取法虽很陈旧,但是仍然广泛的运用实际中。因为这两种方法可以检测样本很大,操作比较简便,很容易可以运用在实际分离实验中。在天然产物提纯分化的应用中微波提纯法和超声波提纯法也能发挥很大作用。升温搅拌提纯法、索氏提纯法的溶剂回收比例与微波辅助提纯法的溶剂回收比例很接近。但提纯速率在微波辅助下能够大大提高。同时还发现提纯的物质在超临界CO2表现出橙色,所得物质颜色比其它提纯方法浅,但是与以往方法相比还是具有相当的优势。

  索氏提取法、普通的浸取法同微波或超声波提取法原理上基本相似,但提取速率和效率由各种方法所不一样。天然产物粗提方法运用最广泛的就是液-固萃取法。

  1.2.2液-液萃取法

  液-液萃取法在溶液混合物中加入与其不相互相溶(或稍相溶)的选定的溶液,运用溶剂中某些成分在的不同溶解度而达到提纯目的。此外,得到粗提纯物在药物学研究中,为了快速获得所需的活性组分可以通过液液萃取法定向分离得到。

  植物学家通常使用的方法就是液液萃取法,通过不同极性的不同溶剂,这些溶剂可以溶剂所需要的特定组分,再用其他方法将其分离开来,运用现在高端技术分析其生物活性及其化学机构。此外,提纯天然产物也常用溶液萃取的办法,比如,提取液中的油脂成分通常使用非极性溶液萃取出来等等。

  1.2.3蒸馏法

  用蒸汽直接通入芳香原料的料层或者直接将植物组织放在沸水中加热,让水蒸气蒸出的同时带出植物组织中的精油成分的分离方法称为水蒸汽蒸馏法(wet distillation或stem distillation)。当原料表面与水蒸气或沸水接触时所产生的“水散”作用,使得组织内部的精油扩散至物料表层。得到的混合蒸汽在进入冷凝器冷凝后,再经过油水分离处理,最后浓缩得到精油。由于水蒸汽不断带走表面油气化气化组分,所以直到芳香油组分几乎全部散发至表面而该扩散过程依然能持续进行。

  由于产生的不互溶系统是水与精油构成的,升温以后,水和需要的精油在该条件下快速的变成气体,形成混合的蒸汽,通过冷凝器处理该蒸汽混合体得到精油和水的混合液体,最后得到的精油是经过水油分离处理而来。

  1.2.4大孔树脂法

  采用吸附剂为大孔树脂进行分离纯化的方法称为大孔树脂吸法。用大孔树脂吸附待分离的溶液,然后经过溶剂的洗脱,富集洗脱获得的成分。该方法在现实生产生活中有良好价值,运作方法简便,价格低廉。在中药有效成分的提取中运用该方法取得了良好的效用。这些年来,药物有效成分的分离与精制已经普遍应用了大孔树脂法。最近有研究表明,分离竹叶黄酮使用的是大孔树脂吸附法,其中竹叶黄酮的提纯最合的适是AB-8树脂,黄酮提取物含量提高1倍以上通过使用AB-8树脂吸附分离。同时脑黄金口服液通透度大幅提高经大孔树脂法提纯。最近,大孔树脂法精制纯化苷类、黄酮类、生物碱类成分在已运用纯熟。随着相关行业、法规的明确与整齐,相关科学研究的投入,未来成为形成中药现代化的强劲动力肯定是大孔树脂化技术。

  1.3天然产物分离提纯的应用的液固色谱

  1.3.1原理

  柱层析色谱法利用相对运动的两相作,而由于溶液气化压、物质化学结构、物质溶解度、离子交换或吸附能力等物理化学微小差别,这些会造成不同的分配系数存在于待分组分在固定相和流动相相互之间,形成多次连续分配在待分组分在两相间,从而待分组分与其中的杂质分离开的分离方法。

  可以将色谱分为下面几类,是按物理化学原理进行的分离过程区分:分配色谱检测法、吸附色谱检测法、离子对色谱检测法、离子交换色谱检测法、络合色谱检测法、凝胶色谱检测法以及亲和色谱检测法。

  运用待分离组分溶解程度在流动相溶液与固定相之间的细微差别来实现分离纯化。使用液相的溶剂用作为分配色谱的固定相的方法为分配色谱检测法(partition chromatography)。

  利用吸附能力中固定相吸附对物质分子差异促成对混合物的分离纯化,目标成分与流动相成分争夺固定相吸附位点的过程称为吸附色谱检测法(adsorption chromatography)。

  (3)利用在两相中的具有不同的分配系数的样品离子与带有相反电荷的离子形成的离子,运用该系数的差异分离离子化合物的方法为离子对色谱检测法(ion-pair chromatography)。

  利用固定相组分是离子对交成分,拥有阴阳电荷与这些带电功能团通过静态电荷相互作吸引用的结合的分离方法为离子交换色谱检测法(ion-exchange chromatography)。

  (5)利用络合聚合物功能差别进行分离纯化的色谱方检测法。在固定相成分中加入能与被提纯组分形成络合聚合物的组分。试样通过时,各组分生成的络合物稳定性不同被分离。分离纯化各组分,通常用于分离金属或金属的方法为离子络合色谱(complexation chromatography)。

  (6)利用高聚物的相对分子质量分布测试以及相对分子质量分级分析。根据分离的对象的极性,又可分为凝胶渗透色谱(GPC)和凝胶过滤相对分子质量分级分析色谱(GFC),该方法称为凝胶色谱(gel chromatography)。

