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植物多样性论文 垂直流人工湿地植物多样性对细菌群落结构的影响

2018-12-12 15:26:05来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要:为了研究植物多样性对人工湿地中细菌群落结构的影响规律,本实验在垂直流人工湿地中设置了3个植物多样性处理梯度(空白组处理、栽培1种和4种植物处理),分别对不同处理下的植物生物量和细菌群落结构进行了分析。实验结果表明:植物多样性对植物生物量有促进的关系,但地上植物生物量提高的幅度较小。植物多样性对细菌群落结构参数如有效片段数、优势片段数和多样性指数有影响 。

  关键词:人工湿地;植物多样性;植物生物量;细菌群落组成。

  引言

  水污染的现状及治理

  水是一种自然资源,也是影响社会可持续发展的重要资源,水体一旦受到污染,对人类的生产生活会产生极大的影响。然而,近年来,我国因水污染造成的事故屡见不鲜,如1992年2月淮南市田家庵发电厂,因使用煤矿废水污染了的淮河水,迫使三台机组停机。1985年-1989年浙江省因农药污染中毒死亡的总人数10126人、伤59110人,伤亡人数为该省交通事故伤亡人数的10倍。更为轰动的是2005年的松花江污染事件,使得其流域的水资源利用受到严重的威胁。我国水污染现状是:污染面积大、污染源多、影响大、持续时间长等。虽然近年党和政府开始重视水污染问题的治理,社会也增加了对水污染问题的关注度,但水污染治理的形势依然严峻,容不得懈怠。

  常见的污水处理方法有:物理法、物理化学法、生物法、化学法四个方面的方法。当前的水污染形式如此严峻,传统的废水处理技术难以满足越来越严格的污水排放标准的要求,也推动着污水处理技术不断地发展。与生物法相关的自然处理技术在我国污水处理方面有较广泛的运用,即利用土壤或天然水体的自净作用对污水进行处理,该技术主要包括土地处理系统、人工湿地、生物稳定塘等污水处理工艺技术,其中人工湿地污水处理技术具有较广泛的应用前景。

  人工湿地的概念

  人工湿地(Constructed wetland, CW)是一种由人工建造和监督控制的,与天然湿地类似的生态系统,它充分利用了基质—微生物—植物这个复合生态系统的物理、化学和生物的三重协同作用,通过过滤、吸附、沉淀、离子交换、植物吸收和微生物分解等作用来实现对污水的高效净化。人工湿地由基质、植物和微生物等部分组成。人工湿地不仅能去除水体中的悬浮物、有机污染物、各种氮磷等,而且能够有效地去除重金属、病原微生物和藻毒素等外源生物活性物质。按照废水在湿地中的流程,人工湿地系统主要分为自由表面流人工湿地(Surface Flow Wetland, SFW)、水平潜流人工湿地(Horizontal Sub-surface Flow Wetland, HSFW)、垂直流人工湿地(Vertical Sub-surface Flow Wetland, VSFW)等类型。其中垂直流湿地由于排水及间歇阶段大气复氧作用明显,湿地内部溶氧浓度较高,硝化作用较其他两种类型湿地彻底,因而垂直流人工湿地对氨氮的去除率相对较高。

  垂直流人工湿地的优势

  垂直流湿地系统的优势:一方面垂直流人工湿地以其独特的水流方式和间歇进水的运行方式使系统充氧更充分,在去除氨氮和总氮方面有显著的优势;另一方面垂直流人工湿地采用厌氧、好氧的复合水处理结构,避免了传统污水处理工程的不足,加强了硝化、反硝化作用,且与景观建设相结合,具有美化净化环境的效果,非常适合用于湖泊水体修复。

  垂直流湿地比水平流湿地的除磷效果更佳,这是由于湿地除磷主要依靠的是基质的物理化学作用,故与流体的流态密切关联。垂直流人工湿地比水平流湿地湍动更剧烈、水流更曲折,污水在流动中与基质和植物根系接触更充分,基质的过滤条件和吸附也更好。

