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植物学病理源研究论文 水稻白叶枯病菌OS198广谱低毒力机制的研究

2018-12-18 16:16:40来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要

  水稻白叶枯病(bacterial leaf blight of rice)是由革兰氏阴性黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的维管束病害,可造成水稻的严重减产,给全中国乃至全世界的水稻带来毁灭性危害。水稻白叶枯菌中国系统6号小种代表菌株OS198,它具有与多个IRBB系列和一些地方水稻品种上互作时表现弱毒力的遗传背景,本课题组在过去的研究中发现:OS198中的两个tal基因talR26.5、talR20.5能够分别减弱强毒力水稻白叶枯菌株PXO99A在水稻品种IRBB8、IRBB14、IRBB214和IRBB50上的毒力,但并没有完全减弱到OS198的弱毒力水平。PthXo3-2是OS198的一个主要的毒力tal基因,该基因异源表达时具有很强的毒力功能,却在OS198中不表现出来。从OS198全基因组水平上挖掘低毒力因子,克隆新的毒力基因,研究其功能对于揭示OS198广谱低毒力机制具有重要意义。

  研究采用EZ-Tn5TM Tnp Transposome转座子插入的方法构建了水稻白叶枯病菌OS198的插入突变体菌株库。通过对突变体库中400个插入突变体剪叶接种苗期水稻IR24,筛选到了毒力增加的突变体,命名为#48-Tn5。hiTail-PCR方法分离转座子插入位点侧翼序列,测序结果表明转座子插入到粘附素adhesin-like protein(ALP)基因,该基因全长3798bp,编码1266个氨基酸。Blast分析发现,该基因编码的氨基酸序列与黄单胞菌株韩国KACC 10331(基因登录号AAW74096.1)的外膜蛋白(outer membrane protein)具有99%的一致性,该蛋白的功能未知。经Southern杂交和PCR验证确认了Tn5在#48-Tn5中单位点插入且未发生转座子携带侧翼序列转移。将ALP基因克隆到具有广寄主范围的质粒pHM1上,将重组质粒pHMALP电转化#48-Tn5突变体后,突变体恢复到野生菌OS198在其寄主水稻品种IR24上的弱致病力,并测定了#48-Tn5对17个IRBB系列水稻品种、7个地方品种和1个IR系列水稻品种的致病力,发现#48-Tn5菌株在水稻IR24和IRBB13上的毒力增加,说明水稻黄单胞菌OS198中的ALP基因与其致病力相关,在侵染水稻的过程中起着非常重要的作用。

  采用基于同源交换原理的基因敲除方法构建了OS198 ALP基因敲除突变体,并对缺失突变菌株进行功能互补。在水稻IR24和IRBB13测定OS198 ALP的致病力,测定了基因敲除菌株OS198 ALP和插入突变菌株#48-Tn5的在NB培养基上生长速率、非寄主烟草上胼胝质的沉积来挖掘ALP基因的生物学功能,以及通过实时荧光定量PCR来检测ALP突变菌株中OsSWEET基因的表达情况,对ALP基因调控病原菌毒力的机制进行了初步探究。

  首先通过PCR和酶切连接的方法构建了ALP基因缺失突变的无痕敲除载体pk18sacB ALP,将重组质粒热转化大肠杆菌S17-1后,采用两亲交配的方法将pk18sacB ALP转化野生型OS198,在筛选不含Km抗性且能在含蔗糖平板上生长的转化子。根据ALP基因序列设计引物,PCR验证ALP缺失突变菌株和野生型OS198。在OS198质粒文库中筛选包含ALP基因的质粒用于构建ALP基因的回补菌株,将筛选到的ALP基因片段酶切连接到到载体pHM1上,再电转化相应的ALP基因突变菌株,经验证得到ALP基因的回补菌株。

  结果发现与野生型OS198相比,两种突变菌株在NB培养基上的生长速率显著增加,OS198 ALP在寄主水稻IR24和IRBB13的病斑长度和细菌含量明显增加且减弱了OS198在非寄主烟草上胼胝质的沉积。

  运用实时荧光定量PCR检测ALP突变菌株中OsSWEET基因的表达情况。分析了注射接种野生型OS198、#Tn5-48、OS198ΔALP的水稻IR24感病基因OsSWEET14的表达情况,接种36 h后OS198ΔALP和#48-Tn5的水稻叶片中的OsSWEET14表达量分别是接种野生型0S198的25倍和55倍。通过在水稻IR24上注射接种PX099A、野生型OS198、ALP突变菌株检测cAMP浓度,发现OS198的三型分泌系统分泌和转运效应子功能运作正常。与PXO99A相比野生型OS198、ALP突变菌株分泌和转运效应子的能力降低,ALP突变菌株和插入突变菌株之间cAMP浓度无差异。

  上述研究结果表明:ALP基因缺失增加了病原菌在培养基上的生长速率;减弱了OS198在非寄主烟草上胼胝质的沉积;OS198ΔALP和#48-Tn5在苗期IR24和IRBB13上的毒力显著增加;ALP基因通过影响OS198对OsSWEET14的诱导表达来调控病原菌的毒力.

  关键词:水稻白叶枯病菌;ALP基因;EZ-Tn5;毒力

  文献综述

  水稻白叶枯病菌毒力因子的研究进展

  水稻白叶枯病(bacterial leaf blight of rice,BB)是由革兰氏阴性菌稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的水稻维管束病害,但是有时水稻虽被感染但不表现出症状,而是成为带菌稻苗,移栽后条件适宜时即可成为大田的发病中心,危害极大。水稻受害后,一般减产20%~30%,严重的减产50%以上,甚至颗粒无收(方中达等,1990;陈功友等,2004)。黄单胞菌与靶标寄主水稻互作关系符合基因对基因假说,在基因对基因假说关系中,只有寄主的抗病基因(R)与入侵的病原物的无毒基因(A)显性互作时才表现小种转化性抗性,而其他互作关系(r/A,r/a,R/a)均表现为感病(Keen,1990)。

  近年来,人们通过研究植物病原细菌的入侵机制、分泌的致病因子、致病相关基因功能以及挖掘病原细菌新的致病相关因,来阐明它们侵染靶标寄主、参与致病的分子机制。研究证明,水稻白叶枯病原菌从靶标寄主叶片的水孔或伤口进入维管束,依赖自身分泌的胞外多糖(exopolysaccharides,EPSs)、脂多糖(lipopolysaccharides,LPSs)、粘附素(adhesin)、三型分泌系统(type III secretion system,T3SS)及其效应蛋白等毒力因子与靶标寄主植物互作。另外,Xoo分泌的胞外酶类能够降解植物细胞壁或植物组织(Chial et al.,2003;Francetic et al.,2000),为病原菌粘附并入侵靶标寄主细胞创造良好条件。细菌的毒力因子通过RNA结合蛋白RsmA转录后控制、群体感应途径、双组分系统来协调表达(唐庆华等,2012)。除了胞外多糖和胞外酶类等生化因子以外,Xoo的毒力因子研究主要集在由Hrp基因簇(hypersensitive response and pathogenicity,hrp)编码的三型分泌系统(type III secretion system,T3SS)及其效应蛋白与靶标寄主植物感病基因互作,引起抗病或感病;在非寄主烟草上引起过敏反应HR(hypersensitive response,HR)(Noel et al.,2002;陈功友等,2004)。

  胞外多糖

  胞外多糖(EPS)是病原细菌在生长代谢过程中合成、分泌到细胞壁外的水溶性的大分子多糖类化合物,EPS由D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖、D-甘露糖、乙酸、丙酮酸组成,相对分子质量在2×106~2×107 D间,属于次生代谢产物。黄单胞菌以及假单胞菌等其他细菌在与靶标寄主植物互作时受害部位表现出水渍和萎蔫的症状与其分泌的胞外多糖有关(王金生等,2000)。此外,黄单胞菌在寄主植物维管束细胞中扩散、蔓延、繁殖也需要依赖胞外多糖(Saile et al.,1997;Yu et al.,1999;Braun et al.,2005)。Rpf基因簇(regulation of pathogenicity factors,Rpf)中rpfC基因参与调控野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)的胞外酶、胞外多糖的合成,水稻黄单胞菌致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)中类似于rpfC的基因突变后,胞外酶的合成没有受到影响,但是影响胞外多糖的合成和其在寄主植物上的致病力(Tang et al.,1996)。rpfC基因对野油菜黄单胞菌的致病力起着不可或缺的作用。

  脂多糖

  LPS是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分,其主要功能是保持细胞完整性,抵抗外界不良因素,介导细菌之间或细菌与寄主植物组织之间的粘附,构成了植物先天免疫诱导的第一层。LPS是病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)的分子之一,其对于细菌生长和存活力是必不可少的,并且起到触发真核生物中先天防御反应的作用。Dow等人发现水稻细条性条斑病原菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)中脂多糖的合成受到Rpf基因簇中RpfX和RpfY基因以及野油菜黄单胞菌柑橘致病变种中的opsX基因(for outer-membrane polysaccharide X)的调控(Kingsley et al.,1993;Dow et.al,1995),opsX基因的突变菌株在柑橘上不致病。

  粘附素

  3.1粘附素研究进展

  病原细菌能够入侵寄主植物并在寄主植物中定殖是病原菌与寄主发生互作的先决条件(Hou and Liu,2017),而病原菌粘附在寄主植物细胞是其入侵的第一步,病原细菌特异性粘附在寄主细胞主要由粘附相关蛋白介导,又称为粘附素(adhesin)。与致病性密切相关粘附相关蛋白有两类,即菌毛和非菌毛粘附物质,菌毛主要存在于革兰阴性菌(Soto and Hultgren,1999)。在过去的研究中发现:将木质部小菌属中与菌毛相关基因filmA和filmB缺失后,病原菌在葡萄上的毒力降低(Feil et al.,2007);黄单胞菌编码粘附相关蛋白的基因XadB(Xanthomonas adhesin-like protein B)突变体毒力减弱。(Amit Das et al.,2008)。

  3.2粘附素蛋白(Adhesin-like protein)的分布和种类

  细菌种群根据16S rRNA可以分为α、β、γ三个亚族。在非植物病原细菌中,粘附蛋白广泛存在于幽门螺旋杆菌、肺炎链球菌和大肠杆菌Escherichia coli中,例如HSP-60、PsaA蛋白。此外,粘附类蛋白还存在于金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、杜氏嗜血杆菌Haemophilus Winslows中;在植物病原细菌中,粘附类蛋白发现存在于黄单胞菌属和假单胞菌属中,黄单胞菌属和假单胞菌属属于γ亚族。

  3.3与粘附相关的细菌结构

  与粘附相关的细菌结构通常有三种:菌毛(fimbria),荚膜(Capsule),细胞壁(Cell wall)。菌毛存在很多革兰氏阴性菌及少数革兰氏阳性菌的细胞表面,是一种比鞭毛细、短且硬的表面丝状物,有时或称伞毛、纤毛,有两种类型。菌毛是细菌的黏附的重要结构,能与寄主细胞表面的受体特异性结合,粘附是细菌感染寄主细胞的第一步,因此菌毛和细菌的致病性密切相关。菌毛的受体常为糖蛋白或糖脂,与菌毛结合的特异性决定了寄主感染的易感部位。

  可扩散信号分子

  革兰氏阴性细菌分泌的可扩散信号分子DSF(diffusible signal factor)是一种丝氨酸内脂的衍生物,细菌通过分泌的可扩散信号分子来感知自身群体密度,细菌的群体行为包括群体运动,生物膜的形成,细胞分裂,逆境生存等(Jung-Hee et al.,2013)在黄单胞菌中,rpfA基因参与由扩散信号因子(DSF)介导的合成和细胞信号传导,致病因子基因rpfA-I调节因子的突变降低了这些细菌的毒力,XA21介导的先天免疫激活子Ax21(activator of XA21-mediated immunity)蛋白作为群体感知的信号分子,可以调节细菌自身的群体行为(Han et al.,2011)

  5细菌Ⅲ型分泌系统及分泌的效应子

  5.1细菌Ⅲ型分泌系统的结构和功能

  III型分泌(T3SS)系统广泛存在于革兰氏阴性菌,在不同的细菌属中它们具有共同的核心结构和功能,形态结构整体呈注射器状(图1-1),该结构高度保守且在细菌的致病性中起着非常重要的作用。效应分泌物由T3SS系统传递进入靶向宿主细胞,与靶向宿主细胞互作使植物感病或抗病,而不预先将效应分泌物分泌到环境中。在很多情况下,T3SS系统是基本的毒力因子,在某些情况下它们也会相互作用。黄单胞病原菌则通过这种“分子注射器”直接将大多数Ⅲ型分泌系统效应蛋白转运至植物细胞,引起水稻病害。一些效应蛋白的分泌需要依赖分子伴侣蛋白(He et al.,1998;Galan et al.,1999),细菌的T3SS由位于细菌的染色体上hrp簇编码。

  植物病原细菌Ⅲ型分泌系统在结构和功能方面具有三个主要特征:一.形态上呈现纤丝状,且细菌膜转为器中的许多成分与细菌鞭毛装配器类似;二.与分泌相关的胞外纤毛性附属物Hrp pili能够将效因蛋白转运到寄主植物细胞内;三.依赖hrp系统的泌出蛋白缺乏N-末端信号肽,泌出信号存在于泌出蛋白的mRNA的5´端(陈功友,2002)。

  病原细菌在侵染植物寄主的过程中在寄主细胞外,病原细菌Ⅲ型分泌系统效应蛋白首先要跨越自身的细胞壁,其次穿过寄主植物较厚的细胞壁和质膜。所以黄单菌的Ⅲ型分泌系统转运装置在病原菌与植物互作的过程中起着“桥梁”的作用。

  植物病原细菌III型分泌系统(T3SS)构造模式图(Ji and Dong,2015)

  Figure 1-1 Schematic diagram illustrating type III secretion system(T3SS)architectures of plant-pathogenic Gram-negative bacteria.