  (7)利用分离分子结合固定相的特性的一种分离方法为亲和色谱(Chromatography of affinity)。亲和色谱能有一定结合能力的分子存在于凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质,这种可逆的结合,依旧能相互分离开在改变流动相条件时。蛋白质和各种生物大分子活性物质的分离、纯化是它的主要用途。色谱法能大致分为五大类通过对色谱两相的理化状况分析:超临界流体色谱(Chromatography of super critical fluid)、气液色谱(GLC,chromatography of gas-liquid)、液固色谱(LSC,chromatography of liquid-solid)和液液色谱(LLC,chromatography of liquid-liquid)、气固色谱(GSC,chromatography of gas-solid)。用固体吸附剂为固定相是液-固吸附色谱,吸附剂一般是表层存在许多吸附位点固体颗粒状物质。液固色谱实质是根据吸附作用力不同,其物质在固定相上作用力也不同的来进行分离的。典型液相色谱由于分离效率差,纯化速率慢,在很长的时间内都很少有人研究。直到近代,学者设计出克服传统液相色谱缺点:设计、使用体积小、高灵敏度的检测器;加快流动相的流动速率时选用高压泵;选用微粒固定相提高层析柱效,这些都是在大量实验与摸索同时参考了气象色谱的高灵敏度、高速、高效优点的得到的创新。后来在1969年,发展成现代高效液相色谱(chromatography of modern liquid)是在经典液相色谱基础上,称为高压液相色谱(HPLC,chromatography of high pressure liquid)、高效液相色谱(HPLC,chromatography of high performance liquid)或高速液相色谱(HSLC,chromatography of high speed liquid);如今,高效液相色谱(HPLC)一般性通称。现在这五类液相色谱如快速分析色谱、常压分析色谱、中压分析色谱、低压分析色谱和高压液相分析色谱(HPLC)是根据操作压力范围划分。

  1.3.2传统液-固色谱

  通常传统液-固色谱法(或通常通俗上的层析)的概念是以硅胶为固定相的吸附色谱。极性固体吸附剂的液固色谱的固定相通常使用如硅胶、氧化铝等等。双分子或者单分子溶剂吸附层是由于流动相极性不同,在固体吸附剂表面形成。色谱体系加入样品分子,分离选择性和溶质保留定于:①样品分子在流动相溶剂中的溶解度;②吸附剂表面上相应吸附中心与溶质分子的各种官能团间的特殊作用,涵括了氢、偶极和诱导作用以及电荷迁移或形成π络合物;③吸附剂表面吸附活性点是溶质和溶剂分子之间的竞争。

  样品分子在体系中的吸附-脱附过程属于热力学平衡过程范畴,条件是在一定浓度范围内,以下两个因素决定溶质分子X吸附力大小:①溶质吸附能力;②吸附剂外部上被吸附的表面与未吸附相对容积。前面的原因是取决于样品分子的分子结构和流动相的理化性质与吸附剂的理化结构性质;后面的原因主要取决于表面吸附剂的比表面积和吸附单分子层厚度。

  流动相(m)中洗脱出来溶质分子(X),是经过竞争吸附,溶剂分子(M)附着在固定相(s)上被洗脱的,如(1-1)式所示:

  (1-1)

  式中,由于从吸附剂表面被X吸附交换出来的溶剂分子个数是n。只有解吸足够量的溶剂分子,才能替换出溶质X。相对吸附作用在X在吸附剂表面容量因子k的值,是溶剂分子和样品分子中各种官能团间吸附能之差决定因素。当吸附剂表面和溶剂分子之间足够大的吸引力的时候,该反应平衡向左移动,流动相中存在大量样品分子,固定相很难保留住它们。如果固定相上保留样品,是因为吸附剂样品与分子作用力很强使反应平衡向右移动。

  硅胶填料、活性炭填料、氧化铝填料和聚酰胺填料等是最常用于液-固色谱中的吸附剂,简单介绍一下它们理化特性:

  (1)硅胶填料

  一般最常用的吸附剂就是硅胶填料,将盐酸加入硅酸钠的水溶液中得到一种絮状沉淀,其实是缩水硅胶的一种。硅胶填料可作为吸附剂或脱色剂,多孔性硅胶通常用这种沉淀部分脱水形成,一般的色谱用硅胶平均孔径约为110nm,外表面积约为450m2·g-1,硅胶微孔间隙体积约为0.5mL·g-1通常用SiO2·xH2O表示。

  图1.2硅醇基示意图

  Fig.12 Silanol schematic

  表面具有很多硅醇(silanol)基团是硅胶的吸附机理的原因,表示如图,其中(3)为游离型,(2)为活泼型,(1)为束缚型。是通过极性化合物或不饱和化合物与硅原子上-OH基团与形成氢键而吸附,得到是三种类型羟基,其吸附能力为(2)>(3)>(1),吸附作用由溶质分子与羟基可形成氢键而产生。含水量决定了硅胶吸附能力大小,含水多者硅胶中,组分分子的吸附能力从而减少是大部分羟基与水分子形成氢键结合导致。

  吸附能力非常弱的硅胶(当游离水含量达到18%以上时)只能作为固定相用于分配色谱。所以硅胶吸附能力下降时是吸附水分变成水合硅醇基的硅胶,但是硅胶能去掉水分而增加活性只需加热到105℃左右时。

  (2)聚酰胺填料

  由酰胺缩聚形成的高分子化合物称为聚酰胺,聚己内酰胺是色谱中通常使用的的玻璃纤维增强聚酰胺-6,分子式如下:

  一般尼龙-6(英)或锦纶(中)是聚酰胺商品名。使用在色谱柱中非晶形粉状的聚酰胺粉是白色多孔的,在一般的有机溶剂和水中不易溶解,在酚类、蚁酸,甲酰胺、醋酸和二甲基甲酰胺中升温易溶。

  通常来讲下列原因与聚酰胺的吸附力强弱有关:邻位官能团使吸附作用力减弱,对、间位官能团使吸附作用力增强;聚合物能形成氢键的基团多者,吸附能力强;能形成分子内氢键的聚合物会使吸附能力减弱;芳核、共轭双键多时吸附能力强。各类化合物与聚酰胺的吸附能力强弱也不同是因为它们与聚酰胺形成氢键的能力不同。

  化合物羟基(或羧基)与聚酰胺的羰基形成化学氢键。很多酰胺基存在于聚酰胺分子内,可与硝基化合物、酚类、醇类形成氢键,因而对这些物质产生吸附作用。而聚酰胺的氨基与硝基化合物的硝基、醇类的羟基基均能形成氢键。

  一般100µm粒径的多孔吸附剂多用于传统的液相色谱柱的固定相,11~21mm一般是其内径。由于固定相粒径较大,流动相在该体系中的轴向扩散与传质阻力较高,导致柱效一般较低,通常为几十个塔板。通过色谱柱固定相的流动相一般只在重力作用下进行的,从而分离过程经常需要若干小时,分离速率较低。

