周一至周五 | 9:00—22:00

期刊论文网 > 生物与环境论文 > 植物学论文 > 最新植物学类论文 茉莉酸对番茄菌根形成的影响

最新植物学类论文 茉莉酸对番茄菌根形成的影响

2018-12-02 11:31:46来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要

  丛枝菌根真菌(Arbuscula mycorrhizal fungi,简称AMF)是菌根中应用最广泛、与农业生产实践关系最为密切的一类。大约80%的陆生植物依靠AMF吸收矿物质营养,调节内源激素水平以及改善生态系统的等。AMF与植物形成互利互惠共生体即为丛枝菌根(Arbuscular mycorrhiza,AM),而丛枝菌根的形成也离不开激素的调节,已有研究表明,茉莉酸(Jasmonic acid,JA)及其衍生物就直接参与AMF形成的调节。JA是一种酚类化合物,是高等植物体内的生长调节物质。

  本实验以野生型番茄植株以及JA生物合成缺失突变体spr2为实验材料,用根内球囊菌(Glomus intraradices,G.i)去侵染番茄根部,以探究JA对Gi与宿主整合效率的影响,并探讨JA的生物学作用机制。

  主要结果及结论如下:

  1.接菌初期(30 d),茉莉酸缺失突变体对菌根的形成有抑制,但接菌45 d后,这种抑制消除。野生型植株在接菌30 d时菌根形成效率达到最大,其后开始降低。

  2.接菌植株的地上生长速率高于其未接菌的对照;接菌植株的侧根数量显著多于未接菌的对照。

  3.接种菌根真菌改变寄主的生理生化代谢,如光合作用相关过程,抗氧化防卫反应等。

  4.蛋白组学研究显示,接菌菌根真菌显著改变蛋白质的表达水平,有数百种蛋白质或被上调或被下调。这些差异表达的蛋白质参与植物多方面的生物学过程,如核糖体、内质网、RNA转运、氨基酸合成、细胞内吞作用、剪接体、淀粉和糖代谢、嘌呤代谢、mRNA相关过程、苯丙氨酸途径、RNA降解、脂肪酸代谢、碳代谢、嘧啶代谢、泛素相关代谢、不饱和脂肪酸合成、氨基酸和核糖代谢、谷胱甘肽代谢、氧化磷酸化、糖酵解和糖异生等过程。

  5.基因定量表达显示,脂氧素生物合成过程参与菌根的形成。

  关键词:番茄,根内球囊菌,茉莉酸

  主要符号表

  缩写符号英文名称中文名称AMFArbuscular mycorrhizal fungi丛枝菌根真菌AMArbuscular mycorrhizal丛枝菌根CKControl check野生型番茄WTWild type野生型番茄spr2Suppressor of prosystemin-mediated response 2茉莉酸合成缺失G.iGlomus intraradices根内球囊霉菌CATCatalaase过氧化氢酶PODPeroxide过氧化物酶SODSuperoxide dismutase超氧化物歧化酶JAJasmonic acid茉莉酸LOXlipoxygenase脂氧合酶AOSallene oxide synthase丙二烯氧化合酶DESdivinyl ether synthase.乙烯醚合酶OPR3oxo-phytodienoic acid reductase12-氧代植二烯酸还原酶HPLhydroperoxide lyase脂肪酸过氧化水解酶JMTjasmonic acid carboxyl methyltransferase茉莉酸甲基转移酶MDAMalonyl dialdehyde丙二醛

  第一章引言

  1.1番茄

  番茄(Lycopersicon esculentum Mill),起源于安第斯山,如今在全国各地均有大面积种植。番茄栽培技术较早的出现在墨西哥,后来逐渐传到葡萄牙、意大利甚至英国以及中欧各个国家,最后传至亚洲,中国的栽培技术于17世纪主要是从东南亚和欧洲等传入,并迅速发展成为最受欢迎的蔬菜之一。番茄生长的最适温度在20-25℃,属于喜温性蔬菜,大小不等,常呈圆形或椭圆形,味道鲜美,肉质丰厚多汁。

  西红柿的营养价值非常高,所含的维生素C对促进新陈代谢、增加抗癌能力、增加血管的柔韧性以及预防心脏病都有很大的好处,据研究,人类已丧失自身合成维生素C的能力,而番茄中含有丰富的维生素C可作为人类摄取维生素C的重要来源;西红柿中的番茄素也有健脾健胃、预防口苦烦渴、抗病毒、抗菌、抗炎、调节免疫以及抑制乙酰胆碱酯酶、降低血浆中胆固醇和抗利尿的作用;番茄红素也是西红柿含有的维生素的一种,具有抗氧化衰老、抗癌、能够调节机体免疫消除运动并性疲劳以及抑制脂质过氧化等作用。正是由于番茄的味道鲜美、营养价值高、种植方法简单以及长期积累了丰富经验,使得它备受人们的喜爱。

  1.2丛枝菌根

  1.2.1丛枝菌根简介

  自然界中大多数植物均能与AMF形成互利互惠共生体,而从严格意义上来说AMF是寄生在植物的根上的,不过这种寄生不会对宿主造成伤害,相反还会促进AMF和宿主的共同发展。高等植物可以通过光合作用将空气中的二氧化氮转化为有机化合物,而AMF则不能,因此必须依赖植物的供给,而AMF也能为宿主提供N、P等必要的元素。绝大部分的植物豆科植物均能与AMF建立起共生的关系,例如百脉根(Lotus corniculatus)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、蒺藜苜蓿(M.truncatula)。由于菌根真菌对宿主的侵染的部位、结构特征以及自身特点的不同,可将其分为三类。第一类为外生菌根,这类菌丝只寄生在宿主的根表皮外层,而不会进入到皮层以下的柔膜细胞中。第二类为内生菌根,这类菌丝进入到宿主的柔膜细胞中,并会长出许多分枝状的菌丝。第三类为内外生菌根同时具有前两者菌根的共同特点即。丛枝菌根对植物具有扩大寄主根吸收面积、提高寄主根系矿质养分循环、增强植物抗病性等作用。