  The basal body of the T3SS spans the bacterial inner membrane(IM)and outer membrane(OM),and comprises ring structures that are presumably connected by a periplasmic rod(P-rod)across the peptidoglycan mesh(PL)(Büttner,2012).The basal body associates with pilus(plant pathogens)appendage,which elongates across an OM peripheral layer containing lipopolysaccharide(LPS)and forms a channel-like translocon that inserts into the host plasma membrane(PM).

  5.2 hrp基因

  植物病原细菌hrp基因簇广泛存在于Pseudomonas,Erwinia,Pantoea,Ralstonia,Xanthomonas属的植物病原细菌中。水稻白叶枯病菌Xoo的hrp基因簇包括hrp、hrc(hrp-conserved)、hpa(hrp-associated)三大类基因构成(Salzberg et al.,2008)。主要编码Ⅲ型分泌系统装置蛋白,通道效应因子以及相关表达调控蛋白。

  hrp基因的表达受很多因素的影响,例如在营养丰富的培养基(NB)中不能正常表达,当细菌侵染植物或在某些营养匮乏的培养基(XOM2)培养时会被激活表达。温度、PH值、培养基成分和一些植物信号分子等都会影响hrp基因表达。

  Hrp基因簇决定病原细菌在感病寄主上的致病性以及抗病寄主或非寄主植物上的HR反应。Hrp基因簇大多位于植物病原菌的DNA染色体或毒性环状质粒上,Hrp基因簇调控系统分为两种类型:在Pseudomonas syringae、Erwinia amylovora和Pantoea stewartii中,由HrpL调控其它hrp基因;在Xanthomonads和Ralstonia solanacearum中,分别由HrpX(Xanthomonads)或HrpB(Ralstonia solanacearum)调控hrpB-hrpF及效应蛋白基因的表达(Zou et al.,2006)。在Xoo中,HrpG、HrpX作为hrp基因簇中两个关键的转录调节因子,能够激活hrp基因簇中一系列基因的表达。HrpG是一个OmpR型调节因子,在营养丰富的培养基中表达受抑制,当细菌进入植物质外体后HrpG就被激活而大量表达。HrpG磷酸化后能激活hrpX的表达,hrpX能够结合到一个保守的序列元件(TTCGC-N15-TTCGC,植物诱导型启动子plant-inducible promoter,PIP)上,大多数受HrpG调控的基因的启动子区域都存在该保守序列元件(唐庆华等,2012)。hrpX蛋白通过结合hrp基因簇中的hrpB、hrpC、hrpD、hrpE、hrpF及其他毒力相关基因,来对病原菌的毒力发挥产生重要作用。研究发现HrpX蛋白正调控HrpD6的表达,HrpD6正调控hpa1、hpa2、hpaB基因的转录,负调控hrcC和hrcT的转录。KdgR是ICIR家族的转录因子,kdgR基因缺失抑制hrpG和hrpX的表达,导致hrp基因簇基因的表达受影响,病原菌的毒力丧失(Li et al.,2011)。

  5.3细菌III型分泌系统及其分泌的效应蛋白

  植物病原细菌的三型分泌系统是由Hrp基因簇中的hrc基因产物构成的。功能主要是将病原细菌中表达的效应蛋白从细菌的细胞中转运到寄主的细胞中发挥功能。植物病原细菌通过III型分泌系统分泌的效应因子具有毒性或无毒性的双重功能。作为毒性基因,病原细菌三型效应子通过与寄主植物细胞相应的感病基因互作,植物表现感病。作为无毒基因,病原细菌三型效应子又能激活寄主植物防卫反应,植物表现抗病(付月灵等,2010)。基因组分析结果揭示,水稻黄单胞菌中至少存在28种类型的T3SS效应物,分为non-TAL效应物(Non transcription activator-like effectors)和TAL效应物(Transcription activator-like effectors)两大类(赵帅等,2011)。

  5.3.1效应蛋白转运报告系统研究进展

  病原细菌通过III型分泌系统将致病性效应子non-TAL效应子和TAL效应子等转运到寄主细胞中,效因子与寄主靶标基因互作从而发生抗感性互作。因此,利用报告基因系统检测效应因子的转运过程对于探究III型分泌系统转运机制具有重要的科学意义。近几十年以来,关于病原细菌效应因子的转运报告系统有很多,应用比较广泛有腺苷酸环化酶(Cya)、β-内酰胺酶(Blam)、Cre-LoxP重组GFP荧光标记等报告系统(Soudeh et al.,2009)。但是植物病原细菌效应因子转运报告检测系统方面的相关研究还比较少,目前应用比较成熟的只有腺苷酸环化酶(Cya)报告系统。

  5.3.2腺苷酸环化酶(Cya)报告系统

  腺苷酸环化酶(Adenylate cyclase toxin,ACT或CyaA)是一种引起急性传染病百日咳的重要毒性蛋白(Bassinet et al.,2004)。研究表明,腺苷酸环化酶催化活性依赖于钙调蛋白,而只有真核生物胞内才含有钙调蛋白(Ladant and Ullmann,1999),Sory等将Yersinia菌属的Yop类效应蛋白与腺苷酸环化酶(Cya)的N端活性基团连接表达,成功地检测到Yop效应蛋白的转运(Sory and Cornelis,1994;Sory et al.,1995)。因此腺苷酸环化酶系统可以用于检测病原细菌III型分泌系统分泌的相关效应子,

  Casper-Lindley等人通过检测植物体内的环腺苷酸(cAMP)含量来检测植物病原菌Xcv85-10分泌的效应蛋白AvrBS2蛋白的转运情况(Casper-Lindley et al.,2002)。而在Xanthomonas菌属中,Roden等人采用腺苷酸环化酶(Cya)报告系统检测了HrpF基因缺失菌株中,non-TAL效应因子XopC、XopN以及XopQ的转运情况。(Roden et al.,2009)。腺苷酸环化酶(Cya)报告系统也被成功用于检测其他病原菌效应蛋白的转运,如Salmonella、Shigella、Escherichia coli和Pseudomonas aeruginosa菌属等。

  图1-2真核生物腺苷酸环化酶(Cya)报告系统(Sory et al.,1995)

  Figure 1-2Adenylate cyclase(CyaA)as a reporter of protein targeting into eukaryotic cells.

  A fusion protein comprising a fragment of Yop(Yop9)fused to the CyaA catalytic domain(AC)is inactive in the bacterial cell,which does not express calmodulin(CaM).Upon delivery into the eukaryotic cell cytosol by means of the type III secretion apparatus(Sec),it is activated by CaM and produces cAMP.

  5.3.3 Non-TAL效应物

  根据全基因组测序结果对比发现,大多数黄单胞菌属的成员都含有non-TAL效应物。non-TAL效应蛋白由分泌信号转运区(secretion/translocation signal)和功能区(function domain)组成。通常具有下列共有的特征:启动子区域存在HrpX的结合位点PIP-box和-10区序列(TTCGB-N15-TTCGB-N30-32-YANNRT,B代表C、G或者T;Y代表C或T;R代表A、G或者T),大多受HrpX蛋白的调控表达;分泌信号区由位于N-端前50个特定氨基酸形成,分泌信号肽以及5´mRNA序列特征已经成为鉴定non-TAL效因蛋白的重要依据(赵帅等,2011)。在Xoo中,non-TAL蛋白被称为Xop(Xanthomonas out protein)。PXO99A菌株含有18个non-TAL效应物,其中xopZ基因有两个拷贝,在18个non-TAL中,xopAA和xopC两个基因的启动子区没有发现典型的PIP-box。(Song and Yang,2010)。

  植物病原细菌non-TAL效应物的功能包括三个方面:(1)影响寄主的泛素化蛋白系统(HopAB2);(2)发挥蛋白酶的功能,对寄主蛋白进行修饰(XopD,XopJ);(3)使寄主蛋白的磷酸化发生变化(AvrB1,HopAO1)(Da et al.,2007)。

  在黄单胞菌中,仅发现少数Xop蛋白具有致病功能,AvrBs2是第一个被发现具有致病功能的non-TAL效应物。大部分致病T3SS效应物通过干扰效应分子激发的免疫(Effector-triggered immunity,ETI)或病原菌相关分子模式激发的免疫(Pathogen-associated molecular pattern triggered immunity,PTI)来发挥作用(赵帅等,2011),例如,野油菜黄单胞菌的XopD、XopN、XopX可以通过影响寄主的免疫反应来发挥作用;PXO99A的XopZ能够抑制水稻的先天性免疫(Song and Yang,2010)。水稻黄单胞菌具有寄主水稻品种专化性的特点,同源的non-TAL效应子在不同的黄单胞菌种致病程度不同,例如,在Xoo中XopQ突变体在IR24上的毒力与野生型相比没有显著差异,但Xoc的XopQ缺失后导致病原菌毒力增强(裴俊国等,2010)。所以,为了挖掘non-TAL效应物的功能,同一个non-TAL效应物需要在不同水稻品种上测试其毒力。

  5.3.4 TAL效应物

  5.3.4.1TAL效应物分布和功能

  TAL效应子由hrp基因簇编码的三型分泌分泌进入植物细胞中,在寄主水稻上引起致病性(pathogenicity)在非寄主烟草上引起过敏反应。在黄单胞菌和部分劳尔氏菌属中均有TAL效应子广泛存在,不同的黄单胞菌株TAL效应子的数目有一定差异,全基因组测序结果显示,水稻白叶枯菌韩国1号小种KACC10331含有11个TAL效应子、菲律宾菌株PXO99A菌株含有19个TAL效应物、日本菌株MAFF31108含有16个TAL效应子。研究报道的水稻黄单胞菌含有的TAL效应物数量达到7-35个(Gonzalez et al.,2007),目前已克隆编码TAL效应物的基因有AvrXa27、pthXo1、pthXo6、pthXo7。

  TAL效应子与水稻互作时大多呈冗余状态,某个或某些TAL效应子与水稻互作的过程中其作用可能会被其他基因或基因产物掩盖,TAL效应物被分泌到植物细胞后与靶标基因启动子区的UPT(Up-regulated by TAL)box结合,结合位点称为EBE(TAL effector binding element),来转录激活因子(transcriptional activators)发挥TAL效应子的无毒性功能或和毒性功能。TAL效应因子通过识别寄主的R-基因来激活植物的抗病反应,这类效应因子就称为无毒因子,已经发现的水稻白叶枯菌的无毒TAL基因有avrxa5,AvrXa7,avrXa10(HopKins et al.,1992);avrXA23(Wang et al.,2013),avrXA27(Gu et al.,2005),其中AvrXa十分特殊,该TAL效应因子同时具有无毒性和毒性双重功能,既能在含有Xa7抗性基因的水稻上激发水稻抗病反应,表现无毒活性功能(Yang et al.,2005),还能诱导表达水稻感病基因Os11N3表现毒性功能。

  5.3.4.1 TAL效应蛋白与寄主水稻SWEET基因的互作

  TAL效应子的毒性功能主要通过诱导寄主植物感病基因的表达,感病基因的研究主要集中在于糖转运SWEET(Sugar will eventually be exported)基因上,研究表明SWEET蛋白主要功能是将寄主植物产生的蔗糖从韧皮部薄壁细胞转运到质外体中。在质外体中积累的糖分为病原细菌的生长繁殖提供必需的营养物质(Chen et al.,2010)。黄单胞菌不同的TAL效应子诱导表达的SWEET基因有一定的差异,已报道黄单胞毒力TAL基因有PthXo1,PthXo2,AvrXa7等,PthXo1是水稻白叶枯PXO99A主要的TAL效应子,该基因与水稻感病基因OsSWEET11(Os8N3/xa13)互作,在水稻上引起强的致病反应,而PXO99A的OsSWEET11基因缺失突变体不能引发强致病性;PthXo2和AvrXa7分别与OsSWEET13(xa25)、OsSWEET14互作,另外OsSWEET14也还被PthXo3,TalC,Tal5诱导表达,TalC,Tal5效因子分别来自黄单胞菌株PXO61,BAI13,MAI1(Yang and White et al.,2004;Chu et al.,2006;Antony et al.,2010;Yu et al.,2011)。随后White等人又发现了PXO99A中另外两个具有毒性功能的tal基因及它们相对应的寄主靶基因:pthXo6、pthXo7基因分别诱导寄主水稻感病基因OsTFX1和OsTFIIAγ5的表达。OsTFX1位于水稻的第九号染色体,属于bZip转录因子家族的成员。PXO99A pthXo6基因缺失突变菌株接种水稻,导致接种叶片病斑长度减少35%,细菌数量减少50%。pthXo7基因特异性诱导水稻中的OsTFIIAγ5的表达(White et al.,2009)。孙荣华等报道了水稻白叶枯菌JXOV中新的TAL效因子TAL17.5,该TAL效因子增强了PX099A在IRBB2、IRBB7、IRBB10、IRBB211、IRBB214等11个水稻品种上的致病力,病斑长度增加了4.9~9.3cm,但是TAL17.5的毒力机制还有待进一步研究。(孙荣华等,2017)

  图1-3 TAL效应蛋白与糖转运蛋白SWEET互作模式图(Chen et a1.,2010)

  Figure 1-3Model for the function of SWEET transporters in plant pathogenesis.