  通常说来,氢键的能力最牢固的是聚合物与聚酰胺在水中形成,聚合物与聚酰胺在有机溶剂中形成氢键的能力微小,氢键的能力最微弱的是化合物与聚酰胺在pH大于7的溶剂中形成。溶剂溶质与聚合物与聚酰胺生成氢键的能力相关。

  (3)活性炭填料

  活性炭色谱法具有纯化效果较好、处理样品容量大、较容生产获得、价格较低的优点,在分离水溶性化合物应用广泛。活性炭内部间隙许多,具有非极性的表层,所以活性炭的吸收容量大。它的内部间隙结构与吸附性能息息相关,而其间隙结构又有若干大小的区别,吸附容量和吸附能力都很大的化学纯等级活性炭才用于色谱柱中。

  通常湿法上柱运用于活性炭吸附色谱柱,水作为它首选溶剂是由于活性炭在水中的吸附能力较好。活性炭泡在水中并不混匀赶走多余空气,混匀后慢慢加入到色谱柱中,活性炭在重力作用下沉淀,最后液面不再下降为止。将样品用水溶解加入装好的色谱柱,流动相可以选用有机溶剂与水的混合液来调剂极性,如果洗脱速率不理想,可以采用加压的方式加快洗脱。活性炭色谱制备方法及工艺复杂,并且测定活性炭级别的方法也不明晰,对实验制备过程增加工作量,所以活性炭柱色谱法应用于分离提纯方面并是那么多元化。

  (4)氧化铝填料

  工业上一般是使用高温脱水氢氧化铝制备氧化铝,它可作催化剂或者吸附剂的载体,在色谱柱填料中也经常见到。根据分离的对象不同,氧化铝分为酸性(pH4.1~5.1)氧化铝、中性(pH7.1~7.4)氧化铝、碱性(pH9.1~10.1)氧化铝三种,选择合适的氧化铝作为填料进行分离。

  目前尚不知晓氧化铝的作用原理,猜测是吸附了空气中水分的氧化铝表层生成了铝羟基,这些铝羟基可以与被吸附物形成氢键。

  1.3.3高效液相色谱(HPLC)

  硅胶高效液相色谱,顾名思义就知道是它的填充剂是硅胶。它可以两大类:液-液分配色谱(Chromatography of liquid-liquid partition)和液-固吸附色谱(Chromatography of liquid-solid adsorption)。在液-液分配色谱中,运用硅胶粘合液体的固定相;在液-固色谱中,直接使用硅胶作为固定相。由于越来越多的键合相色谱,高效液-液色谱以硅胶为固定相的实际价值已经不再具备优势。

  在当代色谱界,烃类键合或非极性键合相色谱主要应用就是反相高效液相色谱。硅胶外表层通过分子间作用力与有机固定液整合称为键合色谱。反相高效液相色谱(RP-HPLC)就是一种键合相色谱。分配保留机理和吸附理论的争论是键合色谱出现开始就一直存在的。在很多时候,溶质保留过程以及各种影响因素不能笼统的用吸附分配概括。反相色谱固定有机相使用是烃基键合化合物,目前C22、C18、C16、C6、C4、C8、C2等是使用最广泛的长链烃。同时还有多环芳烃和苯基。其中十八烷基键合硅胶(silane of octadecyl)使用最广泛的,一般称为ODS固定相。流动相的性质与组成影响着着两类基团的相互作用,同时与溶质本身的结构也有关系。保留机理也随着流动相组成的变化不尽完全相同。烃类键合固定相兼具极性的硅烃基和又有非极性长链烃基,同时非极性固定相与溶液中溶解物质之间相互作用力几乎忽略,溶剂的极性才是分离选择性的决定因素。

  其保留机理我们能用疏溶剂理论(theory of solvophobic)解释反相色谱的。键合烃基有凸凹不一的外层,在某些情况,如缺乏水分情况下,保留极性溶液的就是外层烃基。设定非极性有机作用体的有机层是匀称分布的,由于溶剂效应的溶质保留,相反相色谱的保留作用可以用高含水量流动较好解释。“亲硅醇基效应”(silanophilic interaction)是由于正电荷离子或氢质子与pH小于7的硅羟基能相互作用。因此,溶质保留除外亲硅醇基作用还存在疏水作用,该作用是由这种“双保留机理”决定的。

  液-固色谱在其它操作压力范围内的,有中压液相色谱、低压液相色谱和快速色谱,系统压强在经典液-固色谱和高效液相色谱之间,固定相填充剂的粒径也介于高效液相色谱和经典液-固色谱之间。与此相对应,在这些色谱中,介于高效液相色谱和经典液-固色谱之间的还有色谱柱效率和流动阻力。

  高效液相色谱能分离性质极相近的同分异构体或多组分纷繁的混合物。一般微粒固定相粒径采用4~10µm,柱效高,传质快,可达21000~82000塔板⋅m-1。流动相快速通过固定相是由于HPLC使用高压泵传递流动相,压力差明显,它的柱前压一般为19~148Kg⋅cm-2。

  1.4制备型液-固色谱的发展简介

  1.4.1理论基础

  制备色谱是最先出现的色谱法,它的主要作用是要制备更纯的物质,并且具有纯化速率,精准的分离位点,通常用于制备大量的难以分离的物质。制备型高效液相色谱柱色谱法与经典色谱基本上相似,但高效液相色谱远远超过其他柱色谱的效率,且操作方便。制备高效液相色谱法和分析型高效液相色谱法的原理如出一辙,但是对于大量的准备样品时制备型高效液相色谱优点更为突出。在正常情况下,分析型色谱的柱效比制备型柱效高,但制备型色谱具有制备纯度高,收率高,制备速度快等优点,是高效、快速的分离方法。

  1.4.1.1固定相

  固定相填料在分离不同样品的时候依据其理化性质不一样而不同。对样品的分离纯化起着非同小可作用是固定相的精选。种类不同的固定相应用于类型不同的色谱,一般C18为固定相用于非极性的样品,而待分目标品共用电子对偏移的时候一般选用硅胶作为固定相。制备型高效液相色谱选用挑选的固定相,必须和前面分析型高效液相色谱挑选的固定相一样,这样才能保证在前面分析型高效液相色谱经过优化的使用条件利用相应的公式套用于制备型高效液相色谱,否则,就需要重新对制备型高效液相色谱条件进行再次优化。