  1.2.2丛枝菌根真菌的研究进展

  AMF在农业生产以及自然生态环境中的应用十分广泛。AM对植物吸收水分的影响很大,能够提高植物耐受干旱的能力,经研究表明,在干旱条件下,AMF能提高宿主根源信号的合成、氧化酶活性、渗透调节能力等。1971年Safir发表了大豆接种摩西球囊菌后可降低其水分运输的阻力的观点。而也有大量研究证明,松树苗AM转移水分的速度比非菌根根系要大的多,且经过对菌根和非菌根的结构观察发现,菌根运输水分的阻力比非菌根要小的多,这些为菌根促进水分的吸收提供了直接的证据。Baru等、李涛等在研究AM共生体对增强植物抗旱性时发现,晚期胚胎富集蛋白起到了关键作用。同时也有研究表明,AM能够降低由干旱胁迫诱导出来的晚期胚胎富集蛋白中的脱水素在植物体内的积累;在干旱胁迫下,植物还可通过降低细胞的水势来减少水分的散失,如脯氨酸就是在抗旱胁迫中比较常见的渗透调节物质;此外,蛋白质组学的研究还有望成为未来抗旱机制的重要影响因子,Bestel-Corre等用AMF接种苜蓿后发现有55种蛋白的表达不同于对照组,其中包括由AMF诱导新产生的蛋白,以及一些上调和下调的蛋白。在未来可能会利用蛋白质组学进行更深层次的抗旱机制的研究,以及利用基因芯片技术等来对基因进行定位及检测,甚至克隆出水分生理相关的基因等。

  绝大多数植物均能形成AM,而这种现象在农业方面的研究中更为普遍。据研究表明,AM活性的强弱与农作物的产出关系密切,例如祝英在研究丛枝菌根对小麦生产力的影响中提到,接种AMF后的小麦无论是干旱条件还是湿润条件其产籽量及收获指数均显著提高;丛枝菌根可增强植物的光合作用效率,赵士杰报道了AM促进植物对磷的吸收进而影响光合作用,对植物的品质有较大影响,张中峰等、梁倩倩等用丛枝菌根接种青冈栎幼苗、牡丹发现,植株的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、胞间二氧化碳浓度以及水分利用率等均显著提升,光合作用效率显著增强;AM还具有抵御不良环境和预防病虫害以及减弱其损害的作用,Gianinazzi等[44]和Hildebrandt U等分别证明了AM提高宿主植物对干旱、重金属的耐受力,而罗巧玉等发现AM能够诱导植株形成抗病防御系统,如促进植物激素的合成、诱导信号物质的合成、调节相应基因的表达、以及诱导相关蛋白的合成等。

  1.3茉莉酸及其研究进展

  茉莉酸(jasmonic acid,JA)是广泛存在于高等植物体内的生长调节物质。人们早在1971年就已经能够将JA分离提取出来,但是对其具体的作用和功能还鲜有报道,直到1980年Udea和Kato在苦艾中分离出了茉莉酸甲酯并发现其具有促进衰老的作用,人们开始广泛研究其生理效应。此后研究发现JA作为信号分子调节生理过程是大多数植物必不可少的,如植物在受到物理伤害(如机械损伤)或者受到动物攻击、病虫害以及环境胁迫时就会启动防御系统;此外,JA对植物的种子萌发、生长发育、果实成熟和卷须缠绕等都具有重要意义;在植物受到生物及非生物胁迫的情况下还可诱导机体蛋白酶抑制剂、多种抗氧化酶活性、壳聚糖酶活性和多酚氧化酶活性等。

  随着科技的发展,人们对茉莉酸的研究越来越深入并已取得了很大进展。在信号传导方面,JA信号途径在依赖泛素调节蛋白的选择性降解中发挥着重要作用,这对细胞程序性死亡、胞吞作用、基因转录以及防御反应也具有重要意义。JA还可分别与乙烯、脱落酸、水杨酸和一氧化氮一起来调节植物的防御反应。JA对植物的次生代谢也有重要影响,如提供其必要的底物、促进生代谢产物的合成。未来还可能进一步研究茉莉酸的合成以及调控的机理、JA的信号传导机理以及JA介导的相关的基因克隆等等。

  1.4茉莉酸与丛枝菌根相互作用研究进展

  目前,对于茉莉酸与丛枝菌根相互作用的研究还很少,不过也有研究证明了茉莉酸对丛枝菌根的形成有着较大的影响,如利用RNA干扰技术对蒺藜苜蓿中AOC基因进行敲出,从而降低JA的合成,结果表明AMF的丛枝丰度,强度和数量都明显下降。而对茉莉酸缺失合成突变体spr2进行外施处理JA后,其丛枝菌根长势又可恢复。从而说明了JA对AM形成具有重要的调控作用。同样的,接种了丛枝菌根的植物体内JA合成的关键酶基因水平也显著提高,也有研究表明,JA的信号传导途径与AM的形成阶段有关。

  1.5论文简介

  1.5.1基金项目

  本实验由国家自然科学基金项目“茉莉酸调控番茄丛枝菌根形成的机理研究”(No.31572213)资助。

  1.5.2论文主要内容及创新点

  本实验以番茄野生型及其茉莉酸合成缺失突变体spr2为实验材料,以根内球囊菌和内源茉莉酸为切入点,分别测定了在茉莉酸介导下的菌根侵染情况、植株的生长指标、光合指标、抗氧化酶活性、并通过细胞组成,生物过程以及分子功能方面分析差异蛋白的表达变化,并研究茉莉酸合成相关基因LOXA、LOXD、AOS1、AOS2、AOC以及茉莉酸应答基因DES、OPR3、HPL的达情况等,以研究内源茉莉酸调节丛枝菌根形成的机理。

  实验的创新点为实验材料野生型番茄和茉莉酸合成缺失突变体spr2的选择,用以控制番茄体内茉莉酸的含量,以此研究茉莉酸介导的一系列生理和代谢活动;并选用根内球囊菌对实验材料进行侵染,以探究由其对番茄丛枝菌根形成过程中野生型与突变体之间各项生长指标、抗氧化系统、蛋白质组及基因之间差异;将茉莉酸调控与菌根侵染对番茄的各项指标的影响结合起来,共同研究并进行系统的分析与讨论,从而初步揭示茉莉酸和丛枝菌根对番茄相关的蛋白质组学分子的作用机理。

  第二章材料与方法

  2.1实验材料

  2.1.1番茄

  实验材料由美国密歇根州立大学植物研究实验室提供:野生型番茄(CK)和其茉莉酸合成缺失突变体(spr2)。

  2.1.2丛枝菌根真菌

  选取的丛枝菌根真菌为根内球囊菌。

  2.2材料培养

  2.2.1番茄植株的培养

  1.播种前处理:选取足够的颗粒饱满的野生型番茄和突变体种子于培养皿中(底部铺上一张滤纸),加入少量的55℃灭菌水,浸泡1 h后,倒掉灭菌水,用配制好的75%乙醇浸没种子并摇晃杀菌1 min后倒掉再用灭菌水冲洗三次,加入少量灭菌水,以浸没种子为宜,于25℃黑暗下,湿度95%的光照培养箱中进行催芽,待种子长出小白芽即可进行播种。