  通过水平流和垂直流湿地的详细比较试验证明,由于构型的不同引起处理过程中的水流流态和水流路径的不同,相对于水平流湿地,垂直流湿地运行中,污水与植物、基质接触和表面复氧等方面具有更大的优势,因而 COD,TN,TP 平均去除率分别平均高出 15%,10%,8%左右;其在各种停留时间下去除率均高于水平流湿地,特别是在较短停留时间时的优势更为明显,是一种值得推广的湿地构型。

  垂直流人工湿地的研究现状

  垂直流人工湿地的设计使得湿地内部水分布更均匀、氧气量更充分,对有机物和氮都有更好的净化效果,因此近几年来对它的研究和应用得越来越多。到目前为止对垂直流人工湿地的研究主要涉及以下几个方面:①垂直流人工湿地净化污水的机理;②垂直流人工湿地的堵塞机理;③水力因素和基质选择对垂直流人工湿地污水净化的影响;④垂直流湿地中不同微生物对污水净化的研究等。

  植物多样性相关研究现状

  人工湿地由基质、植物和微生物等部分组成。基质、植物和微生物是影响湿地发挥污水净化功能的三个主要因素。其中植物是人工湿地的重要组成要素,在水质净化过程中发挥着重要的作用,植物的净化功能与其生长状况及植物间的合理搭配有着密切的关系,湿地植物

  长越良好、搭配越合理,对水质的净化功能越强。

  国内外对人工湿地植物的研究主要集中在植物对营养性污染物、有机物、重金属和有毒有害物质的去除,以及不同植物的组合对污染物的去除效果。从目前已有的人工湿地工程实践来看,人工湿地中应用的植物种类主要为单一结构的水生草本植物,近年也有研究者提出可以应用一些湿生草本、湿生乔木到人工湿地中,以增加生物多样性。

  但是,实际运行中的垂直流人工湿地中植物多样性对细菌群落结构的影响目前还无人研究。

  基于此,2004年3月,我们在台州学院椒江校区设计和建造了30个垂直流人工湿地系统,采用随机组设计的方法分别设置了3个植物多样性梯度(0、1和4种植物处理)。考虑到如果用废水灌溉人工湿地,植物多样性可能会受废水中的有机污染物的干扰,因此我们选择用人工配制的废水灌溉湿地。取样后,通过末端限制性长度多态(T-RFLP)分子技术,对选取的土壤样品进行分析。我们的实验目的是通过实验来研究:在人工湿地中,不同植物多样性对细菌群落结构的影响变化规律。

  材料与方法

  微宇宙设计以及种植方式

  2013年3月,我们在台州学院椒江校区(东经121º42' 北纬28º66')建造了垂直流人工湿地系统。该地区的气候属亚热带季风气候,热量丰富,四季分明,雨水充沛,年降水量为1185~2029mm,年平均气温为16.6 o C ~17.5 o C。

  湿地类型为垂直流湿地系统 ( IVFCW,下行池),实际运行的地下垂直流人工湿地(长度= 45厘米,宽度= 45厘米,深度= 1.2米)包含了一个三层过滤系统:每个处理池最底层铺上30 cm厚的砾石(粒径=50-120mm),中间层铺20 cm厚的粗砂(粒径=6 -12mm),起到过渡作用,防止最上层的细砂在灌溉废水时流失,最上层铺60 cm厚的细砂(粒径 = 1-2mm)(图1)。

  图1 垂直流人工湿地结构

  Fig.1 Scheme of the vertical flow constructed wetland

  本实验所选取的水生植物均为湿地多年生植物,植物均从杭州天景植物园购得,选取的四种植物分别为:水葱(Scirpus validus)、伞草(Cyperus involucratus)、黄菖蒲(Iris pseudacorus)、美人蕉(Canna indica)。对这些植物的植物学特性进行分析,发现它们具有以下几个方面的共同特点:①生长周期长;②生物量大,生长迅速;③抗逆性强、净化能力强等。用这4种植物进行植物多样性设计,即仅栽培1种植物、栽培4种植物、不栽培任何植物这3种处理,每种处理重复5次,共计30个湿地单元。