  1.4.1.2流动相

  根据目标成分与化学性能近似物能有最大区分度是流动相选择的主要根据,选择流动相的主要选择流动相的选择性和化学极性两个因素。有机溶剂和水的混合物是反相色谱C18柱的一般流动相,通常使用有机溶剂主要有甲基氰、四氢呋喃和木醇等,流动相的极性可以通过改变水和有机溶剂的比例来改变。

  流动相的选择是在保证足够的分辨率区分待分离样品的前提下,选择低沸点的溶剂比较合适,这就方便后面回收溶剂。实验中为了得到良好的分辨率,可以选用水和有机溶剂组分的流动相进行试验,从而获得最优流动相。尽量选择等度洗脱是制备型高效液相色谱的应该首选,而避免梯度洗脱。同时很重要的是流动相的纯度,如果不纯流动相带入大量的未知杂质,分离纯化样品的目的就无法达到了,如果杂质堵塞色谱柱影响其寿命更是得不偿失,用微膜过滤流动相就可以减少杂质,得到纯净的流动相再进行制备实验。

  1.4.1.3流动相流速

  运用制备型高效液相色谱高效制备纯品时,不同的流动相速率会对制备产品的结果造成很大的影响。如果流动相速率很低,能够保证分离效果,能使其他杂质与目标组分完全分开,但是其结果是实验整个时间将会较大延长,比较耗费资源。当流动相速率增大时,实验操作周期就会缩短,但是同时流动相速率增大相应的就增大柱压,有可能使杂质与目标组分混在一起,影响分离效能,达不到分离纯化效用。所以合适的流动相速率是实现缩短操作周期和良好分离效果的保证。

  1.4.1.4色谱柱

  制备型色谱柱使用不锈钢柱作为色谱柱材料,这是因为制备型高效液相色谱在制备的过程中产生很大的柱压,而一般的玻璃柱是承受不了这样高的柱压的。依据色谱柱分离目的和尺寸将其分为大制备柱、半制备柱、分析型色谱柱和制备柱。一般内径较小为分析型色谱柱:0.5厘米内的直径,0.5m内的柱长,这样的色谱柱处理量很小,需要反复富集。这种耗时的方法在过载样品的情况下,柱效很大幅度降低,一般该色谱柱用于很难分离的样品。一般大制备柱的直径大于25 mm,它的每次的进样量更大,可以处理更多的样品,大批量进行样品制备的时候比较合适。制备柱直径一般在2厘米左右,分析型色谱柱和半制备柱的柱效一般比它好,所以它分离制备效果不好,但是它可以每次处理较大量的样品,成本比他们都较低。通常兼备制备功能的色谱柱的直径在1厘米内,所选填充剂的粒径在10微米内,处理样品量在5微克内。分辨率和分离速度较好是这种制备柱的主要优点,对于毫克级的样品比较适合。

  1.4.2制备型与分析型液相色谱的差异

  用于分析型HPLC,无论压力大小的有何差异,但是总是希望当加入到待纯化产品最小化(在不影响检测的条件下)。在色谱分离纯化工程,当轴向传质在列中的样品,径向扩散是不充分的,使样品与壁不会相互接触,以避免壁效应负面结果对于分离作用。换句话说,待分离试样对于柱横截面,其的直径可被认为是接近于无穷大。这就是所谓的无限直径分析色谱模式(mode of infinite diameter)。

  但是,无限直径模式(mode of infinite diameter)对制备型高效液相色谱的影响不是那么大,该模式会降低制备型高效液相色谱的制备能力。在该过程中,最重要的是目标分子匀称分散和匀速洗脱的横表面上。虽然,峰型扩宽是壁效应带来的结果,可以通过增加色谱柱子的直径,可降低壁效应的带来的负面因素。随着柱径增大很大的时候,壁效应所带来的后果就不是最主要影响因素了。关于制备型高效液相色谱制备产品效用而言,制备型高效液相色谱的作用是利用紧实的床层充分进行分离介质的色谱分离处理。

  1.4.2.1几种提高柱效的方法

  通过对色谱速率理论研究,高效液相色谱速率方程可以得到(1-2)式所示:

  (1-2)

  该方程中,“板高”是H,是色谱峰以及区带扩张的主要标志。

  由此可得,提高色谱柱的柱效即要缩小色谱区带的扩张,其中一种直接的方法是减小填料的直径。另外从(1-2)式还可以得到,要提高色谱的分离效能途径是降低床层空隙率。这是很容易了解到,间隙越小的床层中,床层装的填料就越密实,流动越匀称,色谱柱效率提高的就越显著。分析型HPLC主要理论基础是填料外形统一,填料的粒径越细微,填料就会越密实的填充,因此,减小填料的体积是提高柱效的一条主要方法。同时,这是制备型PHPC不能由分析型HPLC直接扩大而成的最主要原因。要获得到密实床层,就必须使用更小粒径的填料,而带来的结果是床层中流动性的所受的阻力增大,要想流动相能通过就只能扩大外部压力。而要实现近百个大气压的的外部压力对于制备型高效液相色谱是非常有挑战性而且使用风险大。

  目前现有的制备型高效液相色谱,它的制备柱的柱径最大不过几十毫米,这与严格意义上的制备色谱还是有差距。

  1.5本课题的研究背景及意义

  随着这些年对灵菌红素的研究,发现其有良好的抗癌效果,越来越来的机构和组织开始研究灵菌红素的功效。灵菌红素及其家族类似物能很好的凋亡癌细胞而对正常细胞基本没有毒性,是很有前景的抗癌原药。同时发现,除了诱导癌细胞凋零死亡,灵菌红素能有效地抑制癌细胞侵袭和转移。灵菌红素能与细胞表面受体结合,阻断信号转换的γ链,从而表现出免疫抑制癌细胞的活性。灵菌红素能对T细胞介导的​​免疫反应起抑制作用,同时对B细胞无明显影响。有研究表明,灵菌红素与当前常见的免疫药物有不同的抑制免疫机制。另外,灵菌红素也表现出抗菌、防疟疾等多种效果。由于这种新颖结构灵菌红素新化合物具有的抗肿瘤活性,对正常细胞的低毒性,已经是抗癌药物首选之一,并且有合成许多相关衍生物。