  (A)The pathogenic Xoo strain PXO99A injects TAL effector PthXo1 via the type III secretion system into rice cells.PthXo1 directly induces OsSWEET11 leading to sugar efflux.Bacteria take up glucose and multiply.(B)PXO99A pthXo1 mutant(PXO99A ME2)leads to loss of OsSWEET11 induction and reduced bacterial growth(indicated as reduced size of bacterium).(C)Mutation of the OsSWEET11 effector binding element(EBE)leads to loss of PthXo1-mediated induction and reduced bacterial growth.(D)Bacteria expressing effector AvrXa7 can circumvent loss of OsSWEET11 induction by inducing OsSWEET14.

  细菌hrp基因簇组成的III型分泌系统及该系统泌出的效应蛋白对病原菌的致病力起非常重要的作用。本研究发现水稻白叶枯病菌OS198中编码粘附蛋白的ALP基因缺失后,病原菌在水稻上的毒力增加,为了解ALP基因缺失后毒力变化的机制,我们将细菌入侵寄主植物,三型泌出系统功能以及TAL效应蛋白与寄主水稻SWEET基因的互作表达的影响这些方面进行初步研究。

  5.4本研究的目的和意义

  OS198是水稻白叶枯菌中国系统6号小种的代表菌株,它在多个水稻品种上(包括国际水稻所的近等基因系上)都表现为弱毒力,目前关于OS198毒力因子的研究还很少,已报道的OS198中的三个tal基因talR26.5、talR20.5、PthXo3-2均不是决定其低毒力的关键因素(朱引引等,2014;王硕,2015)。

  本研究运用Tn5转座子诱变技术构建OS198突变体文库,在突变体文库中,通过致病力测定筛选到一个毒力增加的突变体#48-Tn5。HiTail-PCR方法分离转座子插入位点侧翼序列,测序结果表明转座子插入到OS198粘附素adhesin-like protein(ALP)基因上,引起ALP基因突变。构建突变体文库,从全基因组水平上发掘OS198毒力因子,克隆新的毒力基因,研究其功能对于揭示OS198广谱低毒力机制具有重要意义,同时增加我们对水稻白叶枯病原菌与寄主水稻互作的分子遗传机制了解,为水稻白叶枯病害的控制与防治提供理论基础和技术支持。

  下篇

  研究内容

  第一章OS198突变体库的构建及毒力调控突变体的筛选

  摘要:本研究采用EZ-Tn5TM Tnp Transposome转座子插入的方法构建了水稻白叶枯病菌OS198的插入突变菌株库。在苗期水稻IR24上剪叶接种筛选到了毒力增加变突变体#48-Tn5,经Southern杂交验证该突变体为Tn5单位点插入。hiTail-PCR以及亚克隆分析确定了Tn5的插入位置。本研究构建水稻白叶枯病菌OS198的插入突变菌株库,筛选到OS198毒力突变体为进一探究OS198广谱低毒力的机制研究提供了实验基础。

  关键词:水稻白叶枯病菌;EZ-Tn5;插入突变菌株

  CONSTRUCTION OF MUTANTS LIBRARY OF OS198

  ABSTRACT:Insertion mutant library of Xanthomonas oryzae pv.oryzae strain OS198 was constructed by inserting EZ-Tn5TM Tnp transposome transposon.Mutants in the mutant library were inoculation at seedling stage of rice IR24,the mutant 48#virulence increased on IR24,and named it#48-Tn5.Southern hybridization method was taken to confirm the Tn5 mutants was single-site insertion.HiTail-PCR subcloning confirms Tn5 insertion position.The insertion mutant library of OS198 was constructioned,screening for OS198 virulence mutants,this work laid the foundation for further studying the mechanism of OS198 broad hypovirulence.

  KEY WORDS:Xanthomonas oryzae pv.oryzae;EZ-Tn5;the insertion-mutant strains;

  水稻白叶枯病害,是由水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae Xoo)引起,是水稻上重要的病害,OS198是水稻白叶枯菌中国系统6号小种的代表菌株,它在24个包括IRBB系列和地方品种的水稻上均表现弱毒力。构建水稻白叶枯菌OS198突变体文库是进行新基因发掘与功能基因组研究的有效途径之一,获得突变体的方法有很多种,包括物理突变、化学诱变、RNA干扰、基因敲除和插入突变等。与其他的方法相比,插入突变能够简单、大量、快速产生随机突变体。为了从全基因组范围内探究OS198广谱低毒力机制,本研究采用EZ-Tn5TM Tnp Transposome转座子试剂盒,构建了Tn5转座子介导的插入突变体文库。该突变体文库包含1000个插入突变体,通过剪叶接种的方法来筛选毒力调控突变体。

  1材料与方法

  1.1供试水稻品种

  本研究中用于毒力筛选测定的水稻品种为IR24

  1.2供试菌株

  本研究中所涉及的供试菌株为中国系统的6号小种代表菌株OS198。

  1.3培养条件

  1.3.1培养基和缓冲液

  (1)SOC液体培养基(Super-Optimal Broth with Catabolite liquid medium)

  胰蛋白胨(Tryptone)2 g

  酵母粉(Yeast Extract)5 g

  氯化钠(NaCl)0.6 g

  氯化钾(KCl)0.5 g

  六水合氯化镁(MgCl2.6H2O)2.0 g

  硫酸镁(MgSO4)1.2 g

  校对电子天平,称取上述物质于量筒中,加入900 mL去离子水,玻璃棒搅拌至完全溶解,调pH值至7.0~7.2,再加入去离子水定容至1 L,分装后高温高压(121℃,110 kPa)灭菌20 min。

  配制1M的Glucose溶液:将18g Glucose搅拌完全溶解在90mL的超纯水中,将溶液pH值调至7.0~7.2,定容到100mL。用0.22μm细菌过滤器过滤细菌。向100mL的SOC培养基中加入过滤灭菌的1M Glucose溶液2mL,混合均匀。

  SOC固体培养基:每1000 mL的SOC液体培养基中加入15 g琼脂条或琼脂粉(Agar)。

  (2)TSA液体培养基(Tryptic Soy Agar liquid medium)

  胰蛋白胨(Tryptone)10 g

  蔗糖(Sucrose)10 g

  谷氨酸(Glutamic acid)1 g

  在校对正确电子天平上称取上述物质,加入900 mL去离子水,搅拌至完全溶解,调pH值至7.0~7.2,再加入去离子水定容至1 L,分装后高温高压(121℃,110 kPa)灭菌20 min。

  (3)NB培养基(Nutrient broth liquid medium)

  牛肉浸膏(Beef Extract)3 g

  酵母粉(Yeast Extract)1 g

  多聚蛋白胨(Polypeptone)5 g

  蔗糖(Sucrose)10 g

  在校对正确电子天平上称取上述物质,加入900 mL去离子水,搅拌至完全溶解,调pH值至7.0~7.2,再加入去离子水定容至1 L,分装后高温高压(121℃,110 kPa)灭菌20 min。

  NA固体培养基(Nutrient broth agar medium):每100 mL NB液体培养基加入1.5 g琼脂条或琼脂粉(Agar)。

  (4)LB液体培养基(Luria-Bertani broth liquid medium)

  胰蛋白胨(Tryptone)10 g

  氯化钠(NaCl)10 g

  酵母粉(Yeast Extract)5 g

  在校对正确电子天平上称取上述物质,加入900 mL去离子水,搅拌至完全溶解,调pH值至7.0~7.2,再加入去离子水定容至1 L,分装后高温高压(121℃,110 kPa)灭菌20 min。

  LB固体培养基(Luria-Bertani broth agar medium):每100 mL LB液体中加入1.5 g琼脂条(Agar)。

  1.3.2抗生素

  抗生素质量终浓度为:卡那霉素(Kanamycin,Km)50g/mL;壮观霉素(Spectinomycin,Sp)50g/mL;氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)60g/mL。

  1.3.3培养条件

  水稻白叶枯病菌Xoo于NA或NB培养基上,28℃生长;大肠杆菌Escherichia coli于LB培养基中,37℃培养。

  1.4引物设计与合成

  本实验引物设计使用Primer Premier 5软件,PCR验证Tn5是否插入、hiTail-PCR分离侧翼序列,确认Tn5插入位置、功能互补菌株所使用的引物详见表1-1。

  表1-1本研究中使用的引物序列

  Gene or segment nameSequence(5’→3’)SP1GATAGATTGTCGCACCTGATTGSP2AAGACGTTTCCCGTTGAATATGSP3GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGAC1ACGATGGACTCCAGAGXAD9(A/T)CAGNTG(A/T)TNGTNCTGKAN-2FPACCTACAACAAAGCTCTCATCAACCKAN-2RPGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGOSadhF1GGATCCTGCGTAGCTGAGTGGACTGCCTACOSadhR1CTGCAGGCTCAGCTTGCTGCTGCGATCGGTTTable 1-1 Primer sequence used in this study

  SP1,SP2and SP3 are complementary to left end end the transposon.

  The“N”in the AD primer sequence indicates any of the four bases:A,T,G,C.

  SP1,SP2,SP3,XAD9 primer sequences are according to reference(Qi hong Sun et.al,2003).

  1.5插入突变体库的构建

  1.5.1黄单胞菌感受态的制备

  (1)在超净工作台中,用灭菌的接种环取少量-80℃保存的黄单胞甘油菌于NA平板,在28℃培养箱培养2~3 d;

  (2)用灭菌的接种环将活化好的黄单胞单菌落转移到20 mL NB液体培养基中,摇床上振荡过夜培养,28℃,200 rpm;

  (3)将培养好的菌液按2%的接种量转接到新鲜的200 mL(置于1L的三角瓶中)培养基(黄单胞菌100 mL TSA+100 mL NB)中,200 rpm 28℃振荡培养至菌液浓度达到OD600=0.7~1.0;取大量的冰,将灭菌的超纯水、10%甘油、50mL离心管置于冰上预冷,同时预冷4℃离心机;

  (4)在无菌超净工作台中,在冰上将培养好的无污染的菌液转移到已完全预冷的50 mL灭菌的离心管中。4℃,5000 rpm,10 min离心收集菌体;

  (5)用枪轻轻吸取上清液,先加入少量灭菌的去离子水,在冰上轻轻旋转至磨散离心管底部的菌体,最后继续动作轻柔地加入适量灭菌水,不要超过离心管容积的2/3。4℃,10 min,5000 rpm离心;

  (6)在冰上吸取上清,用枪加入适量的预冰的10%的灭菌甘油,重复步骤5;

  (7)200 mL的菌液加入4~5 mL的预冰的10%甘油,在冰上轻轻旋转至磨散离心管底部的菌体,在冰上分装制备好的感受态细胞于2.0 mL离心管中,液氮速冻,-80℃保存备用;

  1.5.2转座子电转化黄单胞菌

  (1)-80℃保存的感受态细胞(制备方法参考1.5.1)在冰上解冻,无菌条件下,将用枪吸取0.5~1L的待转化的Tn5转座子加入到50μL的刚解冻的黄单胞菌感受态细胞中,轻轻吸打混匀,置于冰上1 min,预冷的灭菌0.2 mm电击杯;

  (2)在超净工作台中,将混匀的Tn5转座子和感受态细胞转入到预冷的灭菌0.2 mm电击杯中,动作轻柔,盖上电击杯盖子后置于冰上;

  (3)打开电转化仪电源开关,设置程序Bacterical,Ec2(电压为2.5 kV);擦干净电击杯上的水滴,将电击杯放置于电击槽中;手指轻按电击键“pulse”,听到“吱”一声;

  (4)电击结束后立刻取出电击杯,在超净工作台中迅速加入500L SOC复苏培养液,用枪轻轻吸打混匀,将混合物转移到灭菌EP管中,28℃,200 rpm摇床振荡培养1.5~2 h;

  (5)不离心。取100L左右培养液,涂布在含卡那霉素的SOC平板上,28℃培养箱培养3~5 d。剩余培养液用液氮速冻后于-80℃保存备用;

  (6)得到的单克隆转化子即为OS198插入突变体,编号并保存-80℃;

  1.5.3插入突变体库的PCR验证

  在构建的插入突变体文库中随机挑选突变体,通过PCR验证是否有Tn5转座子的插入。PCR验证上游引物Kan-2-F1/R1,序列见表1-1。扩增片段大小约750 bp,扩增条件:94℃,5 min;94℃,30 s,57℃,30 s,72℃,30 s,32个循环;72℃,10 min。

  1.6 OS198Tn5插入突变体的致病力测定

  1.6.1毒力突变体在水稻上的毒力的测定

  在NA平板上活化突变体库菌株,37℃,培养24~48 h。刮取新鲜菌体,用灭菌水配制成OD600=0.5的菌悬液,在生长期为30~40d的水稻IR24上剪叶接种。每个突变体菌株需要至少5株生长良好的水稻,在心叶下2张完全展开的叶片进行剪叶接种。接种15 d后测量并记录病斑长度。

  1.6.2水稻中细菌生长曲线的测定

  每个处理取3张待测的水稻叶片,测定水稻中细菌生长曲线。酒精棉给叶片表面消毒后,放置在加入了3 mL灭菌水(每张叶片加1mL)中的研钵中研磨,研磨后取100μL含菌组织液经10倍梯度稀释后各取5μL涂在含相应抗生素的NA平板上,每处理设3次重复,28℃培养3~5 d后,选择可数单菌落的最低稀释倍数的平板计数,并推算原来每张叶片中的菌落数(cfu)。