  2.播种:取来一个长约30 cm、宽20 cm、高10 cm方形不带盖盒子(底部透气),盒子和基质营养土进行高温灭菌处理后,将营养土加入盒子中厚度约7cm,然后将长出小白芽的种子均匀的移入土中,小白芽朝下,每两颗种子间隔1 cm,种好后覆盖一层1 cm厚度的基质营养土,喷洒适当的灭菌水,以保持湿度。

  3.移苗:15 d后,选取长势相似的幼苗分别转移至小花盆中(上口径5 cm,下口径4 cm,高6 cm)。实验材料共分两组,不接菌组:野生型番茄(WT)和突变体番茄(spr2),以及接菌组:根内球囊菌+野生型番茄(WT+Gi)和根内球囊菌+突变体番茄(spr2+Gi)。本实验采用沙培法进行培养,实验用具花盆、托盘、沙子等均须提前清洗并高温灭菌。选用规格的小花盆培养幼苗30 d,菌根真菌和沙子的比例按1:10的比例混匀。培养45 d后,再将植株移入大花盆中。

  4.苗期管理:每隔一周浇一次Hogland营养液,适当通风。

  2.2.2丛枝菌根真菌菌剂的制备

  菌种繁殖选用三叶草作为侵染植株,种子提前用灭菌的温水浸泡一天,种在花盆规格为上口径25 cm、下口径20 cm、高18 cm的塑料盆中,菌种的繁殖选用河沙作为培养基质,种植之前要将河沙过筛以除去较大石子,将过筛后的河沙与花盆、托盘等一同在121℃下高温灭菌备用。将菌种和河沙按1:4的比例混合均匀装入大花盆中,均匀撒入浸泡好的三叶草种子,最后覆上1 cm厚的河沙,喷洒适当水,为了保持一定的空气湿度,最好在上面覆盖一层保鲜膜,直到幼苗几乎全部长高时取下。日光照射,温度为25℃,每隔半个月浇一次Hoagland营养液。10个月后,随机抽取三叶草根部进行台盼蓝染色,观察菌根侵染状况,确定侵染效果良好后便可收获,收获方法为除去花盆顶部和底部的沙子,只留中间部分,并将三叶草根部并剪碎,晾干后保存。

  2.3材料收集

  本实验选取的实验材料为菌根化定植30 d、45 d、60 d的番茄活体幼苗以及各个时期的根,挑选长势相同的植株进行测定。

  2.4实验方法

  2.4.1菌根形成的测定

  实验方法选用台盼蓝染色法,分别对定植30 d、45 d、60 d的番茄染色后的根部进行镜检观察并拍照。

  1.实验步骤:

  取各处理组长势相似的植株,将根洗干净后剪成1 cm的根段,各取一支小烧杯并做好标记,将剪好的根段分别置于小烧杯中,加入固定液固定24 h,倒掉固定液后加入碱化液,将水浴锅调至90℃,煮20-30 min(依据根段的老嫩的程度进行适当调整),倒掉碱化液,蒸馏水清洗三遍后,加入酸化液浸泡10小时,蒸馏水冲洗三次倒掉,加入台盼蓝染色液,于90℃水浴30 min,取出后倒掉台盼蓝染液,蒸馏水清洗三遍,加入脱色液浸泡24小时,并根据脱色情况更新新鲜的脱色液。

  2.镜检步骤:

  从脱色后的处理组中选取随机100个番茄根段,载玻片上铺好然后盖上盖玻片,于显微镜下观察并记录G.i侵染的根段数目,拍照。

  根系菌根侵染率=Gi侵染的根段数/100×100%

  3.台盼蓝染色试剂配制方法如表1.

  表1台盼蓝染色试剂配制方法

  Table.1 Preparation method of trypan blue staining reagent

  试剂配制方法固定液50 ml冰醋酸与150 ml乙醇混合均匀碱化液用蒸馏水将20 g氢氧化钾定容至200 ml酸化液用蒸馏水将4.7 ml 36%盐酸定容至20 0ml台盼蓝染色液将100 ml丙三醇、10 ml 1%HCL、0.1 g台盼蓝溶解后用蒸馏水定容至200 ml脱色液用蒸馏水将100 ml丙三醇、10 ml 1%HCL定容至200 ml2.4.2鲜重的测定

  本实验分别对定植30d、45 d、60 d的CK、spr2、CK+Gi、spr2+Gi四种处理组进行测定,共三次重复,每次测定6棵植株。

  2.4.3根长的测定

  通过植株的根系总长和根系的繁茂程度可以判断出植株的生长状况,植株的根能够吸收营养和水分,大量研究表明,绝大多数丛枝菌根可促进寄主的侧根数、根系投影面积及表面积等。本实验测定的指标为番茄不同时期的根长。

  2.4.4株高的测定

  株高是植物形态学测定的最基本也是最直观的指标之一,本实验测定的株高为地上部分根茎到主茎顶部之间的长度。分别对定植30 d、45 d、6 0d的四种番茄:野生型CK、突变体spr2、野生型+根内球囊菌CK+G.i、突变体+根内球囊菌spr2+G.i进行测定,共三次重复。

  2.4.5菌根化对番茄光合参数的影响

  测量之前提前半小时将植株置于阳光下光照,每组处理组取相同叶位的叶片进行活体测量,分别测定叶片的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率三种生理指标。

  2.4.6酶提取液的制备

  1.制备酶提取液:各处理组分别取长势相似的植株的根剪碎后各称取0.5 g装于10 ml eppendorf管,加入5 ml的酶提取液研磨机打磨300 s,取出后冰中静置10 min,15,000×g,离心20 min,离心后取上清,转移到新的离心管,即为本实验的酶提取液。冰箱4℃保存。

  2.酶提取液即为0.1 mol/L PH7.8磷酸缓冲液:21.25 ml储备液A(蒸馏水将13.9 g磷酸二氢钠定容至500 ml)+228.75 ml储备液B(蒸馏水将十二水合磷酸氢二钠定容至500 ml)。

  2.4.7丙二醛含量的测定

  1.实验试剂:

  20%TCA 0.6%TBA溶液:用pH 7.8的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液将20 g TCA以及0.6 g TBA在70℃恒温磁力搅拌器上搅拌溶解,待TBA溶解后冷却至室温后定容至100 ml。

  2.丙二醛测定方法参照张志良[62]的并进行修改。

  3.公式:

  样品浓度=(OD532-OD600)×6.45-OD450×0.56;