  废水灌溉以及抽样方法

  在试验过程中,根据垂直流人工湿地系统设计的特点,我们采用的是一种脉冲式灌溉的方法。也就是说,向每个微宇宙系统中注入废水,使水位高于砂石表面5cm。与此同时,因为实验过程中水分不断地蒸发,为了保持水位的不变,每天都要对每个微宇宙系统灌溉自来水。一旦灌溉结束,废水在每个微宇宙中停留10天,然后排放掉,使微宇宙排空0.5天以便填料自然充氧,接着再继续灌溉废水。这种灌溉模式一直重复到实验结束,以如此的方法运行人工湿地三个月。

  配制废水的总体积为1000升,其中配制992.5升的大量元素溶液,接着分别加入2.5升铁盐溶液(配制方法:先将乙二胺四乙酸二钠(EDTA.Na) 7.46g放在1000ml的蒸馏水中, 加热溶解,并加入5.56g七水硫酸亚铁,继续加热,直到溶解为止,调节pH至5.5)和5升微量元素溶液(铁盐溶液和微量元素液的添加比例分别为:2.5ml/L,5ml/L),最后调配废水的pH至6.0左右。大量元素和微量元素的配制用量见表1、表2,实际应用时将上述用量相应减半后使用。

  表1大量元素配制用量

  Table 1 Major element preparation dosage

  试 剂1升用量(mg)1000升用量(g)可溶性淀粉6767葡萄糖5050蛋白胨3333牛肉膏1717KNO3101.1101.1Ca(NO3)2·4H2O236.16236.16CaCl2·2H2O147.03147.03(NH4)2SO4115115KH2PO4136136MgSO4·7H2O246.49246.49KCl74.5574.55

  表2 微量元素溶液配制用量

  Table 2 Trace element preparation dosage

  试 剂1升需要量

  (mg)1000升用量

  (g)H3BO35.0055.005MnCl2·4H2O6.3356.335ZnSO4·7H2O0.770.77CuSO4·5H2O0.280.28H2MoO4·4H2O0.3150.315湿地运行1年后,2014年7月份采用破坏性取样的方法收集植物样品,植物地上与地下部分分开取样。用剪刀齐地收割植物地上部分样品,再收取植物的地下部分即植物的根,洗净根上附着的砂土,阴凉处晾干。

  植物收割后,首先清除湿地填料表面的枯枝落叶,用铲子收集每个湿地处理样地的沙子样品,样本过2mm筛以保持所有样品颗粒大小的一致性。收集结束,立即将收集的新鲜基质样本装入牛皮袋中并编号,分成两部分:一部分保存在4 o C的存储柜中,以便进行微生物参数分析;另一部分放在 –20 o C的冰柜中,用于沙子样品其余指标的分析,同时取少量沙子测定含水量。

  植物生物量分析

  将称量好的植物地上部分及地下部分带回实验室,并记录其鲜重,将其用牛皮纸或报纸包扎好,放在烘箱中以65 o C的温度烘干,24小时后取出称量其干重,转换成干重%,就可分别计算出植物地上与地下部分的干重。如果出现植物样品太大的情况(如美人蕉的枝叶)不方便放入烘箱烘干的话,可以先称量其总鲜重,然后称取部分植物的鲜重,再将该部分植物样品放入烘箱以65 o C温度烘干,24小时后取出称其干重,计算出干重率,最后将总鲜重乘以计算得出的干重率从而得出总的植物生物量,单位是以每平方米多少克。

  微生物参数分析

  土壤微生物DNA提取

  使用试剂盒(Fast DNA SPIN Kit for Soil)提取土壤样品中的微生物DNA,具体操作过程如下:Lysing Matrix E管中放入乘凉好的500mg的土壤样品(因为FastPrep®仪器震动剧烈,在Lysing Matrix E管内会形成很大的压力,所以样品和基质的总体积不能超过管体积的7/8,还要留出一些空间来使其混合得更均匀),先加入978 μl sodium phosphate buffer到Lysing Matrix E管中,再加入122 μl MT buffer。将上述样品在FastPrep®中(6.0m/s,震荡40秒)混匀,混匀后放入离心机中,14000 g ×10 min离心,离心后将上清液转移到一个新的2 ml离心管中,再加入250 μl PPS(沉淀蛋白),并手摇10次进行混合。