  插入突变体侧翼序列的分离

  (1)本研究采用hiTAIL-PCR分离插入突变体的侧翼序列。hiTAIL-PCR程序设置如下表

  表1-2三轮hiTAIL-PCR程序

  反应顺序

  循环数hiTAIL-PCR

  Pre-amplification

  193℃2´,95℃1´1094℃30〞,60℃1´294℃30〞,25℃2´,ramping to 72℃over 3´172℃3´2594℃20〞,58℃1´,72℃3´172℃5´Primary

  TAIL-PCR

  194℃20〞,65℃1´,72℃3´1394℃20〞,68℃1´,72℃3´94℃20〞,68℃1´,72℃3´94℃20〞,45℃1´,72℃3´172℃5´SecondarYTAIL-PCR1294℃20〞,68℃1´,72℃3´94℃20〞,68℃1´,72℃3´94℃20〞,50℃1´,72℃3´172℃5´

  (2)hiTAIL-PCR用平末端酶(Takara公司)扩增,反应体系(总体积25μL)如下:

  10×Ex Taq Buffer(Mg2+free)2.5μL

  MgCl2(25 mM)2μL

  dNTP Mixture(各2mmol.L-1)2μL

  SP 0.3μL(0.2μM)

  AC1、XAD9 0.6μL(1.0~4.0μM)

  Ex Taq聚合酶0.25μL

  模板1~2.5μL

  灭菌超纯水补足至25μL

  注意:第一轮的PCR产物稀释1000倍后取1μL作为模板DNA用于第二轮PCR;第二轮PCR产物稀释500倍,取2.5μL作为模板DNA用于第三轮PCR。可以减少非特异性扩增。

  PCR后电泳,割胶回收PCR产物,第三轮PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测后胶回收后亚克隆序列分析。

  (3)琼脂糖凝胶电泳检测,使用GENECLEAN III Kit(MP Biomedicals公司)回收目的片段。操作过程如下:

  ①将在琼脂糖凝胶中电泳的PCR产物放置在UV紫外灯下,小心切取目的条带,放置在1.5 mL已称重的离心管中称重,计算切割的凝胶的质量;

  ②向离心管中加入3倍凝胶体积量(以100 mg=100L进行计算)的NaI;

  ③加入5L EZ-glassmilk,置于50℃水浴锅中使其完全融化,其间要不断的振荡混匀;

  ④取出样品在冰上放置3 min;

  ⑤加入500L New Wash,吸打混匀,10000 rpm离心1 min,倒掉上清;

  ⑥重复上述步骤,尽量完全吸净残留液体;

  ⑦加入12L灭菌超纯水,吸打悬浮的白色沉淀,室温下静置2 min;

  ⑧最大转速离心1 min,上清即为回收DNA;

  插入突变体Southern blot鉴定

  Southern blot是将野生型和突变体的基因组DNA完全酶切,毛细管法将酶切的DNA转移到Hybond N+尼龙膜上,用DIG High Prime DNA标记检测试剂盒将DIG-11-dUTP标记到抗卡那霉素基因上,用作探针杂交,以验证转座子在突变体上的插入及插入的拷贝数。

  1.9细菌基因组DNA的提取

  本研究采用试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit,天根生物公司)提取细菌基因组DNA。具体步骤如下:

  (1)2.0 EP管收集菌液,10000 rpm离心1 min,尽量吸净上清;

  (2)向上述菌体沉淀中加入200μL buffer BTL充分混匀重悬,37℃孵育10~30 min,期间颠倒离心管几次;

  (3)向管中加入20μL Proteinase K(20mg/mL)溶液,混匀。置于55℃水浴10~30 min,每5 min震荡一次,直至完全溶解细菌;

  (4)加入5μL的RNase A,反复颠倒混匀,室温孵育5 min;

  (5)加入220μL缓冲液BL,在震荡器上振荡20 s,放置在70℃水浴锅中10 min,菌体完全裂解时,溶液由浑浊变为澄清;

  (6)加220μL的无水乙醇,在震荡器上充分涡旋振荡,或会出现絮状沉淀,低速离心,将盖内壁的水珠离心到管底部;

  (7)将步骤6中所得上清液全部转移到吸附柱中(吸附柱放入收集管中),12000 rpm,离心30 s,弃废液;

  (8)加入500μL缓冲液buffer WB,12000 rpm离心30 s,弃废液;

  (9)加入600μL Wash Buffer(加之前确认Wash Buffer中是否加入乙醇),12000 rpm,离心30 s,弃废液;

  (10)重复操作步骤9;

  (11)12000 rpm,离心2 min,弃废液;

  (12)将吸附柱转到1.5mL离心管中,悬空加入20~30μL的60℃预热超纯水,室温放置2~5 min,12000 rpm,离心2 min。收集溶液到离心管中,-20℃保存备用;

  1.10质粒的提取

  本研究采用捷倍思公司试剂盒提取质粒DNA。操作过程如下:

  (1)在超净工作台中,灭菌的接种环挑取少量-80℃保存的大肠杆菌甘油菌于20ml的LB液体培养基中,加入相应的抗生素。在摇床上,37℃,180 rpm过夜振荡培养;

  (2)12000 rpm离心3 min,收集培养好菌液,弃上清;

  (3)向收集到菌体中加入250L Buffer 1,充分涡旋,悬浮菌体;

  (4)加入250L Buffer 2,动作轻柔地上下颠倒EP管6~7次直至溶液完全澄清(目的是完全裂解收集的菌体沉淀),,时间不超过5 min;

  (5)打开EP管,检查管口是否有菌体拉丝。再加入350L Buffer 3,动作轻柔地上下颠倒EP管7~8次,使形成紧实的菌体沉淀。12000 rpm,离心10~15 min;

  (6)尽量吸取步骤5中的上清至DNA吸附柱中,DNA吸附柱置于干净的2.0 mL离心管中,12000 rpm离心1 min,弃滤液;

  (7)DNA吸附柱中加500L Wash 1,12000 rpm离心1 min,弃滤液;

  (8)DNA吸附柱中加入700L Wash 2,12000 rpm离心1 min,弃滤液;

  (9)重复步骤8一次;

  (10)12000 rpm空柱离心1 min,室温放置2 min;

  (11)将DNA吸附柱移至干净的1.5 mL离心管中,往DNA吸附柱加20~30L 60℃预热的灭菌水,室温静置5 min,DNA尽可能多的融解在灭菌水中。12000 rpm离心3 min,收集DNA,-20℃保存备用;

  1.11质粒和载体的酶切回收

  (1)使用限制性内切酶(TaKaRa公司)对目标质粒和载体进行酶切。酶切反应体系(总体系体积20L):

  10×Buffer 2L

  目标质粒DNA或载体≤1g

  限制性内切酶1l

  灭菌超纯水补足至20l

  双酶切体系中,两种酶总体积不超过酶切反应体系体积的1/10

  用枪轻轻吸打混合均匀,置于37℃水浴锅中反应2~3个小时。

  (2)用CIAP(Calf Intestine Alkaline Phosphataes)(TaKaRa公司)将单酶切产物去磷酸化,以防载体自连。去磷酸化反应体系(总体系体积50L):

  单酶切回收的载体20 pmol

  10×Alkallme phosphatase Buffer 5L

  CIAP 1L

  灭菌超纯水补足至50L

  轻轻混匀后置于37℃水浴锅反应30 min,短暂离心后加1L CIAP,混匀37℃反应30 min;70℃灭活反应10 min。

  1.12连接

  本研究使用Solution I(TaKaRa公司)对回收的目标基因片段和去磷酸化处理的载体片段进行连接。连接体系如下(总体系体积10L):

  目的基因片段2L

  载体DNA片段1L

  灭菌超纯水2L

  Solution I 5L

  混匀后在4℃过夜连接

  1.13连接产物的转化

  1.13.1大肠杆菌(E.coli DH5α)感受态的制备

  (1)在LB平板上活化-80℃保存的DH5α甘油菌,37℃培养箱中过夜培养。接种环挑取单菌落于20 mL LB液体培养基中,在37℃摇床中,180 rpm振荡过夜培养;

  (2)按1%接种量转接上述菌液至LB液体培养基中,在37℃摇床中,180 rpm,振荡培养1~2 h,至菌液浓度达到OD600=0.5,在冰上预冷菌液;

  (3)50 mL的灭菌离心管中收集预冷菌液(离心管在冰上预冷),5000 rpm,4℃离心10 min,在纸上轻叩以去除上清;

  (4)加入5 mL冰浴的0.1 M CaCl2,用枪轻轻吸打悬浮菌体沉淀,再在冰上浴冷10 min;

  (5)5000 rpm,4℃离心10 min,弃上清,收集菌体;

  (6)最后悬浮菌体用2 mL冰浴的含10%甘油的0.1 M CaCl2。在冰上分装菌液,每管100L,液氮速冻后置于-80℃保存备用。

  注:在低温无菌条件下制备大肠杆菌感受态细胞,制备过程操作应该尽可能的轻柔。也可以在制作完后,设置对照实验,热转化转化质粒,以验证感受态的转化效率。

  1.13.2连接产物的热激转化

  (1)取-80℃保存的大肠杆菌(E.coli DH5α)感受态细胞,放在冰上;

  (2)在超净工作台中,取连接产物3~5L加入50L刚融化大肠杆菌(E.coli DH5α)感受态细胞,在2.0 mL离心管中,用枪轻轻吸打混合均匀,静放置在冰上20~30 min;

  (3)将步骤2中的冰浴的混合菌液置于42℃水浴锅中,热激90 s,拿出来放在冰上冷却2~3 min;

  (4)向离心管中加入10倍体积的LB液体培养基,37℃摇床振荡培养1~1.5h;

  (5)5000 rpm离心3 min,弃上清,保留100L培养液,混匀后涂布在选择性LB平板(含相应抗生素)上;

  (6)37℃培养箱中培养12~16 h;

  (7)挑取单菌落于加有相应抗生素的LB液体培养液中,37℃,180 rpm振荡过夜培养,提取质粒并进行酶切验证和测序。

  1.14核酸电泳缓冲液

  50×TAE Buffer(母液)

  Tris 242 g

  冰乙酸57.1 mL

  EDTA(0.5 mol/L pH 8.0)100 mL

  加800 mL超纯水,搅拌至完全溶解,调溶液pH值至8.5,再加超纯水定容至1 L。

  工作液(1×TAE Buffer):母液:超纯水=1:50配制。

  1.15序列测定

  将酶切验证正确的质粒使用通用引物M13F/R和Tn5(F/R)在北京擎科生物科技有限公司进行序列测定。

  2结果与分析

  2.1 OS198突变体库的构建

  运用EZ-Tn5TM Tnp Transposome转座子插入的方法构建水稻白叶枯病菌OS198的插入突变菌株库,突变菌株库包含了1000个插入突变体,编号1~1000,保存在-80℃冰箱。随机从文库中挑选的编号为75,77,91,94,126,127突变体菌株经PCR验证,均有Tn5的插入(图1-1)。

  图1-1 OS198突变体文库的PCR验证

  Fig.1-1.PCR confirmation of mutant library

  +:已知有Tn转座子插入的菌株;-:野生型的OS198;75,77,91,94,126,127从文库中随机挑选的Tn5插入突变体;M1:DL2000marker;验证所用的引物为Kan-2-F1/R1,引物序列见表1-1.

  +:strains with inserted Tn transposon;-:OS198 wild type;75,77,91,94,126,127 insertion mutants were randomly selected from the mutant library;M1:DL2000marker;The primers used to be verified were Kan-2-F1/R1,the primers sequences are shown in Table 1-1.

  2.2突变体的致病力测定

  在苗期水稻IR24上剪叶接种了OS198的Tn5插入突变体中编号为1~400的400个菌株,了解这些突变体的毒力变化。接种15d后调查病斑长度,结果发现:与野生型OS198相比,大部分的Tn5插入菌株毒力变化不明显,但第48号插入突变菌株(命名为#48-Tn5)在水稻IR24上的剪叶病斑长度明显增长,病斑长度平均增加了8cm,具有显著性差异(P﹤0.01)(图1-2A,B)。比较了接种叶片中的细菌菌落数,与野生型OS198相比,#48-Tn5插入突变菌株的细菌含菌量明显增加,具有显著性差异(P﹤0.01)(图1-2C)。

  图1-2#48-Tn5插入突变体在IR24上的毒力测定

  Fig.1-2 Virulence assay of mutant strains on IR24

  突变体和野生型菌株在水稻IR24上形成的病斑;B.突变体和野生型菌株在水稻IR24上病斑长度;C.突变体和野生型菌株在水稻IR24上细菌菌含量的测定.实验在相同条件生物学重复3次,每次处理设置3个重复。*表示在p<0.01水平上差异显著。

  A.Symptoms on IR24 leaves 15 d after leaf-clipping inoculation with OS198 and#48-Tn5.The photo was got after 15 dpi;B.lesion lengths of mutant and wild-type strains on rice IR24;C.Bacterial populations were measured after 15 dpi.Virulence assays were performed seedling stage IR24 leaves.Measurements of lesion lengths and bacterial populations were performed 15 dpi.The experiment was repeated 3 times in the same condition and 3 replicates were set for each treatment.The asterisk indicates a significant difference in t-test at p<0.01.Error bars represent±SD.

