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最新植物学类论文 蜘蛛香植物组织培养技术研究

2018-12-16 19:09:21来源:组稿人论文网作者:婷婷

  【摘要】:蜘蛛香,是一种传统的中药材,以根状茎及根入药。在中药材资源短缺问题越来越严重的今天,利用药用植物组织培养技术,可以培育中药材新品种,保护珍稀濒危种质资源,开发新药和活性问题。本文对蜘蛛香外植体叶片(叶柄或侧芽),通过对外植体不同消毒处理时间和方法,以及不同激素浓度配比等方面研究蜘蛛香外植体的诱导愈伤及增殖。结果表明,培养温度在20~30℃时,外植体以75%酒精消毒处理30s,0.1%HgCl2消毒处理15min,消毒处理后污染率最低,污染率为40%,蜘蛛香外植体愈伤组织的诱导最佳配方为MS+2,4-D 3mg·L-1+6-BA 0.3mg·L-1,诱导率为89%。

  【关键词】:蜘蛛香;外植体

  引言

  蜘蛛香(Valeriana jatamansi Jones.),为败酱科缬草属植物,蜘蛛草的干燥根茎和根,别名马蹄香、心叶缬草、老虎七等多年生草本植物,高30-70cm。茎通常数枝丛生,密被短柔毛。根状茎横走,肥厚,块状,粗大,节间紧密,有叶柄残基,黄褐色,有特异香气。通常生长在河谷阴湿林下,林缘开阔地,河滩,林中,路边草丛里,山顶草甸,山坡潮湿地。分布的主要地区在陕西省,甘肃省,湖北省,河南省,湖南省,重庆市,四川省,云南省,广西自治区,西藏自治区。李时珍在《本草纲目》中评价蜘蛛香“《时珍》曰∶蜘蛛香出蜀西茂州松潘山中,草根也。黑色有粗须,状如蜘蛛 及本藁、芎穷 ,气味芳香,彼人亦重之。或云猫喜食之”蜘蛛香勘称“苗药经典”。

  其中主要含有挥发油、环烯醚萜类、黄酮类、生物碱、氨基酸和木脂素及其他一些化学成分, 药理活性包括镇静、催眠、抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗肿瘤细胞毒和对循环系统的作用。 挥发油, 缬草素类成分 ,β -谷甾醇及总酸是其活性成分含量。在《本草纲目》中清晰的记载了蜘蛛香能够辟瘟疫、镇静,治气服、除湿散寒、脾胃食滞、外敷疮疖,活血、调经,治头痛、关节痛、跌打损伤,治消化不良、小儿咳嗽、流感、疳积、疟疾等等常见疾病都有很好的效果。

  如今,蜘蛛香的研究已引起相关行业重视,主要集中在蜘蛛香药用化学、药理作用、挥发成分、药材质量标准和药材质量分析等方面,但对蜘蛛香的植物组织培养方面没有人做过相关的研究,蜘蛛香因用处较广,使用量较大,野生资源越来越贫乏。本文通过对蜘蛛香外植体愈伤的诱导及增殖等系列问题的探讨,建立了蜘蛛香植物组织培养体系,为蜘蛛香工厂化生产提供理论依据和技术指导,对野生蜘蛛香的种质资源保护也具有意义。所以我的实验为以后蜘蛛香的组培做出一些贡献。

  1实验材料与方法

  1.1实验材料

  1.1.1材料来源

  实验所用材料来源于江苏农牧科技职业学院园林园艺系温室种植的蜘蛛香。

  1.1.2 外植体的选择

  外植体有两种:叶片和叶柄,选择蜘蛛香一年生的的叶片和叶柄,且无病虫害的。

  1.1.3外植体制备

  首先外植体采回来洗干净后,放置于自来水下冲洗1小时以上,然后于无菌室超净工作台上用75%的酒精充分浸没外植体处理30s,之后用无菌水冲洗4次,再用0.1%的氯化汞溶液充分浸泡12~16min,最后用无菌水反复冲洗5~6次,并反复震荡以彻底将升汞清除掉,再用无菌滤纸吸干多余的水分后,备用。

  1.1.4培养条件

  培养基均为MS基本培养基,琼脂浓度均为7g/L,蔗糖浓度均为30g/L。PH均为5.8,配制好的培养基经121℃,15min的高温高压灭菌后使用。培养室温度20~30℃,光照强度2000~2500LX,光照时间12h/d。

  1.2实验方法

  1.2.1不同消毒时间处理蜘蛛香组培外植体

  选备用外植体,用75%酒精分别处理20、30、40S,并用0.1%的氯化汞溶液分别浸泡10、12、14、16、18min,接种于相同的培养基中。定期观察统计污染率(表1)