  目前灵菌红素的检测与发酵工艺比较落后,而灵菌红素相关生物功能活性的研究已经较为成熟。灵菌红素的特征吸收峰的波长为534 nm,所以大多数检测方法都是使用分光光度计进行测定灵菌红素的含量,该方法并不能很准确的测定出灵菌红素的含量,因为灵菌红素在不同的pH条件下,会使得灵菌红素的颜色发生变化,这就会对吸光度值造成影响,从而致使灵菌红素的含量检测不准;而且分光光度计所测的吸光度也不会表现出杂质的具体含量,这对以后灵菌红素的开发应用不利。

  据此,本文运用的制备型高效液相色谱法,高效液相色谱高灵敏度能精确测定灵菌红素的含量于复杂的发酵液中,并能使用制备型高效液相色谱制备少量的高纯度灵菌红素。此外,以后灵菌红素类化合物生物发酵调控的中,运用HPLC-DAD技术与质谱联用,更加精准的分析灵菌红素类化合物的纯度及其合成水平,从而技术上支持提高产量或是筛选新的化合物,同时奠定提取灵菌红素工艺化的基础。

  第2章灵菌红素的吸附等温曲线及洗脱曲线研究

  2.1前言

  灵菌红素具有良好的免疫抑制和抗癌功效,越来越受到各方的关注。由于灵菌红素是一类非极性亲脂性小分子化合物,通常使用溶剂萃取和色谱分离法进行分离制备。溶剂萃取法是通过比较菌体中各组分的的溶解度差别,挑选对目标成分溶解度较高而又对其他成分溶解度低的溶剂,对所需目标成分从菌体组织里溶解出来的一种的萃取方法。当用超声波破碎菌体后,溶剂溶解菌体的组织内的可溶性物质,然后通过萃取的方法得到目标成分。通常来讲,如果提取是亲脂性化合物的水提取液,通常使用的是非极性有机溶剂如三氯甲烷、安息油、石油醚进行萃取。如果所提取成分是一个局部亲水性物质,亲脂性溶剂提取是很困难的,需要使用一种较弱亲脂性溶剂,如醋酸乙酯、丙原醇等,可以使用加入如甲醇、乙醇或三氯甲烷,从而提高亲水性方法。后面选择用色谱法分离提纯,通过溶剂溶解靶成分,经过色谱分配,然后得到比较纯净的靶产物。该方法由于在操作过程中,各种组分不确定,分离方法不仅过程复杂,而且需要消耗大量的溶剂。

  所以,本章通过进行对灵菌红素吸附等温曲线及洗脱曲线研究,深入探讨灵菌红素在色谱分分离中的动力学参数,从而模拟其在硅胶柱过程中各实验参数,从而更精准的分离得到灵菌红素纯品。

  2.2实验部分

  2.2.1实验试剂

  表2.1实验主要试剂

  Tab 2.1 Main raw materials

  2.2.2实验仪器

  表2.2实验主要仪器

  Tab 2.2 Main equipment

  2.3实验方法

  2.3.1配置PG标准溶液

  精确称量灵菌红素1.50mg,用甲醇溶液于10mL容量瓶中定容,标准溶液配置成15×10-2 mg/mL。后分别配置一系列浓度的标准液:6×10-3 mg/mL、12×10-2 mg/mL、15×10-3 mg/mL、6×10-2 mg/mL、3×10-2 mg/mL,上样,得到结果绘制标准曲线。

  2.3.2高效液相色谱检测灵菌红素

  色谱检测条件:色谱柱Phenomenex C18柱(4.5mm×10cm,5×10-3mm);温度:25℃;流动相(水∶甲醇)=6∶4;流速:1×10-3 L/min;进样量:1×10-5 L;检测波长:UV-535nm。

  灵菌红素标准曲线的绘制

  在配置的标准溶液上样,用得到的峰面积与上样的初始浓度作图,结果显示如下图。作图得到的回归方程为y=56031x-0.15,R2=0.9998。

  图2.1 PG标准曲线

  Fig.2.1 The standard curve of PG

  上图显示PG在6~150 mg/L的浓度内有较好的线性拟合。

  2.4吸附等温线的测定

  2.4.1实验方法

  配置若干不同浓度的灵菌红素溶液。选取一定数量的0.05 L的锥形瓶,分别加入等量的干燥的硅胶5.0 g,后再各中加入等量不同浓度的灵菌红素溶液40ml。将其密闭并置于25℃恒温震荡箱中,震荡吸附2h以上。吸附结束后,取其中的混合物用0.45μm微膜过滤,再取滤液1ml旋蒸除去溶液,后用1mlHPLC甲醇溶解,用高效液相色谱进行测定确定平衡吸附浓度。

  2.4.2吸附等温曲线

  吸附等温曲线研究的是硅胶吸附容量随着灵菌红素初始浓度改变而变化的情况,所得的数据见表2.3。用灵菌红素的初始浓度为横轴,用吸附剂的平衡吸附量为纵轴,得到吸附等温曲线,如图2.2所示。由图可知硅胶的吸附量随着灵菌红素的初始浓度增加而增加,在一定范围表现出良好的线性关系。

  表2.3吸附等温线实验值

  Tab.2.3 Adsorption isotherm data

  初始浓度平衡浓度平衡吸附量

  C0(mmol/L)C(mmol/L)Q(mmol/g)0.02 0.00214 0.01748

  0.04 0.00658 0.03342

  0.06 0.00688 0.05312

  0.08 0.00745 0.07255

  0.10 0.00739 0.08261

  0.12 0.00896 0.08967

  图2.2 PG的吸附等温曲线

  Fig.2.2 Adsorption isotherms of PG

  2.5吸附等温线模型关联

  为了从吸附机理上更好的理解此吸附过程,选用了Langmuri与Freundlich等温吸附模型对所得实验数据进行拟合与分析。

  Langmuri模型是最经典的吸附平衡模型,它采用单分子层吸附理论描述溶质的吸附平衡,吸附剂外层有许多活泼的位点,每个活活泼位点是等价的,只能一个分子被吸引,被吸附的分子间是无彼此作用力。其方程如下图所示:

  (2-4)

  对式2-4进行变换可得其线性形式:

  (2-5)

  公式中:

  q——平衡吸附量,mg/g;

  qe——饱和吸附量,mg/g;

  c——平衡浓度,mg/mL;

  b——吸附平衡常数。

  平衡常数b的大小与吸附剂、吸附质的本性,以及吸附温度有关,b值越高则吸附能力越强。

  Freundlich模型是一个经验模型,其方程如下所示:

  (2-6)

  对式2-6进行变换可得其线性形式:

  (2-7)

  公式中:

  q——平衡吸附量,mg/g;

  c——平衡浓度,mg/mL;

  k与n为特征常数。

  溶液浓度与吸附能力的影响大小用1/n来表达,其数值越小,吸附能力越强。1/n在十分之一到二分之一之间,说明吸附质非常轻易被吸附;1/n大于2时很难被吸附。单位溶液浓度时的吸附量用K显示,它大小随温度的升高而降低。

  以c/q为纵轴,平衡浓度c为横轴做线性拟合;用lgq为纵轴,用lgc为横轴做线性拟合。

  图2.3吸附等温曲线关联Langmuir曲线拟合图

  Fig.2.3 Fitting plot of adsorption isotherm by Langmuir equation

  图2.4 Freundlich方程关联吸附等温曲线拟合图

  Fig.2.4 Fitting plot of adsorption isotherm by Freundlich equation

  由上图拟合结果我们可知,Langmuir模型关联度更高,能够较好的拟合硅胶吸附灵菌红素这一过程,而Freundlich方程的拟合效果较差。

  2.6灵菌红素洗脱曲线

  在室温25℃下吸附操作,待吸附饱和后,用石油醚:丙酮(2:1)作为洗脱剂,控制在2×10-3 L/min的流速下进行洗脱实验,以流出液体浓度对时间作图,结果如下图显示。当洗脱时间到60min时,流出液中的灵菌红素浓度已经降到最高浓度的10%以下,其洗脱率为93.45%,这说明洗脱效果很好。

  图2.5灵菌红素洗脱曲线

  Fig.2.5 Prodigiosin elution profile

  2.7小结

  本章首先测定了灵菌红素的标准曲线,然后对硅胶吸附解吸这个过程进行了深入的探究。发现在室温25℃的条件下,Langmiur模型能对硅胶吸附灵菌红素的等温吸附曲线进行比较好的拟合,线性相关性R2可以达到0.9866。然后研究了再室温条件下,对饱和吸附的硅胶柱进行洗脱,发现在15 min作用洗脱到达最大峰值,在60 min后,洗脱率达到93.45%。这就模拟了硅胶柱层析的基本过程,为后面的制备型高效液相色谱的探究提供参考。

  第3章制备型高效液相色谱应用研究

  3.1前言

  制备型高效液相色谱既有分析型HPLC的各种优点,又有分析型HPLC不具备的优势。PHPLC能较大量的分离纯化灵菌红素有效成分,该方法制备效率高,能减速操作时间,并能得到很高纯度的灵菌红素。

  制备色谱是最先出现的色谱法,它的主要作用是要制备更纯的物质,并且具有产物获取率,更快的分离纯化速率,通常用于制备大量的难以分离的物质。制备型高效液相色谱柱色谱法与经典色谱基本上相似,但高效液相色谱远远超过其他柱色谱的效率,且操作方便。制备高效液相色谱法和分析型高效液相色谱法的原理基本相同,但是对于大量的准备样品时制备型高效液相色谱优点更为突出。在正常情况下,分析型色谱的柱效比制备型柱效高,但制备型色谱具有制备纯度高,收率高,制备速度快等优点,是高效、快速的分离方法。

  本章节将在上一章的理论基础上,详细对制备型高效液相色谱从上样量、流速、温度、洗脱比例进行深入研究。以便为以后小试放大提纯灵菌红素纯度高的样品提供参考。

  3.2实验材料

  3.2.1实验试剂

  表3.1主要实验试剂

  Tab 3.1 Main raw materials

  3.2.2实验仪器

  表3.2实验主要仪器

  Tab 3.2 Main equipment

  3.3试验方法

  3.3.1灵菌红素初提取工艺图

  取粘质沙雷氏菌(ZSG)发酵液于离心机中10000rpm持续15min,然后取菌体用适量的超纯水洗涤,然后再离心,取菌体于10倍体积的酸性甲醇(pH=3)溶液中超声破碎20min,得到混合溶液离心收集上清液,减压蒸馏富集得到浓缩溶液。用乙酸乙酯溶剂浓缩液,离心去掉不溶杂质,减压蒸馏得到灵菌红素粗品。再用硅胶柱纯化粗品得到灵菌红素粗品,最后上制备型高效液相色谱得到灵菌红素纯品。

  图3.1从发酵液中初步提取灵菌红素流程图

  Fig.3.1 the flow of initial extraction of prodigiosin from fermentation broth

  3.4制备型高效液相色谱纯化灵菌红素

  本课题是得到纯度较高的灵菌红素,本章是优化制备型高效液相色谱的各项条件,从而是灵菌红素主峰与杂质峰得以分离开来,得到最好的分离条件。本章对流动相的配比、温度、上样量和流动相的速率进行了研究,分析不同条件下对制备型高效液相色谱图谱的影响,最终得到最优的条件。

  3.4.1实验条件的初优化

  在第二章硅胶吸附和洗脱灵菌红素探究上,对制备型高效液相色谱纯化灵菌红素条件进行初步优化,我们选用25℃作为初步优化温度;选用2×10-3 L/min作为初步优化流速。同时发现在15 min左右灵菌红素洗脱率达到93.45%,这个时间可以作为出峰参考时间。分析型高效液相色谱流动相甲醇与水的比例(4:6)为初步优化流动相比例。在以上设定的条件下进行进一步优化。

  3.4.2结果与讨论

  3.4.2.1流动相的优化

  甲醇与水的比例:(a)38:62(b)51:49(c)63:37;

  色谱条件:SB-C18(9.5mm×25cm,5×10-3mm);