  2.3插入突变体Tn5插入拷贝数的验证

  本研究采用Southern blot杂交确认插入突变体Tn5插入拷贝数,杂交结果显示:BamHⅠ酶切杂交位点在7743bp处,且只有一个杂交点,EcoRⅠ酶切杂交位点在约1882 bp处,且也只有一个杂交点,结果说明转座子Tn5为单拷贝数插入野生型OS198基因组(图1-2A)。

  设计插入位点上下游的引物OSadhF1/R2:GGATCCTGCGTAGCTGATGTGGAC

  TGCCTAC/CTGCAGGCTCAGCTTGCTGCTGCGATCGGTT,分别扩增野生型和突变体的DNA,结果显示:与野生型菌株扩增的片段相比,#48-Tn5菌株扩增片段比野生型OS198增加了1.2 kb(Tn5转座子大小为1.2 kb)(图1-2B),说明该突变株确为转座子插入突变体,且转座子没有发生附带侧翼的二次转移。

  图1-3#48-Tn5突变体Southern杂交和PCR验证

  A.1:BamH I酶切;2:EcoR I酶切;M1:λ-EcoT14 marker;B.1:OS198;2:#48-Tn5;-:ddH2O;M2:DL15000 marker

  Fig.1-2.Mutant Southern blot and PCR

  A.Southern blot hybridization of mutant strain.Genomic DNA was digest with BamH I and EcoR I and hybridized with Km resistance gene aph.M.λ-EcoT14 I digest;B.1:OS198;2:#48-Tn5;-:ddH2O;M2:DL15000 marker

  2.4插入突变体侧翼序列的分离和分析

  胶回收hiTail-PCR第三轮PCR产物与T-pMD18 Vector进行连接反应。连接产物转化大肠DH5α在含抗生素的板上筛选到4个克隆。将4个克隆全部送测序,测序引物选用Tn5(F/R)和通用引物M13(F/R),序列测定完成后得到的序列用NCBI的Blast align two sequence程序完成序列拼接。测序结果表明:Tn5转座子插入到OS198基因组上与粘附相关的基因adhesin-like protein(ALP),在该基因的启动子CDS序列ATG端1499 bp,TAA end 2299 bp处。对ALP基因进行全序列测定并进行分析,发现该基因全长3798bp,编码1266个氨基酸。

  应用GeneBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的Blast程序进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较。Blast分析发现,该基因与与PXO99A中的该基因(基因的登录号CP000967.2)有因有99%的一致性。该基因编码的氨基酸序列与黄单胞菌株韩国KACC10331中的(基因登录号AAW74096.1)的外膜蛋白(outer membrane protein)具有99%的一致性。

  应用序列分析软件Bioxm 2.7对ALP基因编码氨基酸进行分析,发现该基因编码氨基酸中脂肪族氨基酸占54.5%,醇羟基氨基酸占18.25%,酸性氨基酸15.09%,其他氨基酸类型占有的比例少,芳香族氨基酸,碱性氨基酸,含硫氨基酸分别占4.19%,5.45%,2.52%。

  SHAPE\*MERGEFORMAT3讨论

  Tn5转座子诱变技术应用十分广泛,与传统的基因诱变技术相比Tn5转座子诱变技术有以下几个优点:(1)Tn5转座子载体均为自杀性的载体,只有在特定的宿主菌中才能发生复制;(2)转座子序列区域包含抗性基因,可以方便筛选突变体菌株;(3)Tn5可以抑制本身的转座,确保单拷贝插入靶标菌株,方便突变性状的筛选;(4)转座子携带一段已知长度大小的DNA序列,所以比传统的诱变方法更容易定位到插入位点;(5)由于Tn5转座子上的转座酶不发生转座,所以转座子在靶标菌株的DNA上可以稳定存在,稳定突变菌株的性状。构建水稻白叶枯菌OS198突变体文库是进行新基因发掘与功能基因组研究的有效途径之一,获得突变体的方法有很多种,包括物理突变、化学诱变、RNA干扰、基因敲除和插入突变等。与其他的方法相比,插入突变能够简单、大量、快速产生随机突变体。为了从全基因组范围内探究OS198广谱低毒力机制,本研究采用EZ-Tn5TM Tnp Transposome转座子试剂盒,构建了Tn5转座子介导的插入突变体文库。该突变体文库包含1000个插入突变体,通过剪叶接种的方法来筛选毒力调控突变体。故本研究采用EZ-Tn5TM Tnp Transposome转座子插入的方法构建了水稻白叶枯病菌弱毒力菌株OS198的插入突变菌株库,从OS198全基因组水平上挖掘低毒力相关基因。突变体库包含1000个突变菌株,转座子是否插入到OS198基因组中,本研究采用PCR验证。

  对突变体库中编号1~400的插入突变体在苗期水稻IR24上进行致病力测定,获得毒力增加的突变体,命名为#48-Tn5。获得毒力增加的突变体#48-Tn5后需要解决的一个问题是如何确认转座子的插入位置。解决的方法,一是采用hiTail-PCR扩增已知序列旁邻的未知DNA序列,PCR中所使用的引物为简并引物AC1和XAD9,再加上自行设计的特异引物SP1、SP2、SP3。为了减少非特异性扩增,本实验中在第一轮的PCR产物稀释1000倍后取1μL(模板DNA 1μL)用于第二轮PCR;第二轮PCR产物稀释500倍,取2.5μL(模板DNA 2.5μL)用于第三轮PCR。根据特异性引物设计的原则,第二轮PCR所扩增的片段比第三轮PCR扩增的片段要大。回收第三轮hi-TAILPCR扩增的基因片段,连接到克隆载体pUC19,送测序。另外,本研究将引用的hi-TAILPCR程序设计做出调整,在SecondaryTAIL-PCR增加了第二阶段的循环次数,将原来6~7个循环增加到12个循环(Sun et.al,2003);另一个途径通过Southern杂交,在Southern杂交中,marker为λ-EcoT14Ⅰdigest,Tn5转子上没有BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点。BamHⅠ酶切杂交位点在7743bp处,且只有一个杂交位点,EcoRⅠ酶切杂交位点在约1882bp处,且也只有一个杂交点,结果说明转座子Tn5为单位点插入野生型OS198基因组。回收部分Southern杂交中EcoRⅠ酶切#48-Tn5过夜电泳7743 bp处条带,连接克隆到载体pUC19,送测序。本研究采用以上两种方法,测序结果都表明:转座子Tn5插入在OS198菌膜蛋白adhesin-like protein使ALP基因发生突变。研究采用EZ-Tn5TM Tnp Transposome转座子插入的方法构建了水稻白叶枯病菌OS198的插入突变体菌株库。通过对突变体库中400个插入突变体剪叶接种苗期水稻IR24,筛选到了毒力增加的突变体,命名为#48-Tn5。hiTail-PCR方法分离转座子插入位点侧翼序列,测序结果表明转座子插入到粘附素adhesin-like protein(ALP)基因,该基因全长3798bp,编码1266个氨基酸。Blast分析发现,该基因编码的氨基酸序列与黄单胞菌株韩国KACC 10331(基因登录号AAW74096.1)的外膜蛋白(outer membrane protein)具有99%的一致性,该蛋白的功能未知。经Southern杂交和PCR验证确认了Tn5在#48-Tn5中单位点插入且未发生转座子携带侧翼序列转移。将ALP基因克隆到具有广寄主范围的质粒pHM1上,将重组质粒pHMALP电转化#48-Tn5突变体后,突变体恢复到野生菌OS198在其寄主水稻品种IR24上的弱致病力,并测定了#48-Tn5对17个IRBB系列水稻品种、7个地方品种和1个IR系列水稻品种的致病力,发现#48-Tn5菌株在水稻IR24和IRBB13上的毒力增加,说明水稻黄单胞菌OS198中的ALP基因与其致病力相关,在侵染水稻的过程中起着非常重要的作用。

  第二章ALP基因缺失突变及互补菌株的构建

  摘要:本研究采用基于同源重组原理的基因敲除方法构建OS198的ALP基因敲除载体pk18mobALP,采用两亲交配的方法获得OS198的ALP基因的缺失突变菌株,经PCR验证获得ALP基因的缺失突变菌株OS198ΔALP,并将编码OS198 ALP基因的重组质粒pHM ALP电击转化相应的突变菌株。提质粒经酶切验证获得了ALP基因功能互补菌株。本研究构建的ALP基因缺失突变菌株、功能互补菌株,为进一探究ALP基因的功能奠定了实验基础。

  关键词:水稻白叶枯病菌;ALP基因;缺失突变菌株;功能互补

  CONSTRUCTION OF THE DELETION MUTANTS AND THE FUNCTIONAL COMPLEMENTATION TRANSFORMANTS OF ALP GENE

  ABSTRACT:ALP gene knock-out mutant was generated from OS198 based on double crossover homologous recombination.The method of amphiphilic mating to get the the ALP gene deletion mutant.PCR method was taken to confirm the mutant OS198ΔALP.The plasmid pHMALP containing the ALP coding sequence was then electroporated into the ALP mutant respectively to construct the complementation strain.The plasmid was obtained and digested to conform that the functional complement of ALP gene.This work laid the foundation for further explorating the function of ALP gene in OS198 strian.

  KEY WORDS:Xanthomonas oryzae pv.oryzae;ALP gene;the deletion-mutant strain;functional complementation

  水稻白叶枯病菌OS198的ALP基因的功能尚无报道。为了挖掘OS198的ALP基因功能,本研究采用基于同源重组的基因敲除方法构建了ALP基因敲除载体pk18mobALP,采用两亲交配的方法获得OS198的ALP基因的缺失突变菌株。将已构建好的含ALP编码基因的质粒pHMALP电击转化相应OS198 ALP突变菌株和插入突变菌株#48-Tn5,获得回补菌株,用于后续研究。

  1材料与方法

  1.1菌株和质粒

  本研究所涉及的菌株和质粒见下表。

  表2-1供试菌株和质粒

  Table 2-1.Strains and plasmids used in this study

  DesignationRelevant characteristicsSourcesXanthomonas oryzae pv.oryzae strainsOS198Xoo strain,China race 6Lab collectionOS198ΔALPALP mutant derived from OS198This studyOS198ΔALP/pHMALPOS198ΔALP complemented with pHM1 ALP;Spr

  This study#48-Tn5/pHMALP#48-Tn5 complemented with pHM1 ALP;Spr

  This studyE.coilDH5αF´recA,N80dlacZ,△M15VazymeS17-1RP4-2-TC::Mu-Km::Tn7 pro hsd recALab collectionPlasmidspHM1Broad host range vector;SprLab collectionpHMALP8 kp fragment including promoter region of ALPgene ligated in pHM1;SprThis study454Plasmid including promoter region of ALPgene

  from OS198Lab collectionpK18mobKmr RP4Mob;mobilizable cloning vectorLab collectionpMD19-T vectorCloning vector;KmrTakarapUC19 vectorCloning vector;AmprTakara

  1.2培养基、培养条件和抗生素

  同第二章

  1.3引物设计与合成

  本实验引物设计使用Primer Premier 5软件,用于构建ALP缺失突变重组菌和功能互补菌

  表2-2本研究中所用的引物序列

  segment nameSequence(5’→3’)OSadhF1GGATCCTGCGTAGCTGATGTGGACTGCCTACOSadhR1CGTTGATGCAATTACGCGGCACGATTCCTGAGTTGTTGGAOSadhF2AATCGTGCGCCGCGTAATTTGCATCAACGCGGCGGCGOSadhR2CTGCAGGCTCAGCTTGCTGCTGCGATCGGTTadhFOTTGCGTCAGCCTCGTTCATCadhROTGGACACCACGTCGTCTTTable 2-2.PCR primers used in this study

  1.4 ALP基因敲除载体的构建

  ALP基因敲除重组体采用PCR的方法构建。

  克隆过程如下:

  第一步,以野生菌OS198的基因组DNA为模板,用两对引物OSadhF1/R1和OSadhF2/R2,高保真酶进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳,胶回收分别获得ALP基因两端的同源臂OSadhF1,OSadhF2;

  第二步,以回收的OSadhF1和OSadhF2片段为模板,用引物OSadhF1/OSadhR2,ExTaq酶进行扩增,获得ALP基因两端的同源臂融合在一起的片段OSadhF1F2。再利用TA克隆将OSadhF1F2片段连接到pMD19-T Vector上(Takara公司),热转化大肠杆菌,在含抗生素的平板上筛选转化子,提质粒并进行BamHⅠ和SalⅠ酶切验证,将酶切验证正确的质粒送测序。选择测序正确的克隆用BamHⅠ和SalⅠ酶切,胶回收片段OSadhF1F2连接到用BamHⅠ和SalⅠ酶切过的pK18mob,热转化大肠杆菌,在含抗生素的平板上筛选转化子,提质粒并进行BamHⅠ和SalⅠ酶切验证,酶切可得约1315bp的条带,即成功构建ALP基因敲除重组体pK18mobALP。

  (1)第一步,PCR用高保真酶Q5 DNA polymerase(Takara公司)扩增,反应体系(总体积25μL)如下:

  5×Q5 Buffer(含Mg2+)5μL

  dNTP Mixture(各10 mM)0.5μL

  上游引物1.25μL

  下游引物1.25μL

  Q5 DNA polymerase(5U/μL)0.25μL

  模板1μL

  灭菌超纯水补足至25μL

  (2)第二步中PCR用Ex Taq酶(Takara公司)扩增,反应体系(总体积25μL)如:

  10×Ex Taq Buffer(Mg2+free)2.5μL

  MgCl2(25 mM)2μL

  dNTP Mixture(各2.5 mM)2μL

  上游引物1μL

  下游引物1μL

  Ex Taq聚合酶0.25μL

  模板DNA 2μL

  灭菌超纯水补足至25μL

  (3)PCR反应条件如下:

  94℃,1 min;

  98℃,10 s;68℃x min(延伸时间为每500 bp 30s),32个循环;

  72℃,10 min。

  PCR后电泳,割胶回收PCR产物。

  1.5黄单胞菌的抗性标记

  (1)挑单菌落于20mL的NB液体培养基中初摇至OD600=0.7;