  丙二醛含量=测定的丙二醛浓度×粗酶液体积/样品鲜重

  2.4.8可溶性蛋白含量的测定

  1.测定方法:

  提取方法同前面的酶提取。取来4支1.5 ml离心管,依次加入1 mlG250、100μ酶液上清,混合均匀后静置反应5min,取200μl加入酶标板于595 nm处测定OD值。

  ③公式:

  样品蛋白质含量=(蛋白质含量×稀释倍数)/称取重量

  2.4.9抗氧化物酶活的性的测定

  2.4.9.1超氧化物歧化酶(SOD)的测定

  1.实验步骤:

  取1.5 ml EP管,两个空白对照,其余的依次加入500μl甲硫氨酸(Met)溶液、250μl蒸馏水、100μl氯化硝基四氮唑蓝(NBT)溶液、5μl酶提取液、100μl核黄素(VB2)溶液,两个对照将酶液用蒸馏水替换,其余所加试剂和处理组相同,充分混合均匀,将其中一个对照进行黑暗处理,其余的所有都在4000 lux灯管下照射30 min。于560 nm处测定吸光值。黑暗处理的样品作为空白对照,测得的结果记为D0,光照下的对照测得结果记为D样。

  2.公式:

  SOD活性=(D0–D样)×酶液体积/(测样体积×D0×酶液量×反应时间×样品重量×50%)

  2.4.9.2过氧化物酶(POD)的测定

  1.实验试剂:

  万分之三的过氧化氢(H2O2):用蒸馏水将50μl 30%H2O2定容到50 ml

  2.实验步骤:

  取1.5 ml EP管,依次加入500μl配制好的万分之一的过氧化氢、200μl POD反应液、100μl酶液,空白则将酶液换成酶蒸馏水。混合均匀立即于470 nm处开始测定,初放入时的OD值作为初始值,之后每30 s测一次。

  3.公式:POD活性=ΔOD470×酶液体积/(测样体积×间隔时间×0.5 unit×样品重量)×1000

  2.4.9.3过氧化氢酶(CAT)的测定

  ①实验试剂:

  万分之三过氧化氢(H2O2)配制方法同POD的方法

  4%钼酸铵:用蒸馏水将4 g钼酸铵定容到100 ml

  ②实验步骤:

  取1.5 ml EP管,依次加入380μl 4%钼酸铵、20μl酶液和400μl H2O2,另取一只EP管,依次加入380μl 4%钼酸铵、20μl蒸馏水和400μl万分之三的H2O2作为空白对照,于405 nm处测定吸光值。

  2.4.9.4同工酶分析

  1.凝胶的配制:

  分离胶:准备好小烧杯一支,依次分别加入30%丙烯酰胺(7.5%即13.5 ml,12.5%即29 ml),分离胶缓冲液7.5 ml,双蒸水32.5 ml,过硫酸铵0.25 ml,TEMED 0.04 ml,边加边搅拌。

  浓缩胶:另准备一支小烧杯,依次分别加入30%丙烯酰胺(5%即8.3 ml),浓缩胶缓冲液7.5 ml,双蒸水32 ml,过硫酸铵0.5 ml,TEMED 0.04 ml,边加边搅拌。

  POD浓缩胶5%,分离胶7.5%,SOD浓缩胶5%,分离胶12.5%。先加分离胶加至玻璃板三分之二的位置后等待分离胶凝固,然后加入浓缩胶到距离玻璃板顶部边缘1 mm,立刻卡入梳子,浓缩胶凝固后,小心拔出梳子,按设定好的顺序进行点样。电泳槽中加入电解液,通入电压(POD恒压120 v,240 v.SOD恒压150 v,300 v.)

  3.染色:

  SOD染色:首先用NBT染液(0.4 g NBT加入至400 ml pH 7.0磷酸缓冲液)在黑暗下染20 min,取出后蒸馏水冲洗三遍。再用核黄素染液(0.0042 g核黄素加入至400 ml pH 7.0磷酸缓冲液溶解,并加入0.5 ml TEMED)黑暗15 min,取出后蒸馏水冲洗三遍,静置10 min。显色:将显色液(0.012 g EDTA加入至400 ml pH7.8磷酸缓冲液)全部覆盖住胶板,在强光下照射,直到条带清晰可见。

  POD染色:36 ml超纯水将1 g联苯胺溶解后加入9 ml冰醋酸。染色时取上述染液10 ml,加70 mg抗坏血酸,0.4 ml H2O2,再加76 ml超纯水充分溶解。

  2.4.10蛋白质组研究方法

  2.4.10.1蛋白抽题质检

  1.实验材料

  实验材料选用定植30 d的WT、spr2、WT+G.i、spr2+G.i番茄植株。

  2.实验方法

  将各组番茄根部洗净后擦干水分剪碎,分别称取0.3 g于研钵中,加入一定体积的提取溶液,于液氮中进行研磨,后将研磨液装入离心管中于4℃,10,000 g,离心1 h;收集上清液,并按1:3的体积加入预冷丙酮/甲醇溶液混匀后于-20℃冰箱中孵育1 h;4℃,15,000 g,离心15 min;取出后提前预冷丙酮漂洗2次;4℃,15,000 g,离心5 min,收集沉淀即为蛋白沉淀;于室温下风干(可加入适量裂解液)。

  3.电泳检测

  从收集好的风干的蛋白中各取25μg样品于0.2 ml离心管中,并按5:1的体积比例加入5×上样缓冲液溶解后于水浴锅中水浴5 min,小型离心机14,000×g,离心10 min取上清,进行10%SDS-PAGE电泳。

  ②电泳条件:保持恒流14 mA时间90 min。

  ③考马斯亮蓝染色。

  2.4.10.2质谱分析

  仪器主要采用质谱(Q-Exactive HF)、液相(Easy nLC/Ultimate 3000)、质谱柱(C18 1.9 mm 150μm×120mm)、质谱预柱(C18 3 mm 100μm×20 mm)进行质谱分析,使用的数据库为uniprot-lycopersicon及搜索软件为Proteome Discover

  2.4.10.3 GO分析

  GO分析是目前分析差异蛋白的功能的一个非常重要的工具,包括对生物过程、细胞组成以及分子功能方面的分析。

  2.4.10.4 KEGG库分析

  KEGG库能够借助Pathway更进一步了解蛋白之间相互作用的生物行为,并分析在生理生化代谢以及信号转导中参与的蛋白质。

  2.4.11实时定量PCR研究方法

  1.RNA提取:

  ①各处理组分别取相同叶位叶片60 mg,装于无RNase离心管中,于研磨机中打磨180 s,迅速加入175μl RNA裂解液(加乙醇),使劲摇晃,再加入350μlRNA稀释液,混合均匀,小型离心机20000 r,离心10 min。

  ②用移液枪小心吸取上清并转移至1.5 ml新离心管中后加入200μl 95%乙醇,连续吹吸几次,转至离心柱装配体。13000×g,离心10 min。

  ③弃上清,在冰上加入600μl已加入95%乙醇的RNA洗涤液。13000×g,离心1 min。

  ④弃上清,按下列顺序配制DNase孵育混合物:

  黄色核心缓冲液40μl

  0.09 M氯化锰5μl

  DNaseㄧ5μl

  用移液枪小心将配好的孵育液均匀地覆盖在装配体离心柱底部的膜上,孵育时间为15 min后加入200μl已加入乙醇的DNase终止液进行终止,于13000×g下,离心1 min。

  ⑤用600μl RNA已加入乙醇的洗涤液13000r,离心1min。

  ⑥弃上清,加入250μlRNA已加入乙醇的洗涤液,20000 r,离心2 min。

  ⑦准备4个1.5 ml洗脱管,取下离心柱安放在洗脱管上,加入100μl无核酸酶水,13000 g,离心1 min,收集洗脱于-70℃保存。

  2.反转录:

  按下列试剂的顺序依次加入到无RNase的PCR管中:

  5×Prime Script Buffer 4μl

  Prime Script Enzyme Mix1 1μl

  Oligo Dt Primer 1μl

  Random 6 mers 3.5μl

  Total RNA 0.5μl

  反应条件:37℃水浴15 min(反转录反应)

  85℃水浴5 s(反转录酶失活反应)

  3.实时定量PCR

  按下列顺序加入下列试剂到PCR管中:

  PCR Forward Primer(10μM)1.6μl

  PCR Reverse Primer(10μM)1.6μl

  灭菌水6.3μl

  DNA模板0.5μl

  SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)10μl

  反应条件:

  预变性:95℃30 s

  PCR反应:95℃5 s

  60℃15 s

  72℃20 s

  Cycle:40

  第三章结果与分析

  3.1茉莉酸对番茄的菌根侵染的影响

  3.1.1菌根侵染的形态结构

  菌根侵染不同时期的形态结构,镜检结果如图1所示。菌根侵染30d时,无论是野生型还是茉莉酸缺失突变体均有大量的菌丝形成,同时均可看到有孢子生成,接种G.i的野生型番茄丛枝丰度较突变体的要高(如图1);接种根内球囊菌45d时,spr2菌丝丰度和密度同30d的比显著升高,且高于同一时期的野生型番茄植株的菌丝丰度和密度60d时,野生型和突变体菌根丰度均显著下降,且突变体的仍高于野生型的。这表明茉莉酸缺失对菌根真菌侵染番茄根的早期(本研究定义为30天)有抑制作用,但到后期(45天-60天)反而有一定的促进作用。此外,接种45 d时菌根的定殖效率高于30 d和60 d,表明接种60 d时,菌根可能退化。

  图1不同时期菌根发育的形态结构

  3.1.2菌根侵染率

  对番茄根部进行台盼蓝染色后分别对定植30 d、45 d和60 d的两种株型的菌根侵染情况进行观察结果如图2所示。野生型植株的侵染率在30 d时即达到最佳,之后随着培养天数的增多,侵染率逐渐下降;spr2突变体则与野生型CK不同,呈现出“低-高-低”的侵染规律,由于spr2体内缺乏茉莉酸的合成,说明内源茉莉酸对菌根侵染率具有一定的调控作用,即侵染初期茉莉酸缺失抑制菌根的形成,而到后期(45天)则没有抑制作用。但野生型植株从接种45天时菌根开始退化。

  图2不同时期菌根侵染率

  3.2菌根真菌侵染对生长指标的影响

  3.2.1根内球囊菌对番茄植株鲜重的影响

  植株的鲜重是生长的一项重要指标,能够反映一定的营养状况判断其生长水平[63]。番茄菌根定植30 d、45 d和60 d后测得的鲜重结果如图3所示。从图1中可以看出菌根侵染3 0 d和4 5 d时,番茄植株的鲜重较未菌根化的对照。在菌根真菌侵染30 d时,无论是不加菌的野生型与突变体之间还是加菌的野生型与突变体之间差异不显著,接菌45 d时,不加菌的野生型较突变体的鲜重显著增加,而在G.i侵染的植株中,野生型与突变体之间无显著差异。菌根真菌侵染60 d时,野生型和突变体鲜重较不加菌的对照有所增加,但野生型的增加不显著,这些结果表明,菌根的定殖(即使是后期有所退化)在一定程度上提高植物的生长,可能与水分和矿质营养的吸收与转运相关。

  图3不同时期菌根化对番茄鲜重的影响

  3.2.2菌根真菌侵染对番茄根生长的影响

  丛枝菌根真菌能够利用自身的菌丝侵入到宿主的根系中以此形成菌根,而外延的根系菌丝除了能够吸取植物的养分和水分外,还能够形成庞大的菌根网络系统,大大增加了与宿主互利互惠的作用。如图4所示,接种G.i的野生型番茄和突变体番茄侧根数量均较未接菌的增加。接菌30 d时,植株根长与未接菌的对照无显著性差异,而接菌4 5d时,野生型植株的根较其未接种的对照长,但突变体无差异。接种60 d时,野生型和突变体与其各自未接菌的对照根长均无差异(图5)。这些结果显示,菌根的定殖对根丰度的影响远大于对根长的影响。

  图4菌根定植不同时期番茄根生长的影响

  图5.不同时期菌根化对番茄根长的影响

  3.2.3菌根化对番茄株高的影响

  株高是衡量植株生长状态的指标之一,不同时期的株高情况如图6所示。接菌30 d时,突变体株高较其未接菌的对照高,但野生型接种与未接种之间无差异。在Gi侵染45 d时,突变体株高与其未接菌的对照相比无显著差异,但野生型株高较其对照增加,接种60 d时的情形与45 d时的相似。