  进样量:2×10-5 L,流速为2×10-3 L/min;

  a

  a

  检测使用波长:534 nm;温度:25℃;

  c

  b

  图3.2 PHPLC流动相优化的色谱图

  Fig.3.2 PHPLC mobile phase optimization of chromatograms

  制备型高效液相色谱法分离纯化灵菌红素,流动相的选择直接影响各峰之间的分离效果,改变有机溶剂与水的比例就可以改变流动相的极性,所以优化流动相的配比对优化制备型高效液相色谱尤为重要。研究了甲醇-水(38:62,51:49,63:37)几种流动相配比的制备型高效液相色谱的图谱,为图(a-c)。从c图中结果显示当甲醇-水比例为63:37时,灵菌红素主峰与其旁边的杂质峰基线没有完全分离,说明该流动相分离效果差,这是因为流动相中有甲醇组分较大,对灵菌红素及其非极性类似物质洗脱能力强,就会将杂质组分也很快洗脱下来,没达到纯化分离的效果;当甲醇比例减小为38:62时(图a),该流动相对灵菌红素洗脱能力变弱,保留时间延后,流动相中甲醇组分较少,流动相极性较大,对非极性组分的洗脱能力下降,虽然能分离开来,但是保留时间过长,同时存在流动相洗脱不下来杂质,使色谱柱堵塞影响其寿命;若甲醇与水配比为51:49(图b),分离效用较理想,杂质峰分开了,而且保留时间合适,合适的流动相比例,既保分离灵菌红素的纯度,又能节省时间。因此甲醇-水比例为51:49时为最佳流动相条件。

  3.4.2.2流速的优化

  流速:(a)1×10-3 L/min,(b)2×10-3 L/min,(c)3×10-3 L/min;

  甲醇与水的比例:51:49

  色谱条件:SB-C18(9.5mm×25cm,5×10-3mm);

  进样量:2×10-5 L;

  检测使用波长:534 nm;温度:25℃;

  a

  b

  c

  图3.3 PHPLC流速优化的色谱图

  Fig.3.3 PHPLC flow rate optimization of chromatograms

  流动相速率的大小决定着灵菌红素与杂质的分离效果和时间,从a图效果说明流速为1×10-5 L的时候,灵菌红素保留时间比较长,灵菌红素制备的效率低,流速小,流动相扩散较慢,流动相中甲醇组分比固定相对灵菌红素竞争吸附降低,这就使得灵菌红素保留时间延后;流动相速率为3×10-5 L时,灵菌红素的出峰时间明显变少,这时分离柱柱压很大,较大的柱压会破坏色谱柱,而且基线和灵菌红素主峰没有完全分离,流速快,会增加柱效,流动相中甲醇组分能很快扩散,比固定相对灵菌红素竞争吸附增强,同时与固定相对杂质的竞争吸附也增强,这就会使灵菌红素与杂质组分分不开,达不到较好的分离效果;当流动相速率为2×10-5 L时候,灵菌红素分离效果理想,保留时间合适,流动相中甲醇组分与固定相对灵菌红素竞争吸附增强,同时与对杂质的竞争吸附并不是同等增强,这样确保了分离提纯结果,而且合适提升流速能节省时间,因此选用2×10-5 L为最佳流速。

  3.4.2.3上样量的优化

  进样量:(a)1×10-5 L,(b)2×10-5 L,(c)3×10-5 L;

  流速:2×10-3 L/min;

  甲醇与水的比例:51:49

  色谱条件:SB-C18(9.5mm×25cm,5×10-3mm);

  检测使用波长:534 nm;温度:25℃;

  a

  b

  c

  图3.4 PHPLC进样量优化的色谱图

  Fig.3.4 PHPLC injection volume optimization of chromatograms

  上样量的多寡也会影响到制备型高效液相色谱的图谱,图(a-c)以此是上样量为1×10-5 L、2×10-5 L、3×10-5 L的制备型高效液相色谱的色谱图,从a图中结果显示是上样量为1×10-5 L,灵菌红素的保留时间合适,主峰的外型较好,基线处稍有小峰,虽然分离效果很好,但是在进样量太少会增加制备实验次数;当进样量为2×10-5 L时,上样量增加,峰形略扩宽,保留时间延后,能较好分离制备灵菌红素;这时上样量是3×10-5 L,主峰1和基线没有完全分离,主峰外形扩宽的很大,结论是进样量不可以多于3×10-5 L,进样量过大,流动相与固定相很难将对灵菌红素与杂质的竞争吸附度区分开来,就达不到分离纯度的效果。为保证良好的分离效果,又不影响分离效率的前提下选择2×10-5 L为最佳进样量。

  3.4.2.4温度的优化

  温度:(a)20℃,(b)25℃,(c)30℃;

  进样量:2×10-5 L;

  流速:2×10-3 L/min;

  甲醇与水的比例:51:49

  色谱条件:SB-C18(9.5mm×25cm,5×10-3mm);

  检测使用波长:534 nm;温度:25℃;

  a

  c

  b

  图3.5 PHPLC温度优化的色谱图

  Fig.3.5 PHPLC temperature optimization of chromatograms

  在不同温度下所获得的色谱图也不相同,图(a-c)分别为温度为20℃、25℃、30℃的PHPLC色谱图,从图中可以看出当温度为20℃时,分离提纯效果较好,但系统保留时间较延后;当温度为25℃时,峰型较好,分离纯化效果好,系统保留时间合适,这是因为温度升高,流动相扩散增剧,加快了流动相层流与灵菌红素分子的混合,提高了柱效;当温度为30℃时峰1与杂质峰基线并未能完全分离,峰形得到了改善,这是因为温度升高色谱柱效率提高,出峰时间进一步缩短,但是升高温度基线出现小峰,这是温度升高后,对流动相极性、介电常数、粘度都有影响。确保较好的分离提纯结果,同时也考虑到大量分离提纯样品时会消耗的大量能量,选择25℃是最佳温度。

  3.5梯度洗脱流动相优化

  进样量:2×10-5 L;

  流速:2×10-3 L/min;

  甲醇与水的比例:0-15 min,流动相比例25-90%;15-25 min,流动相比例90-25%。

  色谱条件:SB-C18(9.5mm×25cm,5×10-3mm);

  检测使用波长:534 nm;温度:25℃;