  离心14000 g × 5 min,将上清液转移到一个新的2 ml离心管中。重悬Binding Matrix Suspension,吸取1.0 ml 到上述离心管中。将离心管放到旋转器上颠倒2分钟,再放到架子上静置3分钟。吸取并弃除500 μl上清液,避免吸到下层的Binding Matrix,重悬余下的Binding Matrix,移取大约600 μl混合液到SPINTM Filter管中,14000 g × 1 min离心,将管下面的液体倒掉,再将剩余的混合液转移到SPINTM Filter管中,14000 g × 1 min离心,倒掉管中的液体。加入500 μl SEWS-M到SPINTM Filter中,轻轻用枪头悬浮,在使用SEWS-M之前要在12 ml的溶液中加入100 ml 100%的乙醇。14000 g × 1 min离心,将SPINTM Filter下面管中的液体轻轻地倒掉。不加入任何液体,再14000 g × 2 min离心,除去残留液体,弃去下面的管子,将SPINTM Filter置于新的离心管中。

  在室温下风干SPINTM Filter 5分钟。取50 -100 μl DES到SPINTM Filter管中,用枪头轻轻悬浮Binding Matrix。(注:为避免DNA过度稀释,可通过加入更少量的DES来重悬Binding Matrix的方法来解决;溶解在55 o C水浴锅中加热5 min效果更快)。14000 g × 1 min离心,将DNA转移至一新的管中,弃去SPINTM Filter管,将DNA放在-20 oC下储存备用。

  PCR扩增

  用荧光标记的引物对微生物DNA中的细菌DNA进行PCR扩增,即用引物F968(序列:5'-AAC gCg AAg AAC CTT AC-3')和R1401-1a(序列:5'-Cgg TgT gTA CAA ggC CCg ggA ACg-3')扩增。PCR的反应体系(25μL):10 × buffer 2.5 uL,MgCl2 2 μL,dNTP 0.5 uL,引物各1.25 μL,DNA模板3 uL,ddH2O 14.05 μL,BSA 0.25 uL,Taq 0.2 μL。PCR扩增程序为:程序为:94 oC预变性2 min,94 oC变性1 min,55 oC退火1 min,72 oC延伸2 min,35个循环,最后72 oC再延伸10 min.。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后,用凝胶成像系统照相。

  T-RFLP技术

  采用T-RFLP技术对垂直流人工湿地中的细菌群落结构进行分析。T-RFLP技术依赖PCR和限制性酶切技术,它已被成功应用于微生物群落结构的比较分析、动态变化及特殊功能基因的鉴定等研究中,成为分析土壤、污泥、肠道等环境中微生物群落结构特征的有效技术手段。

  将人工湿地土样中提取的细菌DNA进行PCR,取纯化的PCR产物13 uL,按照酶产品的使用说明书,先加入2 uL ddH2O ,2 μL buffer ,70 oC时失活20 min,再加入2 uL BSA,最后加入Msp I(识别序列5' C ^CGG 3')1 uL,构成20 μL的反应体系,37 oC条件下酶切16 h,取5 μL酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测,将酶切产物送至基因公司分析。集合所有片段长度的谱带,有则计为1,无则计为0,统计成0、1矩阵,将统计结果导入Excel表中,应用SigmaPlot 9. 0统计软件中的主成分分析方法(principal component analysis, PCA)处理数据。

  数据分析

  采用SPPS16.软件对所测得的数据进行处理,主要进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD检验,以检验不同植物多样性处理之间植物生物量产量、细菌群落组成参数的差异显著性(LSD, P = 0.05),各变量之间的关系用Pearson方法计算相关性。群落总体组成的变化用主成分分析来判别。利用SigmaPlot 9. 0软件,对所测数据进行图表的绘制。

  结果与分析

  PCR及酶切反应结果

  将人工湿地土样中提取的细菌DNA采用荧光标记的引物(前引物:F968,后引物:R1401–1a)进行PCR扩增,扩增出约400 bp的预期条带(图2)。纯化后的PCR产物用MspI进行酶切,部分酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测(图3),表明酶切反应较完全。

  M

  图2部分荧光标记引物扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

  Fig. 2 Electrophoretogram of PCR products amplified with FAM-labeled primers

  注:M: DL2000 DNA分子量标准:其余泳道为从土壤中提取的细菌DNA的PCR产物.