  图6菌根定植不同时期番茄株高情况

  3.3菌根真菌侵染对番茄叶片光合指标的影响

  接种30 d分别对植株的净光合速率、气孔导度以及蒸腾速率进行测定结果如图7、图8和图9所示。虽然菌根真菌的侵染对这些指标有所影响,但都未达到显著性差异。

  图7 G.i侵染对净光合速率的影响

  图8 G.i侵染对气孔导度的影响

  图9 G.i侵染对蒸腾速率的影响

  3.4菌根真菌侵染对番茄根中丙二醛形成的影响

  丙二醛(malondialdehyde,MDA)作为膜脂过氧化的终产物可以衡量细胞受胁迫损害的严重程度,通常植物体内MDA含量越高,植物受损的程度越重。从图10看出,G.i侵染的番茄植株较未接菌的番茄植株丙二醛含量显著升高,而接菌的野生型和接菌的突变体以及未接菌的野生型和未接菌的突变体之间并无显著差异,这一方面表明茉莉酸对番茄根丙二醛含量不具有调控作用,另一方面显示,G.i侵染对根是有氧化胁迫影响的。

  图10 G.i侵染对丙二醛含量的影响

  3.5菌根真菌侵染对番茄根中可溶性蛋白含量的影响

  接种45 d后对番茄根可溶性蛋白检测结果如图11所示。4种类型的番茄植株并无显著差异,说明G.i以及茉莉酸对植物体内可溶性蛋白含量并不相关。

  图11.G.i侵染对可溶性蛋白含量的影响

  3.6菌根真菌侵染对番茄抗氧化酶的影响

  植物在生长发育过程中由于光照以及氧气等因素过强和过多,会使体内积累过多的活性氧,如超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢等。此时植物体内就会立即启动防御系统也即抗氧化系统,刺激诱导酶的产生,并通过对各种酶活性的调节,以及时的清除体内自由基,防止对植物体的伤害。抗氧化系统主要有两种,包括抗氧化酶和抗氧化剂,本实验主要研究三种抗氧化酶:超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)。

  3.6.1菌根真菌侵染对番茄根内SOD活性的影响

  SOD在植物体内的主要生物功能是将超氧化物催化分解生成基态氧和过氧化氢。在植物的抗氧化系统中作为抵御活性氧的第一道防线。如图12所示,接菌不同时期的野生型和突变体植株的酶活均高于各自未接菌的对照,表明G.i的定殖可增加SOD活性。

  图12 Gi侵染对SOD含量的影响

  3.6.2菌根真菌侵染对番茄根内POD含量的影响

  POD能够催化过氧化氢分解为水和氧气,是一种诱导酶,且在催化过程中需要电子供体。如图13所示,番茄植株定植30 d、45 d和60 d时POD活性逐渐增强。接种30 d时,两种基因型的POD活性高于其各自未接种的对照,表明菌根的形成诱导POD活性,然而接种45 d时,POD活性恢复至对照水平,但60 d时,接菌的植株POD活性又高于其未接菌的对照,显示该酶活性是动态变化的,也反应了植物内在生理的变化。

  图13 G.i侵染对POD含量的影响

  3.6.3接种菌根真菌对番茄根内CAT含量的影响

  对定植45 d番茄过氧化氢酶测定结果如图14所示。与POD相似,该时期菌根对CAT活性具有一定的促进作用但无明显的影响。

  图14 G.i侵染对CAT含量的影响

  3.6.4 SOD和POD同工酶的变化

  3.6.4.1 SOD同工酶电泳

  如图15所示,SOD同工酶活性在菌根定殖30 d、45 d和60 d呈现逐渐升高的趋势,尤其是接种60 d时。这与之前溶液测得的该酶活性变化趋势基本一致。然而,从该酶的同工酶表达模式来看,植物的发育时期对其影响要比菌根的影响更大,因为接菌的植株与其未接菌的对照相比,变化并不显著。

  30d 45d 60d

  spr2

  CK

  Gi+spr2

  Gi+CK

  spr2

  CK

  Gi+spr2

  Gi+CK

  spr2

  CK

  Gi+spr2

  Gi+CK

  图15 SOD同工酶电泳结果

  3.6.4.2 POD同工酶电泳

  POD同工酶电泳如图16所示。随着接菌时间的增加POD同工酶带强度逐渐增大,如45 d的显著强于30 d的,而60 d酶活又显著高于45 d的。G.i侵染的植株酶活强度高于未接菌的,表明G.i可以提高抗氧化酶POD的活性。未接菌的野生型酶活性较未接菌的突变体高,说明茉莉酸对抗氧化酶活性也具有一定的调控作用。该结果与该酶溶液测得的活性相一致。

  30d 45d 60d

  spr2

  CK

  Gi+spr2

  Gi+CK

  CK

  spr2

  Gi+spr2

  Gi+CK

  Gi+CK

  spr2

  CK

  Gi+spr2

  图16 POD同工酶电泳结果

  3.7菌根化对番茄植株蛋白质组学的影响

  3.7.1蛋白抽提质检

  3.7.1.1蛋白定量

  如表2所示,蛋白定量结果显示spr2、WT、G.i+spr2、G.i+WT的蛋白总量分别为214μg、121μg、310μg、396μg。

  表2蛋白定量结果

  样品号称取样品量(g)OD吸光值蛋白浓度(μg/μL)蛋白总体积(μg)蛋白总量(μg)spr20.30.8632.14100214WT0.30.7871.21100121G.i+spr20.30.9403.10100310G.i+WT0.31.0103.96100396

  3.7.1.2电泳检测结果

  SDS-PAGE电泳结果如图17所示。spr2、WT、G.i+spr2、G.i+WT四个样品总蛋白在15-220 kDa分子量范围内得到有效分离,条带清晰,蛋白无降解,无其它杂质,且4例样本整体蛋白条带具有相似的带型,蛋白总量足够完成后续实验。

  spr2 WT G.i+spr2 G.i+WT

  图17 SDS-PAGE电泳结果

  3.7.2质谱分析结果

  经过蛋白质检合格进行下一步质谱分析,鉴定结果及差异蛋白统计,如表2所示。在差异倍数(fold change,FC)为2的阈值条件下,进行差异蛋白筛选。FC≥2为上调(up),FC≤0.5为下调(down),0.5<FC<2认为表达量无明显变化。

  表3差异蛋白统计结果

  Peptide(肽段)Protein Group(蛋白组)300614955A versus BA specialB specialA_and_B

  commonA upA downspr2 vs WT3526363205142208spr2+G.i vs spr27923533204283170WT+G.i vs WT5995203321203207spr2+G.i vs WT+G.i5985223398238203

  表3显示,可检测到的蛋白质总数有4955个。在未接菌条件下,野生型与突变体的蛋白质表达差异的变化就以十分巨大。如二者比较,在突变体中检测到352个特有的蛋白质,而在野生型中检测到636个特有的蛋白质。在差异表达的蛋白质中,突变体与野生型相比有142个上调(FC≥2),208个下调(FC≤0.5)。其他各组之间的比较也具有类似的结果(表3)。这些结果表明,植物体内茉莉酸在蛋白质组成及表达水平上起到了广范围的调节作用,而植株的菌根化同样起到重要的调节作用。