  图3.6 PHPLC梯度洗脱流动相优化的色谱图

  Fig.3.6 PHPLC optimized mobile phase gradient elution chromatogram

  在开始洗脱的0-15 min时候,由于甲醇比例比较低,所以出峰时间比较晚,第一个小峰出现在5.5 min左右,后面由于甲醇比例的增加,中间基线上有出现了一些零碎的小峰,这是甲醇增加,流动相甲醇组分增加,对灵菌红素洗脱能力增强。15-30 min开始出现大峰,峰型不是很好,后面甲醇比例减少,又出现了一些零碎小峰,说明分离效果不是很好。所以该制备型高效液相色谱制备灵菌红素梯度洗脱的实验效果没有恒定比例流动相洗脱效果好。

  3.6制备型高效液相色谱优化

  进样量:2×10-5 L;

  流速:2×10-3 L/min;

  甲醇与水的比例:51:49

  色谱条件:SB-C18(9.5mm×25cm,5×10-3mm);

  检测使用波长:534 nm;温度:25℃;

  图3.7 PHPLC优化的色谱图

  Fig.3.7 PHPLC optimization of chromatograms

  在最佳条件下,样品在3 min左右有一个较小的波动出现,在14 min时有较大的波峰显现,该条件下色谱峰宽较小,拖尾小,保留时间合适,与相关文献有关灵菌红素报道信息一致。表明该标准下制备型高效液相色谱分离效果理想,并且灵菌红素峰面积占总面积的比例为98%,说明制备灵菌红素的纯度为98%。

  图3.7 PHPLC制备浓缩的灵菌红素

  Fig.3.7 Concentrated prodigiosin by PHPLC

  3.6.1结构鉴定

  1、经过制备型高效液相分离纯化的灵菌红素经过萃取后减压蒸馏得到的浓缩物用少量的酸性甲醇溶解后,用红外光谱检测图谱正如图3.8所示。

  图3.8灵菌红素的红外光谱图

  Fig.3.8 Infrared spectrum of the PG

  根据上图3.8灵菌红素的红外光谱图可以观察出来,图谱之主要有6处吸收峰,其波数和相对应的官能团如下表3.3所示。

  表3.3灵菌红素的红外振动波数及其对应的官能团

  Table3.3 infrared vibrational wave numbers of PG and the functional groups

  波数(cm-1)官能团3440.0 N-H,强而宽

  2981.1 C-H,弱而尖

  1657.7 C=C,稍弱

  1032.96 C-O、C-N,强而尖

  720.0(CH2)n变形振动

  从上表3.3中得到的结论与参考文献的相关灵菌红素的红外光谱图显示的结果基本一致。

  灵菌红素的液相色谱-质谱联用(LC-MC)检测

  图3.9灵菌红素LC-MC验证图

  Fig.3.9 LC-MC of PG

  如上图3.9的结果所示,经过制备型高效液相色谱分离纯化后的灵菌红素用液相色谱-质谱联用仪器检测,样品中有两种物质,占大比例的物质的质量分数为324.2,这一结果与灵菌红素的质量分数相一致,说明制备型高效液相色谱分离纯化灵菌红素效果很好。

  3.7本章小结

  天然色素的开发与运用已经成各行各业中科技工作人员大量关注的项目,主要是从动物、植物组织和微生物发酵中提取色素组分。然而,现在普遍使用的传统提取方法存在浪费有机溶剂、提取效率低、条件控制部精确的问题。本课题使用的制备型高效液相色谱则具有诸多优点,不仅控制各项条件准确,而且分离提纯效率高,产物纯度高。

  在前面对硅胶柱层析过程模拟的条件下,深入研究了制备型高效液相色谱的最佳条件的优化,在考虑在实际条件情况与保证最佳效率的前提下,发现该型制备型高效液相色谱SB-C18(9.5mm×25cm,5×10-3mm)在下列条件:进样量(2×10-5 L);流速(2×10-3 L/min);甲醇与水的百分比(51:49);所用检测使用波长(534 nm);温度(25℃)制备效果良好,而且出峰快,峰形较好。说明灵菌红素与杂质分离开,拖尾部分较少,分离纯度较高、产物获取率较高、分离速率较快。

  第4章结论与展望

  4.1结论

  灵菌红素是具有由三个吡咯环重组的甲氧基吡咯架子结构的次级代谢物,归因于拥有良好的抗癌活性而受到大规模关注。距今为止,紫外分光光度计法是依然是测定灵菌红素的首要方法。想要快速精准的测定发酵液中灵菌红素的含量,本实验过程中采纳的流动相体系是水和甲醇的高效液相色谱法来快速测定灵菌红素,同时利用制备型高效液相色谱少量制备高纯度样品。

  本课题的研究目的是通过对硅胶柱层析纯化灵菌红素的动力学过程进行研究,从而指导制备型高效液相色谱比较精准合理的提纯出纯度较高的灵菌红素纯品。

  ①通过对灵菌红素的吸附性能进行研究分析,Langmiur模型对灵菌红素的等温吸附曲线进行较好的拟合,相关系数R2可以达到0.9866,洗脱曲线能较好拟合灵菌红素的洗脱过程,洗脱率可达93.45%。

  ②通过对灵菌红素吸附动力学探讨,从而指导制备型高效液相色谱最佳条件研究,通过对流动相、流速、上样量、温度等条件的调节与摸索,结论:SB-C18(9.5mm×25cm,5×10-3mm)的制备型高效液相色谱的最好制备条件是流动相结构(甲醇:水=51:49)、流动相速率(2×10-3 L/min)、上样量(2×10-5 L)、温度(25℃)。制备灵菌红素的纯度较高,速度较快。

  4.2展望

  本课题的主要研究内容就是通过对硅胶吸附解吸灵菌红素的过程研究,探究出该过程等温吸附曲线以及洗脱曲线,对后续制备型高效液相色谱【SB-C18(9.5mm×25cm,5×10-3mm)】高效制备灵菌红素各项条件优化提供初始参考。但是该这项工作还是有许多发掘的潜力。主要从以下几个方面思索:

  更加深入细化硅胶吸附解吸灵菌红素的动力学过程,找到更合适的模型拟合。

  可以选用更大型号的制备型柱子进行实际模拟,为工业化提供有力支持。

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