  M

  图3 部分MspI酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图

  Fig. 3 Electrophoretogram of PCR products digested with MspI

  注:M: DL2000 DNA分子量标准:其余泳道为从土壤中提取的细菌DNA的PCR产物.

  主成分分析(PCA)

  土壤上层主成分分析(PCA)结果见图4。从中可知,美人蕉、水葱、混种、不栽各个处理的图像中彼此之间相距较近,表明这四个处理的细菌群落组成较相似。伞草与黄菖蒲两个处理的图像彼此相距较远,表明这两个处理的细菌群落组成有差异并且与其他4个处理的细菌群落组成也存在差异。

  主成分分析(PCA)能够清楚地区分了不同植物物种多样性处理之间的细菌群落代谢指纹。在图4中,PC1说明了细菌群落代谢指纹总体方差的13.831%,PC2仅说明了8.15%。沿着PC1横轴的正方向,基质中细菌群落代谢指纹可以分为两组,即湿地中的细菌群落代谢指纹将两个处理归为一组(伞草、黄菖蒲),将后四个处理归为一组(美人蕉、空白组、混种、水葱))。

  图4 人工湿地土壤上层细菌群落T-RFLP图谱的主成分分析

  Fig. 4 Principal component analysis(PCA)of TRFLP profiles from bacterial community composition in constructed wetlands

  注:SHC–水葱,SC–伞草,MRJ–美人蕉,HZ–混种,HCP–黄菖蒲,UNP–空白组

  土壤下层主成分分析(PCA)结果见图5。从中可知,美人蕉和伞草两个处理图像出现了重叠现象,表明这两个处理的细菌群落组成相似;同样的黄菖蒲和空白组两个处理图像也出现了重叠,表明这两个处理的细菌群落组成相似。水葱和混种两个处理图像相距较远,表明这两个处理的细菌群落组成存在差异。

  主成分分析(PCA)能够清楚地区分了不同植物物种多样性处理之间的细菌群落代谢指纹。在图4中,PC1说明了细菌群落代谢指纹总体方差的20.65%,PC2仅说明了10.81%。沿着PC1横轴的正方向,基质中的细菌群落代谢指纹可以分为两组,即湿地中的细菌群落代谢指纹将前两个处理归为一组(水葱、伞草、美人蕉),将后4个处理归为另一组(黄菖蒲、空白组和混种)。

  图5 人工湿地土壤下层细菌群落T-RFLP图谱的主成分分析

  Fig.5 Principal component analysis(PCA)of TRFLP profiles from bacterial community composition in constructed wetlands

  注:SHC–水葱,SC–伞草,MRJ–美人蕉,HZ–混种,HCP–黄菖蒲,UNP–空白组

  植物种类与植物生物量的关系

  植物种类与植物生物量的关系(如图6)。分析表明,栽培美人蕉的地上生物量(2003.122 g/m2,P >0.05 )显著高于其他处理组,栽培黄菖蒲、美人蕉、水葱和混种的这4组地上植物生物量没有显著差异(地上植物生物量分别为1920.936、2003.122、1685.796、1640.532 g/m2,P > 0.05),栽培伞草的地上生物量(949.288g/m2,P <0.05)与美人蕉的地上生物量有一定差距,且差异较显著(P <0.05)。

  图6 植物种类对植物生物量的影响

  Fig. 6 Effects of plant species on plant biomass production

  植物多样性与植物生物量的关系

  植物多样性与植物生物量之间的关系(如图7),分析表明,随着栽培植物种类数的增加植物地上生物量也有所增加,但增加的幅度较小,栽培1种植物和4中植物的平均地上生物量之间没有显著性差异(单种和混种的生物量分别为1636.7855和1640.532g/m2,P > 0.05)。