  3.7.3 GO(gene ontology)分析

  “主要用于差异表达蛋白质的分析,包括“细胞组分(cellular component)”、“分子功能(molecular function)”和“生物学过程(biological process)”。

  3.7.3.1 spr2与WT比较

  如图18所示,在未接菌条件下,与野生型相比,突变体植株在细胞组成上有10个蛋白质上调、21个下调;在分子功能方面,上调蛋白309个,下调蛋白545个。生物过程方面共上调了143个蛋白,下调231个蛋白。表明茉莉酸参与植物的多方面调控。

  图18差异蛋白GO分析结果(spr2对比WT)

  3.7.3.2 spr2+G.i与WT+G.i比较

  如图19所示,与G.i侵染的野生型植株相比,G.i侵染的突变体在细胞组成和生物过程中的蛋白主要表现出上调,在分子功能方面,主要表现为下调,表明G.i侵染对细胞组成、分子功能以及生物过程方面具有重要的调节作用。。

  图19差异蛋白GO分析结果(spr2+G.i与WT+G.i比较)

  3.7.3.3 spr2+Gi vs spr2

  如图20所示,接菌的突变体较未接菌的突变体在细胞组成,分子功能,生物过程三个方面的调控均主要呈上调趋势,表明G.i对三种类型蛋白均起到促进作用,从而调控植株的生理活动及生长发育。

  图20差异蛋白GO分析结果(spr2+G.i对比spr2)

  3.7.3.4 WT+Gi vs WT

  Gi侵染的野生型植株在细胞组成方面蛋白质上调数为305,下调数为320;而分子功能和生物过程方面主要是通过上调来调控。

  图21差异蛋白GO分析结果(WT+G.i与WT比较)

  表4符号编码

  Table.4 Symbol coding

  编码符号英文A1biological adhesionA2biological regulationA3cell killingA4cellular component organization or biogenesisA5cellular processA6detoxificationA7developmental processA8growthA9immune system processA10localizationA11locomotionA12metabolic processA13multicellular organismal processA14multi-organism processA15reproductionA16reproductive processA17response to stimulusA18rhythmic processA19signalingA20single-organism processB1cellB2cell junctionB3cell partB4extracellular regionB5extracellular region partB6macromolecular complexB7membraneB8membrane partB9membrane-enclosed lumenB10nucleoidB11organelleB12organelle partB13supramolecular complexB14symplastC1antioxidant activityC2bindingC3catalytic activityC4electron carrier activityC5metallochaperone activityC6molecular function regulatorC7molecular transducer activityC8nucleic acid binding transcription factor activityC9nutrient reservoir activityC10protein tagC11signal transducer activityC12structural molecule activityC13transcription factor activity,protein bindingC14translation regulator activityC15transporter activity

  3.7.4 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析

  KEGG(京都基因与基因组百科全书)是非常强大的数据库。可以让计算机利用基因信息对更高层次和更复杂细胞活动和生物体行为作出计算推测。图22–25为各组之间的比较,尽管参与各个过程的蛋白质数不同,但主要过程相同,如核糖体、内质网、RNA转运、氨基酸合成、细胞内吞作用、剪接体、淀粉和糖代谢、嘌呤代谢、mRNA相关过程、苯丙氨酸途径、RNA降解、脂肪酸代谢、碳代谢、嘧啶代谢、泛素相关代谢、不饱和脂肪酸合成、氨基酸和核糖代谢、谷胱甘肽代谢、氧化磷酸化、糖酵解和糖异生等过程。

  图22差异蛋白KEGG分析(spr2与WT比较)

  图23差异蛋白KEGG分析(spr2+G.i与WT+G.i比较)

  图24差异蛋白KEGG分析(spr2+G.i与spr2比较)

  图25差异蛋白KEGG分析(WT+G.i与WT比较)

  3.7.5番茄激素信号转导路径图

  根据KEGG分析结果,我们总结了与菌根相关的一批代谢图,这里列举其中的“植物激素信号转导途径”,以野生型接菌植株与其未接菌植株(图26)和突变体接菌植株与其未接菌植株(图27)的对比为例。图中绿色标注为下调,红色标注为上调。其中生长素(AUX1)、脱落酸(PYRPYL)、乙烯(ERF1)、油菜素内酯(BSK)、细胞分裂素(AHP)、水杨酸(PR1)等相关过程涉入。

  图26植物激素信号转导途径(WT+G.i与WT比较)

  图27植物激素信号转导途径(spr2+G.i与spr2比较)

  3.8菌根真菌侵染对茉莉酸相关基因表达的影响

  本实验以接菌45 d的番茄根用于基因RT-PCR的实验材料,分离提取出总RNA,进行反转录合成第一条cDNA链,进行荧光定量PCR扩增。分析的基因及其特异引物见表5.

  表5特异引物

  脂氧合酶(LOX)基因编码的LOX酶属于双加氧家族,主要作用是催化脂质过氧化反应,丙二烯氧化合酶(AOS)是一种羟脂通道酶,也是茉莉酸合成途径的第一个酶[],对植物的生长发育至关重要。据研究表明,LOXA、LOXD、AOS1、AOS2、丙二烯氧化物合酶(AOC)以及乙烯醚合酶(DES)、12-氧代植二烯酸还原酶(OPR3)、脂肪酸过氧化水解酶(HPL)都对茉莉酸的合成具有一定的调控作用。与未接菌的WT相比,LOXA的表达量在接菌及不接菌的突变体植株均下调,表明了其与茉莉酸的合成呈正相关。接菌的野生型该基因表达轻微上调(图29)。LOXD则表现出与LOXA相反的情况,无论是接菌还是未接菌的spr2中LOXD表达均较WT高,同时,接菌的植株该基因表达水平均高于其各自未接菌的对照水平。AOS1在接菌及不接菌的spr2植株中的表达量均比WT的高,且接菌的植株该基因表达水平均高于其未接菌的水平。AOS2在接菌的突变体中表达量增加较大,相比之下,野生型在接菌的植株中表达量反而有下降趋势。AOC在spr2和WT植株中无论是接菌还是不接菌的表达情况变化都不大(图29)。

  图29五种茉莉酸合成相关基因的表达结果

  图30三种脂氧素合成相关基因的表达结果

  如图30所示,DES在未接种G.i的spr2植株表达量较高,而接菌后,发生逆转。野生型植株的情况也如此。OPR3则在不同实验处理下表达量变化不大。与WT相比较,未接菌的spr2植株HPL表达下调,而G.i侵染的植株则无明显变化。