  (2)在50 mLNB培养基中加入20~30L的抗生素,初摇的菌液按1:50的比例转接到50 mL的NB液体培养基中复摇至OD600=0.7;

  (3)收集菌体于2 mL的离心管中,5000 rpm,3min。在标记的抗生素的平板上涂板(尽量多涂几个板,增大筛选几率);

  (4)28℃,培养4~5天;

  1.6黄单胞菌的转化方法

  1.6.1电转化法

  方法参考1.4.2

  1.6.2冷冻转化法(戴雷,1995)

  (1)活化黄单胞甘油菌,用灭菌的接种环挑取单菌落接种于NB液体培养基中,在28℃摇床上,200 rpm振荡培养;

  (2)将1 mL上述菌液转接到100 mL NB液体培养基中,在28℃摇床上,200 rpm振荡培养6~8 h,使黄单胞菌达到对数生长期(OD 600=0.7~1.0),在冰上预冷菌液30min;

  (3)在超净工作台中,用预冷的50ml离心管收集预冷菌液。在4℃离心机中,5000 rpm离心10 min;

  (4)用预冷的10 mM Tris-HCl(pH 7.4)轻轻洗涤两次,再用2 mL该溶液悬浮菌体;

  (5)将100L上述悬浮的菌液转移到2.0 mL EP管中,再加入50L 5g/mL的待转化质粒DNA,用枪轻轻吸打混匀后置于液氮中冷冻1 min,严格控制在液氮中冷冻时间;

  (6)置于37℃水浴锅中反应30 min;

  (7)在4℃离心机中,10000 rpm离心30 s,弃掉部分上清,保留200L左右培养液,混匀后涂布在含相应抗性的NA平板上,置于28℃培养箱培养3~5 d;

  两亲交配转化

  (1)在NA培养基上活化野生型OS198,挑单菌落接种于20 mL NB液体培养基中。28℃,200 rpm摇床振荡培养至OD600=0.9;同时培养转入敲除载体的S17-1菌,37℃,180 rpm振荡OD600=0.9;

  (2)各收集8 mL的菌液,5000 rpm,3min,弃上清,再用超纯水悬浮菌体5000 rpm,3min,洗2~3次(目的是洗去抗生素);

  (3)用无菌的镊子夹灭过菌的滤膜(不可烘干)放在NB板上(培养基必须是供体菌和受体菌都能生长)。可按:(体积比)受体菌:供体菌=1:1,受体菌:供体菌=1:2,受体菌:供体菌=1:3,供体菌:受体菌=1:2,供体菌:受体菌=1:3(受体菌浓度高一点会增加一次交换的概率)吸打混匀,吸50微升滴于滤膜中心超净工作台中自然风干。(4)平板正放,28℃培养箱培养4~5天;

  (5)用无菌的镊子夹起滤膜,两边卷起来放到2mL的离心管中,取800微升新鲜NB液体培养基于离心管中,反复吸打洗涤两亲菌体的地方,直到完全洗掉,用枪头挑出滤膜;

  (6)将所有离心管中的液体6000rpm,3min浓缩,浓缩后合并成一管吸打混匀,取100微升涂抗性为Km+Rif板;

  (7)28℃培养箱培养4~5天,进行单交换子克隆的筛选;

  1.7黄单胞菌的基因敲除

  (1)将构建好的基因敲除载体转化黄单胞菌;

  (2)28℃培养箱培养4~5天,进行单交换子克隆的筛选;

  (3)PCR验证sacB的存在,同时用OSadhF1/R2引物,PCR验证重组体是否存在。并在10%蔗糖板上验证菌落生长情况;

  (4)选择2个PCR阳性,且在蔗糖板上不能生长的克隆,分别接入不含蔗糖的NB培养基中,28℃液体过夜培养,使发生双交换。将菌液涂在含有10%蔗糖,而不含有抗生素的平板上,筛选发生双交换的转化子;

  (5)在Amp平板和Km板上验证,选没有抗性的菌落。再使用位于被敲出除基因区域的引物进行PCR验证,以确保目标基因被敲出;

  1.8 ALP基因回补菌株的构建

  (1)制备ALP基因缺失突变菌株感受态

  方法见1.12。

  (2)电转化

  用引物OSadhF1/R1、OSadhF2/R2,通过PCR从OS198质粒文库筛选包含ALP基因的质粒454。用EcoRⅠ和SalⅠ酶切该质粒获得含ALP基因序列片段约8.0kb,胶回收该片段连接到用EcoRⅠ和SalⅠ酶切的pHM1载体上,热转化大肠杆菌DH5α,在含抗生素的平板上筛选单克隆,采用提质粒酶切验证的方法验证片段是否连接成功,同时将验证正确的克隆送测序。再将测序正确的pHMALP质粒电击转化到OS198ΔALP感受态细胞和#48-Tn5感受态细胞中,涂NA+Sp+Rif和NA+Sp+Km平板。长出的单菌落初步确定为ALP基因缺失突变菌株的功能互补菌株,同样采用提质粒酶切验证的方法确认ALP基因缺失突变菌株的功能互补菌株构建成功。

  2结果与分析

  2.1 ALP基因无痕敲除载体的构建和验证

  为构建ALP基因无痕敲除载体,首轮PCR以野生菌OS198基因组DNA为模板,用引物OSadhF1/R1和OSadhF2/R2扩增获得811 bp的上游同源臂F1、504 bp的下游同源臂F2(如图2-1A)。第二轮PCR目的是将上下游同源臂F1、F2融合,形成大小为1315 bp的融合片段F1F2(如图2-1B)。再利用TA克隆将重组体F1F2连接到pMD19-T载体上,用BamHⅠ和SalⅠ酶切验证并送测序。选测序正确的克隆和pK18mob,用BamHⅠ和SalⅠ酶切,胶回收酶切的片段F1F2连接到pK18mob,构建成ALP基因的无痕敲除载体pKmobALP。该载体经BamHⅠ和SalⅠ酶切验证,酶切条带中包括一条1315bp的条带(如图2-3C),表明ALP基因的无痕敲除载体pKmobALP构建成功。

  图2-1 ALP无痕敲除载体pKmobALP的构建和验证

  Fig.2-1.Construction and confirmation of ALP gene knock-out vector pKmobALP

  A.ALP上、下游同源臂的扩增;1.上游同源臂F1;2.下游同源臂F2;B.F1F2的融合;C.pK18 ALP的BamHⅠ和SalⅠ酶切验证;M1.DL2000 Marker;M2.DL15000 Marker.

  A.PCR amplification of upstream arm and downstream arm of ALP gene using the primer pairs OSadhF1/R1 and OSadhF2/R2,respectively;1.upstream arm F1;2.downstream arm F2;B.Fusion of F1 and F2 using the primer pair OSadh F1/R2;C.pK18mob was confirmed by BamH I and Sal I enzyme digestion.

  2.3水稻白叶枯病菌ALP基因敲除突变体OS198ΔALP的获得和验证

  两亲交配的方法将pKmobALP转化到野生菌OS198,首先在NA+Rif+Km的平板上筛选能够生长的一次单交换插入的转化子,28℃培养箱共培养3~4d。菌落PCR验证一次交换子的sacB的存在,同时用OSadhF1/OSadhR2引物扩增验证重组菌中OSadhF1F2的存在,且一次转化子在含10%蔗糖的NA平板上不能够生长。其次挑选2个验证正确的转化子,分别接入20 mL不含蔗糖的液体培养基中,在28℃摇床中,200 rpm过夜培养,使一次交换子双交换发生。将菌液涂在含有10%蔗糖的无抗生素的NA平板上,筛选能够生长的发生双交换的转化子。在NA+Km的平板上验证,选择没有抗性的菌落。初步确定为ALP基因缺失突变菌株,命名为OS198ΔALP。

  本研究运用PCR对转化得到的ALP基因缺失突变菌株进行验证。以野生型OS198及ALP基因缺失突变菌株基因组DNA为模板,用adh-FO/RO引物,r Taq DNA聚合酶进行PCR验证。野生型OS198能扩增得到499 bp ALP基因的内部片段,而ALP突变菌株扩增不到,说明ALP基因缺失突变菌株构建成功(图2-2)。

  图2-2 OS198ΔALP PCR验证

  Fig.2-2 PCR confirmation of OS198ΔALP

  OS198ΔALP的PCR验证.PCR扩增499 bp ALP基因内部片段;1.OS198ΔALP;+.OS198;-.ddH2O;M.DL2000 Marker

  PCR confirmation of OS198ΔALP by amplifying internal region of ALP gene using the primer pair adh-FO/RO;

  2.5 ALP基因回补菌株的获得和验证

  以本课题组已有的OS198质粒文库中质粒为模板,用引物OSadhF1/R1和OSadhF2/R2扩增ALP基因片段的上下游的质粒,质粒454可以扩增到ALP基因片段的上下游,初步确认该质粒包含了ALP基因(图2-3A),用Sal I和EcoR I酶切质粒454和pHM1,获得约8.0kb片段连接pHM1,送测序(图2-3B)。将测序成功的pHMALP质粒转化相应的ALP基因缺失突变菌株和插入突变菌株,获得ALP基因回补菌株,提取ALP基因回补菌株中的质粒pHMALP,将其转化大肠杆菌DH5α后提取质粒进行酶切验证。用酶Sal I和EcoR I切pHMALP,切下条带包括8.0 kb载体带(图2-3C)。酶切结果表明ALP基因回补菌株构建成功。

  图2-3 ALP基因回补菌株的获得和验证

  Fig.2-3.The confirmation of complemented strains of ALP gene

  A.OSadh1F/R和OSadh2F/R扩增OS198质粒文库中ALP基因;1.上游同源臂F1;2.下游同源臂F2;B;1.pHM1经Sal I和EcoR I酶切;C.pHMALP Sal I和EcoR I酶切;M1.DL2000 Marker.M2.DL15000 Marker.

  A PCR amplification of upstream arm and downstream arm of ALP gene using the primer pairs OSadhF1/R1 and OSadhF2/R2,respectively;1.downstream arm F2;2.upstream arm F1;B.pHM1 digested by Sal I and EcoR I;C.Plasmid digested by Sal I and EcoR I

  SHAPE\*MERGEFORMAT3讨论

  本研究通过引入sacB负筛选标记构建ALP基因无痕敲除载体,转化OS198后就可以定向敲除目的基因。缺点是通过无痕敲除法构建的突变菌株因不含卡那霉素抗性,所以不方便筛选。而若通过Overlap-PCR法构建ALP基因敲除重组体转化OS198后,卡那霉素抗性基因可以替换目的基因,虽然可以方便筛选转化子,但是卡那霉素抗性基因插入到菌株基因组中后对下游基因的表达是否有极性影响不得而知,而采用无痕敲除法可以很好避免这个问题.所以本研究采用无痕敲除法构建的突变菌株。

  在构建OS198ΔALP的回补菌株时,可以采用两种方法将一个3798 bp的大片段克隆到载体上。解决的方法,一是可以用OSadhF1/OSadhR2引物PCR的扩增ALP基因,然后克隆到载体上;另一个途径是通过筛选OS198质粒文库,获得包含ALP基因的质粒。因为ALP基因片段较大,且该基因序列中GC%含量较高,PCR非特异性扩增可能性较大,故本研究采用了第二种策略,用Sal I、EcoR I酶切质粒和pHM1,回收ALP片段和载体带,再将回收的这两个片段连接起来,形成包含ALP基因的载体pHMALP。验证正确后转化OS198ΔALP,得到ALP基因回补菌株。由于细菌中存在多顺反子的现象,一个转录元下可能有多个基因,这种转座子插入阻断的突变不但影响了被阻断基因本身,还可能影响到了同一转录元中下游的基因甚至下游转录元中的基因,因此用突变体的遗传互补来验证其功能显得非常重要。本研究通过将该基因的全长序列克隆到具有广泛寄主pHM1质粒中,构建的功能互补菌株,其致病力与插入突变菌株#48-Tn5无差异。从而确证了该突变体致病力的缺失的确是由ALP基因引起,而非其它基因。

  本研究测定了OS198中ALP基因缺失突变菌株在水稻上的毒力。研究结果在下一章进行论述。

  第三章ALP负调控毒力机制初探研究

  摘要:为了研究ALP基因的功能,本研究将插入突变体菌株和敲除突变体菌株在寄主水稻和非寄主本氏烟上探究ALP基因的毒力作用机制。本实验测定了ALP基因缺失突变菌株的在NB培养基上的生长速率,在NB培养基中#48-Tn5和OS198ΔALP的生长速率高于野生型OS198;通过在26个苗期水稻品种的剪叶接种#48-Tn5,筛选到接种15后病斑长度有显著差异的两个水稻品种IR24和IRBB13,同时测定在其上的细菌生长量,并在这两个有差异的水稻品种上剪叶接种OS198ΔALP,也测定在其上的细菌生长量,研究结果表明在寄主水稻IR24和IRBB13上ALP基因增强了OS198在水稻上的致病力;通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ALP基因突变菌株中OsSWEET14基因的表达情况,发现ALP基因突变后OsSWEET14基因表达显著增加;通过在IR24水稻上注射接种PXO99A、野生型OS198和ALP基因突变菌株检测cAMP的浓度,发现野生型OS198三型分泌系统分泌和转运效应子功能运作正常;在非寄主植株本氏烟上发现ALP基因突变菌株引起胼胝质沉积较野生型OS198弱,说明在非寄主植株本氏烟上ALP基因突变体减弱了烟草对OS198的防卫反应。

  关键词:生长速率;OsSWEET14基因;胼胝质;cAMP浓度

  PHENOTYPE MEASUREMENT OF ALPMUTANTS

  ABSTRACT:In this study,the biological function of ALP gene was explored by comparing the ALP gene mutants with OS198 in the host rice plant and non-host Nicotiana benthamiana.The growth rates in media,compared with the wild-type,the results show the growth rate of#48-Tn5 mutant were significantly higher,as well as the growth rate of ALP-deleted mutant was increase,but lower than#48-Tn5 mutant;Moreover,the virulence of ALP mutants on IR24 and IRBB13 were decreased by leaf-clip inoculation,In other 24 rice varieties,there was no obvious difference in virulence of ALP mutants compared with the wild type,and the bacterial population of ALP mutants in the infection rice leaves was higher singnificantly than OS198 strain.The results suggest that ALP gene was involved in bacterial growth.Furthermore,ALP gene is required for the virulence of Xoo;Real-time Polymerase Chain Reaction(q RT-PCR)was taken to analysis the expression levels of OsSWEET14 in ALP mutants,the result shows the expression levels of ALP mutants were significantly increased compared with that in OS198;The detection of cAMP revealed that secretion and transport effector functions of the wild type OS198 secretory system function normally;The induction of callose deposits was reduced with ALP mutants treatment than OS198 in N.benthamian.