  图7 植物多样性对植物生物量的影响

  Fig. 7 Effects of plant diversity on plant biomass production

  植物的种类与细菌群落组成的关系

  植物的种类与细菌群落组成的关系(图8),分析表明,上层栽培水葱的有效片段数最高,且与上层其他植物种类都没有显著性差异(CK、黄菖蒲、美人蕉、伞草、混种的有效片段分别为:14.75、18.5、19.5、19、20.75,P>0.05)。下层栽培美人蕉的有效片段数最高,且与CK、黄菖蒲有显著性差异(CK、黄菖蒲的有效片段数分别为:16.5、18.25,P<0.05)。CK与水葱、伞草有显著性差异(水葱、伞草的有效片段数为28.4、24.8,P<0.05),黄菖蒲与水葱有显著性差异(水葱的有效片段数为28.4,P<0.05)。

  图8 植物种类对细菌群落组成的影响

  Fig. 8 Effects of plant species on bacteria community composition

  植物的种类与细菌群落组成的关系(图9),分析表明,上层栽培水葱的优势片段数最高,且与上层其他植物种类都没有显著性差异(CK、黄菖蒲、美人蕉、伞草、混种的优势片段数分别为:0、0、0.8、0.4、0.4,P>0.05)。下层不栽的优势片段数最高,且与下层其他植物种类都没有显著性差异(黄菖蒲、美人蕉、水葱、伞草、混种的优势片段数分别为:0.8、0.8、0.6、0.8、0.8,P>0.05)。

  图9 植物种类对细菌群落组成的影响

  Fig. 9 Effects of plant species on bacteria community composition

  植物的种类与细菌群落组成的关系(图9),分析表明,上层混种的多样性指数最高,且与上层其他植物种类都没有显著性差异(CK、黄菖蒲、美人蕉、水葱、伞草的多样性指数分别约为1.95、2.24、2.02、2.20、2.12,P>0.05)。下层栽培美人蕉的多样性指数最高,且与CK、黄菖蒲有显著性差异(CK、黄菖蒲的多样性指数约为1.90、1.99,P<0.05),水葱与CK、黄菖蒲有显著性差异(CK、黄菖蒲的多样性指数约为1.90、1.99,P<0.05)。

  图10 植物种类对细菌群落组成的影响

  Fig. 10 Effects of plant species on bacteria community composition

  讨论

  细菌群落主成分分析

  主成分分析(PCA)能够清楚地展现了不同植物种类多样性处理之间的细菌群落整体变化。整体可分为两个组,每个组内的不同处理的细菌群落之间有较大的相似性,如土壤下层的美人蕉和伞草处理图像上有重叠,表明两个处理的细菌群落有较大的相似性,而水葱的图像与美人蕉和伞草的图像相距较近,表明这三种处理的细菌群落相似性较高。

  植物多样性增强植物生物量

  本次实验结果表明:植物多样性与植物生物量之间表现为促进关系,但本次实验中随植物多样性的增加,植物生物量的增加幅度较小。此实验结果证实了植物多样性和系统生产力之间相互促进的观点。

  植物种类的改变影响了细菌群落参数

  实验结果表明,植物种类对人工湿地系统中细菌群落有较大影响,不同植物的种类对应的细菌群落组成也不相同。较多人工湿地的研究结果支持了本实验的研究结果,但也有研究结果表明植物种类对细菌群落的影响不明显,造成实验研究结果差异的原因可能是植物类型的不同。

  植物多样性与细菌群落参数的关系

  实验的结果表明,植物多样性对细菌群落结构参数如有效片段数、优势片段数和多样性指数有影响 。通过文献查阅,有相关研究的结论表明植物多样性对细菌群落无显著性影响,也有部分实验研究与本实验有相同的结论,至于哪种结论是证明的还有待于研究。

  结论

  基于对垂直流人工湿地中植物多样性的研究,测了不同植物多样性梯度(0种、1种和4种植物处理)植物地上部分生物量,细菌群落结构参数等指标。分析可得以下研究结论:植物多样性对人工湿地中细菌群落组成,地上植物生物量有不同程度的影响。(1)地上植物生物量随着栽培植物种类数的增加而增加,但增加的幅度较小(2)植物多样性对垂直流人工湿地中的细菌群落组成有影响。

  总之,本实验的研究成果表明,在实际运行的垂直流人工湿地中植物种类多样性对其植物生物量有一定影响,且影响关系为正相关。植物多样性对细菌群落结构也有影响,但该结论是否正确仍有待于研究。

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