  第四章讨论

  4.1茉莉酸介导的番茄菌根化形成的影响

  本实验分别对接菌30 d、45 d和60 d的番茄植株菌根真菌侵染情况进行了测定,并比较了野生型和茉莉酸缺失突变体的菌根真菌侵染率。结果显示,在接菌30 d时,野生型植株的菌根形成百分比达到60%以上,而突变体的形成率仅为40%。这一结果表明,在本实验条件下,接种30天时,野生型的菌根形成就达到较高的程度。在其他类似的研究中,接种30 d时菌根的形成率一般较低。这可能体现了植物种类和真菌种类的不同,也可能与具体实验条件相关。此外,我们的结果也表明茉莉酸缺失影响了菌根真菌感染初期(如30 d)的效率。然而,接种45 d后,野生型植株的菌根定殖率下降,尤其是到接菌60 d时,这体现了菌根的老化,或菌丝退化,这在其他研究中也时有发生,只不过是时间节点不同而已。然而,茉莉酸突变体在接菌45 d时菌根的定殖率仍在增加,如高于其接菌30 d时的定殖率。前人的研究也表明,茉莉酸缺失只影响菌根真菌侵染的早期,而一旦丛枝形成后,则不在有影响。

  4.2菌根真菌侵染对番茄生长指标的影响

  经本研究显示,菌根的定殖(尤其是接种45 d时)可提高寄主地上部分的生长速率,也显著增加其侧根的生长。这在许多同类研究中得以证实。菌根通过根外菌丝吸收土壤中的矿质元素,尤其是P和N,以及水分,并运输至植物的地上部分,这是促进植物生长的主要原因。

  4.3菌根真菌侵染对番茄抗氧化系统的影响

  有许多研究表明,菌根真菌定殖可提高寄主地上部分的抗氧化酶活性。在本研究中,接种菌根真菌可不同程度提高植物叶片的抗氧化酶活性。.

  4.4菌根真菌侵染对番茄蛋白质组的影响

  蛋白组学技术已被广泛用于研究植物对逆境胁迫的应答,也用于揭示植物激素对植物生长代谢和对胁迫环境的应答调节的机制。然而,用于研究菌根形成机理,尤其是茉莉酸在其中的调节机理还未见报道。在本研究中,我们与公司合作,首次研究了茉莉酸在菌根形成过程中的蛋白组学调节机理,发现有数百种蛋白质的表达水平发生显著变化,或上调或下调,这些蛋白质参与植物的十几种代谢过程,表明茉莉酸在调节植物菌根形成过程中涉及广泛的生物学过程。

  4.5菌根真菌侵染对番茄脂氧素相关基因表达的影响

  已有坚实的证据表明,脂肪酸及其代谢物在菌根形成过程中起重要的调节作用。如寄主植物中合成的脂肪酸转运至菌根真菌中,而后者是脂肪酸营养缺陷的。关于脂肪酸代谢在菌根形成中的作用研究,大多集中于被称为脂氧素类物质的代谢。脂氧素是一类起源于脂质的信号物质总称,是由多个分支途径合成的。依据第一步反应的酶类,可分为不同的途径,如著名的LOX-途径和DOX-途径[75]。不断增加的证据显示,由LOX-途径合成的脂氧素在菌根形成过程中起重要的调节作用,这主要归结于该途径产生的茉莉酸及其类似物(Wasternack C,Feussner I(2018)。依据氧化位置的不同,LOX-途径又分为13-LOX和9-LOX两条途径,如图32所示。

  图31.脂氧素途径代谢过程(改编至López-Ráez et al.2010)

  其中13-LOX途径是生物合成茉莉酸及其类似物的途径(图31)。然而,近年来,已有证据显示9-LOX途径也参与菌根形成的调节[76]。在西红柿中,脂氧合酶是由多基因家族编码的,如LOXA,LOXB和LOXE参与9-LOX途径,而LOXC,LOXD和LOXF参与13-LOX途径。在本研究中,我们分析了13-LOX途径的LOXD和9-LOX途径的LOXA的表达。结果显示接菌的野生型和突变体LOXA的表达均受抑制,而LOXD的表达被显著增强,尤其是野生型。基于9-LOX和13-LOX途径存在相互补偿机制,或制约机制,即9-LOX途径的抑制会提高13-LOX途径的表达,我们的结果预示着9-LOX途径被抑制,而13-LOX途径的表达被诱导,这进一步表明茉莉酸在菌根形成过程中起正调节作用。

  在13-LOX途径中,AOS(allene oxide synthase)催化脂氧合酶的下一步反应(如图31所示)。AOSs属于细胞色素P450家族,位于细胞的质体中。在本研究中,我们分析了AOS1和AOS2的表达。结果显示AOS1在接菌的两种基因型植株中的表达水平均上调,而AOS2在突变体的接菌植株中表达水平上调,而在野生型中下调,表明两种同工酶对菌根真菌的应答有差异。AOC(Allene oxide cyclase)是茉莉酸生物合成过程中的又一关键酶,假如该酶编码基因缺失,植物不形成茉莉酸,而是产生α-和γ-酮醇,而后者的生理作用不详。然而,在本研究中,该基因的表达水平并未受接菌的影响,具体原因有待进一步研究。

  我们也分析了DES和HPL的表达。这两个基因分别编码二乙烯基醚合成酶和脂肪酸过氧化水解酶,二者均属于细胞色素P450家族成员。作为脂氧素分支途径的关键酶,DES催化9-hydroperoxy亚麻酸形成二乙烯基醚,属于9-LOX途径。HPL的底物是13-fatty acid hydroperoxides。虽然这两种酶的催化产物生理作用仍不详,但在菌根形成过程中也有所研究。如DES在菌根化的野生型马铃薯根中的表达水平被下调,而在菌根化的西红柿根中被上调。在我们的研究中,该基因的表达水平在两种接菌基因型植株中均下调。HPL的表达在菌根化西红柿植株应答干旱胁迫中已有研究,但其表达似乎不受接菌的影响。在本研究中,HPL的表达在接菌的突变体植株中上调,而在野生型植株中没有变化。在拟南芥和西红柿植株中有三种以上的OPRs(12-OPDA还原酶),但是其中只有OPR3表现出特异的活性。因此,OPR3是茉莉酸合成的关键酶。然而,在本研究中,该酶编码基因的表达未受接菌的影响,具体原因有待进一步研究。

栏目分类