  KEY WORDS:growth rate;OsSWEET14 gene;callose response;cAMP

  水稻白叶枯病(bacterial blight,BB)是由革兰氏阴性黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的维管束病害(方中达等,1990),严重影响水稻产量的持续增长(陈功友等,2004)。植物病原细菌接种到非寄主植物烟草中常会诱导产生胼胝质反应,其主要特点是接种部位的植物细胞及其周围的细胞会迅速地死亡并形成坏死斑。水稻白叶枯病菌也能够诱导烟草过敏性坏死反应。为了探究ALP基因在功能,本实验测定了ALP基因缺失突变菌株的生长速率,在非寄主烟草上引起胼胝质能力和寄主水稻的毒力。通过测定ALP基因缺失突变菌株的表型,进一步研究ALP基因在水稻白叶枯病菌致病过程中的作用。

  1材料与方法

  1.1供试菌株

  水稻白叶枯菌株OS198、插入突变体#48-Tn5、敲除突变体OS198ΔALP。

  1.2植物材料

  本氏烟(Nicotiana benthamiana):盆栽于室内6~8叶期。

  水稻26个品种:盆栽于室内1个月后使用。26个用于毒力测试的水稻品种都含有至少一个已知的抗水稻白叶枯基因,这些品种分别来自菲律宾国际水稻研究所和中国水稻研究所。

  表3-1本研究中用于毒力测试的水稻品种

  Table3-1 Rice varieties or lines used for virulence analysis of Xoo in this study

  rice varietiesresistance generice varietiesresistance generice varietiesresistance geneIRBB 1Xa1IRBB 11Xa11IR24Xa18+xa19+xa20IRBB 2Xa2IRBB 13xa13IR26Xa4IRBB 3Xa3IRBB 14Xa14AsminoriXa17IRBB 4Xa4IRBB 21Xa21Java 14Xa1+Xa3+Xa12+xa13IRBB 5xa5IRBB 51Xa4+xa13TetepXa1+Xa2+Xa12IRBB 7Xa7IRBB 52Xa4+Xa21台中本地1号Xa14IRBB 8xa8IRBB 54xa5+Xa21DV85Xa7IRBB 10Xa10IRBB 55xa13+Xa21黄华占IRBB 210Xa10金刚301.3培养基、培养条件和抗生素

  同第二章

  1.4主要试剂

  (1)TRIzol:Invitrogen公司

  (2)氯仿

  (3)异丙醇

  (4)75%乙醇(DEPC水配制)

  (7)试剂盒:TaKaRa公司

  (8)腺苷酸环化酶酶活检测试剂盒:GenScript公司

  1.5 ALP突变菌株生长速率测定

  将待测菌株在NA平板上培养24~48 h,从平板上刮取菌体于装有灭菌水的EP管中,离心收集菌体,用灭菌水洗两次后重悬至OD600=1.0。取100µL加入20 mL NB培养基中,28℃,200 rpm培养,从培养后第10小时开始每隔2 h测OD600值。

  1.6水稻白叶枯病菌对水稻毒力的测定

  同第一章

  1.7水稻中细菌生长曲线的测定

  同第一章

  1.8胼胝质沉积测定

  注射接种12h的烟草,无菌水冲洗干净,浸入5~10 mL的脱色液中,真空抽滤30min(时间可以适当延长,保证脱色液完全浸入整张叶片),60℃水浴10~20 min(适当延长,直至叶片完全脱色)脱去叶绿色,用无菌水轻轻漂洗叶片,在3~4 mL的苯胺蓝染色液中黑暗染色过夜,然后用无菌水漂洗叶片,在荧光显微镜观察拍照,用Image J软件计算叶片胼胝质沉积数量。生物学重复3次,每次处理设置3个重复。

  Image J分析图片荧光强度

  Image J是一个Java的图片处理软件,它由Nation Institute of Health开发的。Image J具有显示,编辑,分析,处理,保存,打印8位,16位,32位的图片等多种功能,支持多种图片格式,广泛应用于图片处理中。Image J的功能可以总结以下4点:1.统计图像的区域和像素,包括大小,长度,角度,密度和数量;2.统计光密度和辉度,制作密度柱形图和线形图;3.计算两种蛋白质共定位的程度;4.卷积,Sholl分析,傅里叶分析。本研究运用Image J计算图片单位面积的荧光强度。

  具体步骤如下:

  Open该软件,选择需要统计的叶片。需要将图片格式转化为8-bit的灰度图片,然后再反转为灰度图片。File-open-Edit-invert;

  在Analysis工具栏中选择Calibrate,Function选择Uncalibrate OD、Global calibration,然后在Remove Scale。Set Measurements选项中选择要显示的结果,如Area、Integrated density和Limit to threshold;

  Image J中Adjust选择threshold。选择合适的参数,本研究中选择的参数原则为Auto去除个别区域的杂志;

  Analysis中选择measure计算叶片的荧光总强度和总面积,通过这两个参数计算出叶片的单位面积荧光总强度。本实验每个样品计算5张叶片,重复3次;

  1.9荧光定量PCR所使用的引物

  表3-1荧光定量PCR使用的引物序列

  Table 3-1.Primers used in qRT-PCR

  GeneSequence(Forward primer/Reverse primer,5’→3’)Product(bp)ActinTAACTGCGAGGTCAGGGTTT/AAAAAGACGGGAAAGGAGGT367OsSWEET14ATCAAGCCTTCAAGCAAAGC/CTAGGAGACCAAAGGCGAAG280

  1.10水稻叶片总RNA的提取

  按照第三章1.8所述方法注射接种水稻叶片。提取接种发病的水稻叶片的总RNA(TRIzol,Invitrogen公司)。操作过程如下:

  (1)先往灭过菌的研钵中倒入液氮,剪取100 mg接种发病部位的水稻叶片放入其中,一边研磨一边加液氮,将研磨好的植物组织迅速转移到DEPC处理的2 mL离心管中;

  (2)往其中加入1 mL TRIzol,涡旋仪充分振荡混匀,室温放置5 min;

  (3)4℃,12000 rpm离心10 min,将上清液转移到新的离心管中,尽量不要吸取沉淀;

  (4)加入200L氯仿,振荡混匀后室温放置5 min;

  (5)4℃,12000 rpm离心10 min,上层为含RNA的无色水相,下层为红酚-氯仿层;

  (6)将上层水相转移至新的DEPC处理的2 mL离心管中。加入与上清相等体积量的异丙醇,颠倒混匀后室温放置10 min;

  (7)4℃,12000 rpm离心10 min;

  (8)弃上清,加入1 mL用DEPC水配制的75%乙醇,轻轻振荡样品,4℃,8000 rpm离心5 min;

  (9)尽量吸干净残余的乙醇(乙醇影响后续反应),在冰上开口放置2 min,加入20 mL DEPC水溶解RNA,-80℃保存备用;

  1.11细菌总RNA的提取

  使用TRIzol(Invitrogen公司)提取细菌总RNA。本实验分三次培养细菌提取RNA。操作过程如下:

  (1)挑取-80℃保存的黄单胞菌活化于含相应抗生素的NA平板上,28℃培养2~3 d;挑取单菌落接种于NB液体培养液(含抗生素)中,在28℃摇床200 rpm振荡过夜培养;取菌液接入8 mL新的NB液体培养基中,200 rpm 28℃振荡培养至菌液OD600=0.7~1.0;将菌液分一半离心,用XOM2洗两次后于8 mL XOM2培养基200 rpm 28℃振荡培养12 h;另一半离心后则用NB洗两次后于8 mL NB培养基200 rpm 28℃振荡培养12 h;

  后续步骤按照第四章1.4所述水稻叶片总RNA的提取方法提取细菌总RNA(TRIzol,Invitrogen公司)。

  1.12反转录

  本方法使用5×All-In-One RT MasterMix反转录试剂盒(abm生物公司)

  RNA提取完成后取1μg经DNaseI处理,以去除DNA污染,去除步骤如下:

  RNA Up to2g

  AccuRT Reaction Mix(4×)2L

  Nuclease Free H2O补足至8L

  42℃反应2 min,加入2L AccuRT Reaction Stoper(5×)

  在冰上配制反转录反应液:

  5×All-In-One RT MasterMix 4L

  Nuclease Free H2O 6L

  总体积20L

  反转录条件:25℃10 min;42℃15 min;85℃5 min;

  反转录所得的cDNA后加入1L(2U)RNase H,37℃,20 min,以去除cDNA中残余的RNA,最后置于-20℃保存备用。

  1.13实时荧光定量检测OsSWEET基因的表达情况

  本研究使用EvaGreen 2×qPCR MasterMix试剂盒(abm生物公司),使用ABI PRISM 7500 Real-Time PCR System荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司,USA)测定目标基因的表达水平。供试菌株注射接种水稻IR24,提取接种菌株后水稻叶片的总RNA,DNaseI处理后反转录成cDNA,以水稻cDNA为模板,注射水的水稻叶片作为对照,Actin作为内参基因,使用特异性引物(表3-1所示)扩增OsSWEET14基因。每个处理设3个重复。实验重复三次。

  在冰上将下列组份配制成qRT-PCR反应液,并加至96孔板中:

  EvaGreen 2×Qpcr MasterMix 10L

  上游引物(10M)0.6L

  下游引物(10M)0.6L

  DNA模板≤500ng/reaction

  Nuclease-free H2O补足到20L

  总体积20L

  反应条件如下:

  Stage 1:95℃10 min;

  Stage 2:95℃15 s,60℃1 min,32个循环

  1.14 qRT-PCR的结果分析

  使用SDS软件分析目标基因的相对表达水平,该软件采用2−∆∆Ct相对定量比较方法(Livak and Keen,2001)。

  1.15腺苷酸环化酶酶活检测

  将待接种菌株在NA平板上培养24~48 h,刮取菌体,用灭菌水配制成OD600为0.5的菌液,用无针头注射器将菌液注入15 d苗龄的IR24水稻叶片正面,24后收集注射叶片置于液氮中研磨,使用cAMP含量检测试剂盒(GenScript公司)检测酶活值。实验设3次重复。

  1.16数据统计分析

  试验数据用SPSS(v19.0中文版)软件进行差异显著性分析。

  结果与分析

  2.1 ALP基因的突变增加OS198在NB培养基上的生长速率

  为了研究ALP基因对OS198生长速率的影响,本研究在NB培养基上测定了ALP基因突变菌株的生长速率,NB培养基是营养丰富的培养基,用于实验室培养细菌。野生型OS198、#48-Tn5和OS198ΔALP生长速率的起始值均为0.005,在接种NB培养基后10 h,每隔2h测一次OD600值。结果如图3-1所示,在12h时野生型OS198、#48-Tn5和OS198ΔALP的OD600值分别为0.18、0.2、0.18无差异;在14h时野生型OS198与#48-Tn5的OD600值分别为0.26、0.48、0.35开始出现差异,且差异越来越大;在22h时OS198、#48-Tn5、OS198ΔALP的OD600值分别为1.37、2.84、2.20出现显著性差异。说明与野生型OS198相比,无论是插入突变体还是敲除出突变体,生长速率在NB培养基中都显著增加。ALP突变菌株的A600值与野生型OS198的差异最大,达到达0.475~0.883。表明ALP基因对OS198的生长起重要的负调节作用。

  图3-1 ALP突变菌株在NB培养基上的生长速率测定

  Fig.3-1 Growth of wild-type and ALP mutants in NB media

  In nutrient-rich medium NB,Xoo strains were incubated at 28℃,200 rpm.Concentration(A600 nm)of OS198 and ALP mutants were measured every 2 h from 10th to 22th hour after inoculation.Similar results were obtained in three independent experiments.The results indicate that a significant difference of growth between the mutant and wild type strains were detected at p<0.01

  2.2 ALP基因突变体在不同水稻品种上的致病力测定

  在17个IRBB系列水稻品种、7个地方品种和2个IR系列的26个水稻品种上剪叶接种OS198、#48-Tn5筛选测试毒力。结果如图3-2,与野生型OS198相比,#48-Tn5菌株在水稻IRBB2、IRBB3、IRBB11、IRBB210叶片上的病斑长度增加了1~3cm,差异不显著(p≥0.01),表现为弱毒力;在水稻IR24上的病斑长度平均为12 cm,与野生型OS198相比增加了8.5 cm(p<0.01),表现为强致病性;在水稻IRBB13上病斑长度为11.4 cm,与野生型OS198相比增加8.1 cm(p<0.01),表现为强致病性。而在其余20个水稻品种上,病斑长度没有显著差异(p≥0.01)。

  选取#48-Tn5插入突变体在26个水稻品种病斑长度有差异的两个水稻品种IRBB13和IR24,剪叶接种敲除突变体OS198ΔALP。结果如图3-3AB(上图)所示,在水稻IRBB13上,接种OS198ΔALP的叶片病斑长度平均为8.7cm,与野生型OS198相比增加了5.7cm,有显著差异(p﹤0.01),而与#48-Tn5相比无显著差异;与野生型OS198,OS198ΔALP突变菌株在水稻IRBB13含菌量明显增加,具有显著性差异(p﹤0.01),结果如图3-3C(上图),与#48-Tn5相比无显著差异。

  结果如图3-3DE(下图),在水稻IR24上,接种OS198ΔALP的叶片病斑长度平均为7.1cm,与野生型OS198相比增加了4.2cm,有显著差异(p﹤0.01),与#48-Tn5相比无减弱了5 cm;结果如图3-3F(下图),与野生型OS198,OS198ΔALP突变菌株在水稻IRBB13含菌量明显增加,具有显著性差异(p﹤0.01),与#48-Tn5相比存在差异。

  图3-2#48-Tn5插入突变突变菌株在26个苗期水稻上的毒力测定

  Fig.3-2.Virulence assay of#48-Tn5 insetion mutant strain on 26 seedling rices

  Measurements of lesion lengths on 26 rice varieties leaves 15 d after leaf-clipping inoculation with OS198 and#48-Tn5 Measurements of lesion lengths each were obtained from 30 leaves of 15 plants(two leaves per plant).Virulence assays were carried out on 5-to 6-week old rice leaves.The experiments were repeated at least three times with similar results.The asterisk indicates a significant difference in t-test at p<0.01.Error bars represent±SD.