  1.2.2愈伤组织诱导培养基筛选

  将蜘蛛香外植体叶片和叶柄分别接种在MS+6-BA 0~0.5mg·L-1 +2,4-D 3~5mg·L-1+蔗糖3%+琼脂0.7%固体培养基上,pH 值为5.6~5.8,30d后观察并统计叶片与叶柄诱导愈伤情况,从中选出蜘蛛香诱导愈伤的最适培养基。(表2)

  1.2.3愈伤组织分化培养基筛选

  将蜘蛛香叶片和叶柄诱导出的愈伤分别接到MS+6-BA 1~2mg·L-1 +NAA 0.1~1mg·L-1+蔗糖3%+琼脂0.7%固体培养基上,pH 值为5.6~5.8,30d后观察并统愈伤分化情况,从中选出蜘蛛香诱导愈伤分化的最适培养基。(表3)

  2结果分析

  2.1.不同消毒时间处理蜘蛛香组培外植体

  表1不同消毒时间处理蜘蛛香外植体,培养基污染率统计序号试剂处理时间污染率统计%酒精(S)氯化汞溶液(分钟)7天14天20天12010100--23010100--34010100--4201290100-530125050100640125060887201480100-8301448406094014444158102016303240113016302930124016303050132018374010014301835301001540184050100

  可以看出,随着氯化汞消毒时间的延长,外植体的污染呈明显的下降趋势。其中,氯化汞消毒10min,污染率100%;16min污染率达到了最小值30%。当时间延长到18min时,外植体污染率又明显增加到100%。这可能与消毒时间延长后对外植体造成的伤害有关。酒精处理时间亦随着时间延长污染率逐渐降低,所以,蜘蛛香外植体在酒精消毒30S,氯化汞消毒16min,20天后的污染率为30%。(表1)

  2.2愈伤组织诱导培养基筛选

  表2不同激素浓度配比对外植体愈伤组织诱导的影响2,4-D(mg·L-1)6-BA(mg·L-1)接种数(瓶)愈伤诱导时间(d)愈伤诱导率(%)诱导情况20.21013 ~ 33

  40生根,细长0.31012 ~ 34

  59生根0.41010 ~ 30

  79愈伤少,生根30.21012 ~ 30

  90有愈伤,少0.31010 ~ 30

  98有愈伤,较多0.41010 ~ 32

  96有愈伤,多40.21011 ~ 30

  89有愈伤,少0.31013 ~ 33

  79有愈伤,少有生根0.41014 ~ 32

  73有愈伤,生根0010-0无

  可以看出,在不同激素配比的培养基下,外植体愈伤组织诱导率差异显著。2,4-D浓度相同时,6-BA浓度越大,愈伤组织诱导率越高;其中以2,4-D 3mg·L-1和6-BA 0.3mg·L-1处理,外植体诱导率最高,诱导情况最好。(表2)

  2.3愈伤组织分化培养基筛选

  表3不同激素浓度配比对愈伤组织不定芽分化的影响6-BA(mg·L-1)NAA(mg·L-1)接种数(瓶)分化时间(d)分化率(%)分化情况10.21010 ~ 2992有不定芽,较多1.50.21013 ~ 3086有不定芽20.21013 ~ 3379不定芽,较少10.51012 ~ 3283有不定芽1.50.51014 ~ 2970不定芽,较少20.51013 ~ 3264极少

  不同激素、不同浓度的配比培养基,愈伤组织不定芽诱导分化有显著差异。其中1mg/L的6-BA和0.2mg/L的NAA组合培养基,不定芽诱导率最高,分化情况最好,2mg/L的6-BA和0.5mg/L的NAA组合培养基,不定芽诱导率最低,分化情况最差。

  3结论

  蜘蛛香的叶片和叶柄上都生长有短柔毛,对外植体的消毒有一定的影响,所以在外植体制备时要用刷子把外植体上的短柔毛轻轻的刷掉,这样可以减少培养基的污染率。综上所述,以蜘蛛香叶片为外植体材料,用30S酒精和0.1%氯化汞处理16min,接种后污染率最小。在实际操作中,消毒时间可根据外植体的幼嫩程度而作适当的增减。

  在外植体愈伤组织诱导过程中,用添加2,4-D 3mg·L-1和6-BA 0.3mg·L-1的MS培养基诱导率最高98%。用添加6-BA 1mg/L和NAA 0.2mg/L的培养基,不定芽诱导率最高92%。

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