  图3-3 ALP突变菌株在IRBB13(上图)和IR24(下图)水稻上的毒力测定

  Fig.3-3.Virulence assay of ALP mutant strains on IR24 and IRBB13

  A.D.剪叶接种在IRBB13和IR24上形成的病斑;B.E.接种叶片的病斑长度测定;C.F.接种叶片中细菌菌含量的测定.*表示在p<0.01水平上差异显著。

  A.D.Symptoms on leaves 15d after leaf-clipping inoculation with OS198,OS198ΔALP and#48-Tn5.The photo was taken 15 dpi;B.E.Measurements of lesion lengths each were obtained from 30 leaves of 15 plants(two leaves per plant);C.F Bacterial populations were obtained from a pool of three leaves and manifested as cfu per leaf.Virulence assays were carried out on 5-to 6-week old IR24 and IRBB13 leaves.Measurements of lesion lengths and bacterial populations were performed 15 dpi.The experiments were repeated at least three times with similar results.The asterisk indicates a significant difference in t-test at p<0.01.Error bars represent±SD.

  2.3 OS198菌株泌出三型效应因子的功能

  为了检测OS198菌株泌出三型效应因子的功能,按文献(Casper-Lindley et al.,2002)的方法制备样品,使用Amersham的cAMP Biotrak En-zymeimmunoassay(EIA)System进行检测。检测的酶活值见表3-2。从表3-2中数据结果可以发现,野生型菌株的OS198/pthXo1::cya的cAMP浓度与两种突变体菌株#48-Tn5/pthXo1::cya、OS198∆ALP/pthXo1::cya的cAMP浓度相比没有显著差异,两种突变体#48-Tn5/pthXo1::cya、OS198∆ALP/pthXo1::cya的cAMP浓度相比没有明显差异,菌株PXO99A/pthXo1::cya的cAMP的浓度是OS198及突变体的3倍左右。因此结果可以判断OS198/pthXo1::cya融合蛋白可以被泌出到植物细胞内。此实验结果表明,与PXO99A相比,OS198菌株的三型分泌系统可以泌出效应因子,但三型效应因子泌出能力为PXO99A的三分之一。

  表3-2供试菌株接种IR24水稻24h后cAMP的水平

  Table 3-2.Level of cAMP in IR24 leaves 24h after infiltration with the wild-type or the ALP mutants transformed with a plasmid harboring the pthXo1 fused with cya

  菌株

  (strains)

  植物中cAMP的浓度(nmol/mg total proteins)

  cAMP concentration in planta(nmol/mg total proteins)PXO99A/pthXo1::cya101510.53±27bOS198/pthXo1::cya3383.84±9a#48-Tn5/pthXo1::cya3187.88±11aOS198∆ALP/pthXo1::cya3181.18±11a接种PXO99A/pthXo1::cya的叶片作为阳性对照,小写字母a、b、c表示该实验数据在p<0.05水平上差异显著性水平。本实验结果独立重复两次。

  leaves infiltrated with PXO99A/pthXo1::cya were used as positive control.The same uppercase letters indicate that there was no significant difference in values at p<0.05.Similar results were obtained in two independent experiments.

  2.4 ALP缺失增加了OS198对水稻感病基因OsSWEET14的诱导表达

  TALE蛋白PthXo3是PXO61中的重要毒力因子,在亲和性互作中,pthXo3特异性的诱导水稻感病基因OsSWEET14的表达,植物表现感病。前期实验室的研究显示在OS198中,存在有PthXo3,为了验证ALP突变菌株在IR24上的毒力增加是否与OsSWEET14的表达变化有关,本研究利用qRT-PCR检测了接种36h后水稻中OsSWEET14基因的表达情况。接种OS198后水稻叶片中OsSWEET14基因与内参基因的比值2−∆∆Ct值设为1;接种ALP突变菌株后水稻叶片中OsSWEET14基因与内参基因的比值2−∆∆Ct值见图3-4,接种OS198ΔALP、#48-Tn5的水稻叶片中OsSWEET14的表达量分别是接种的25倍和52倍。结果表明,ALP缺失显著增加了OS198对OsSWEET14的诱导表达(图3-4)。

  图3-4水稻感病基因OsSWEET14的qRT-PCR检测

  Fig.3-4.Detection of OsSWEET14 expression levels in IR24 leaves by qRT-PCR

  用ddH2O(Mock)和Xoo菌株接种IR24,接种发病36 h后提取水稻叶片RNA,反转录成cDNA后利用荧光定量PCR检测OsSWEET14基因的转录水平。以Actin作为内参基因,实验重复三次。*表示基因表达量在P<0.01水平上差异极显著。

  Leaves of IR24 were infiltrated with steril water(Mock),OS198(wild-type),OS198ΔALP,#48-Tn5.OsSWEET14 transcript abundances were determined 36 h after inoculation.cDNA synthesis was performed using the oligo(dT)18 primer.cDNA amounts were normalized using the Actin gene as reference gene.The average value of three technical qRT-PCR replicates was analyzed.The same experiment was repeated three times.The OsSWEET14 gene expression levels inoculated with ALP mutants were calculated in comparison to that with OS198.The asterisk indicates that a significant difference was detected at p<0.01.Error bars represent±SD.

  2.5 ALP基因的突变减弱OS198在烟草上胼胝质的沉积

  在烟草叶片上注射接种OS198、OS198ΔALP、#48-Tn5、灭菌水,12h后检测胼胝质沉积。结果如图3-5所示,注射接种了OS198的部位检测到大量胼胝质的沉积(荧光点部分,图3-5A所示);注射接种#48-Tn5和OS198ΔALP的部位都检测到有胼胝质的沉积(荧光点部分,图3-5BC所示),但是胼胝质沉积数量要远远小于接种OS198的部位(图3-5A所示)。这结果表明ALP基因突变菌株减弱了OS198在非寄主本氏烟的胼胝质沉积。

  图3-5在烟草上的胼胝质沉积

  Fig.3-5.Callose deposition in tobacco cells

  A.OS198;B.#48-Tn5 C.OS198∆ALP;D.ddH2O作为CK;E.Image J分析烟草叶片单位面积胼胝质沉积数目.*表示在p<0.01上有显著性差异

  A.OS198;B.#48-Tn5 C.OS198∆ALP;D.ddH2O E.Data were counted using Image J software.The asterisk(*)indicates that a significant difference was detected at p<0.01.

  3讨论

  本研究前期在将突变体文库中编号1~400的插入突变体在IR24筛选0S198毒力发生增加的突变体#48-Tn5,并通过hi-TAILPCR侧翼序列分离得Tn转座子插入在OS198上与粘附相关的基因ALP,使ALP基因发生突变,细菌粘附在寄主植物是细菌进入寄主植物的第一步,在细菌与寄主植物互作发生抗或感病反应中起着重要作用,那么该突变体#48-Tn在其他水稻是否发生改变?通过在17个IRBB系列水稻品种、7个地方品种上和2个IR系列的水稻品种上筛选测试#48-Tn5菌株的毒力,结果发现#48-Tn5只有在IR24和IRBB13上的毒力显著增加,而在其他品种上毒力没有增加。所以将敲除突变体OS198ΔALP剪叶接种到筛选到的水稻IR24和IRBB13,发现OS198ΔALP在IR24和IRBB13上的毒力也显著增加,但是两种突变菌株在IR24和IRBB13的毒力有差异。由于IRBB13含有抗白叶枯基因Xa13,因此是否存在这种可能,即OS198中存在与Xa13基因特异性互作的某种因子,在ALP基因突变后直接或者间接诱导了Xa13基因的表达,导致病原菌在IRBB13上的毒力显著增加,这有待进一步证实。研究中ALP基因突变后导致OS198激发烟草胼胝质反应的能力显著下降,也影响病原菌在NB培养基上的生长速率,ALP突变菌株在NB培养基上的生长速率相比野生型明显增加,ALP基因可能与病原菌生长有关,暗示其可能调控某些与病原菌生长相关基因的表达。Amit等报道黄单胞菌BXO43编码粘附相关蛋白的基因XadB(Xanthomonas adhesin-like protein B)突变后毒力减弱(Amit Das et al.2008),而本研究发现OS198中ALP(adhesin-like protein)基因突变后只在水稻IR24和IRBB13的毒力增强,表明不同的遗传背景下ALP基因的功能不同。

  植物病原细菌主要通过III型分泌系统(T3SS)向寄主细胞分泌各种效应因子,III型效应因子在寄主细胞内被各种特定的蛋白(R蛋白)识别破坏细胞正常的生命活动或干扰植物抗病信号途径以利于病原菌的生长繁殖,因此T3SS分泌的效应因子与病原菌的致病性密切相关。本实验从分泌和转录水平两方面说明了OS198菌株中与野生型PXO99A菌株毒性间的差异可能与三型效应因子表达量的差异有关,进而可能影响PthXo3在内等效应因子与寄主植物间的互作。

  在效应因子的分泌水平,通过cAMP的检测,结果表明OS198的三型分泌系统是正常的,并不影响三型效应因子的泌出,但泌出蛋白的能力与PXO99A相比有所下降,因此推测OS198菌株的弱毒力可能受T3SS泌出效应因子能力降低的影响,但是否由于OS198菌株T3SS泌出能力下降导致PthXo3在内的每一个效应蛋白的泌出均受到影响,还有待进一步证实。

  鉴于ALP缺失能够增加对水稻感病基因OsSWEET14的诱导表达,而PthXo3又与OsSWEET14特异性互作,表明ALP基因通过调控PthXo3与OsSWEET14的互作来影响病原菌在寄主上的毒力。

  全文总结

  研究采用EZ-Tn5TM Tnp Transposome转座子插入的方法构建水稻白叶枯病菌OS198的插入突变菌株库。通过对突变体库中400个突变体在苗期水稻IR24剪叶接种筛选,得到毒力发上变化的突变体#48-Tn5。

  Southern杂交和hi-TAILPCR两种方法测序结果都表明:转座子Tn5插入在OS198菌三型泌系统的膜蛋白adhesin-like protein(ALP),使ALP基因发生突变。

  采用PCR和引入sacB负筛选标记的方法分别构建了ALP基因敲除载体,采用两亲结合的方法,将重组体导入到野生型OS198中,获得了ALP基因缺失突变菌株OS198ΔALP,对ALP基因缺失突变菌株进行功能互补。将已构建好的含ALP编码基因的质粒pHMALP通过电转化的方法转入相应的ALP基因缺失突变菌株OS198ΔALP和#48-Tn5中,获得ALP基因缺失突变菌株功能互补菌株。

  通过测定ALP基因缺失突变菌株和插入突变菌株#48-Tn5在NB的生长速率,发现与野生型OS198相比,两种突变菌株在NB培养基上的生长速率显著增加,两种突变菌株在NB培养基上生长速率有差异,但是差异不显著,表明ALP基因与病原菌的生长有关。

  在烟草上,ALP基因突变菌株减弱了OS198在烟草上胼胝质沉积。

  ALP基因缺失突变体通过增强细菌的繁殖提高了OS198在在IR24和IRBB13上的致病力作用。

  采用实时荧光定量PCR的方法检测了OS198和ALP突变菌株中qRT-PCR实验发现ALP基因缺失显著增加了OS198对水稻感病基因OsSWEET14的诱导表达。

  鉴于ALP缺失能够增加对水稻感病基因OsSWEET14的诱导表达,而PthXo3又与OsSWEET14特异性互作,表明ALP基因通过调控PthXo3与OsSWEET14的互作来影响病原菌在寄主上的毒力。

  cya活性检测发现OS198的三型分泌系统是正常的,并不影响三型效应因子的泌出,但泌出蛋白的能力低于PXO99A,因此推测OS198菌株的弱毒力可能受T3SS泌出效应因子能力降低的影响,

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