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植物学类论文 紫花苜蓿蓝光受体CRY2B过表达载体构建

2018-11-30 09:32:31来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要

  摘要:苜蓿属(Medicago)植物一般叫做苜蓿草,又可以叫做“三叶草”,是一种一年生或者多年生的开花植物。尤以作为牧草的紫花苜蓿(Medicago sativa)最为著名,可以作为良好的动物饲粮。苜蓿的原产地是在国外,但是在我国,苜蓿草已有2000多年的种植历史,是时代久远的种植牧草,广泛分布于西北地区、华北地区以及东北地区,是我国栽培面积最大的豆科牧草。苜蓿被叫做“牧草之王”,一方面产量高,草质好,另一方面具有很高的营养价值。苜蓿的秋眠性决定了苜蓿的抗寒性和生产性能,而影响苜蓿秋眠性的主要因素是短日照,即光周期效应。根据转录组测序的结果,在主要的蓝光受体隐花色2B基因和苜蓿秋眠性之间的关系的研究可以揭示苜蓿秋眠性调控机制,本试验首先克隆紫花苜蓿1级品种驯鹿隐花色素CRY2B基因的完整开放阅读框(696-2553bp),设计2对含有酶切位点的特异性引物CRY2B-F,CRY2B-R,通过多次酶切和连接,将克隆目的片段连接到植物表达载体pCAMBIA3301载体上得到重组载体pCAMBIA3301-CRY2B成功地构建了紫花苜蓿CRY2B的过表达载体,为进一步研究CRY2B调控苜蓿秋眠性分子机制奠定基础。

  关键词:苜蓿,CRY2B,秋眠性,载体构建

  1 前言

  1.1 苜蓿概述

  苜蓿属植物一般叫做苜蓿草,又可以称之为“三叶草”,是一种一年生或者多年生的开花植物。尤以作为牧草的紫花苜蓿最为著名,可以作为优良的动物饲粮。紫花苜蓿,它的本名叫:紫苜蓿,又可叫做苜蓿,它的外文名可叫做:Medicago sativa。紫花苜蓿是一种多年生草本植物, 它根比较发达,并且扎根于土壤深处,根颈发育繁盛。茎挺立并且它们聚集在一起生长,以至平卧,呈四棱形,体表没有毛或微被有柔软的毛,枝叶生长旺盛。种子呈卵形,长约1-2.5毫米,平滑,棕色或黄色。紫花苜蓿的花期为5月到7月,果期为6月到8月。原产地在小亚细亚等国外地区,在我国已经有2000多年的栽培历史了,是时代久远的种植牧草。紫花苜蓿在世界各地都有分布,还有呈半野生状态的紫花苜蓿。它们多生于路的两边、田野地头、广袤的草原、郊外河岸以及沟谷等地。欧亚大陆与世界各国都广泛种植紫花苜蓿作为饲料与牧草,因为它的营养价值很高,生产性能好。紫花苜蓿的茎叶新鲜适口,质感好,无论作为青贮饲料、青饲饲料、收割后晒制成干草、加工为草粉、还是用于配合饲料或者混合饲料,各种动物都非常喜欢食用,同样也是养猪业以及养禽业都作为首选的青饲料。

  在我国畜牧养殖行业发展的很快,已经具备很庞大的体系了。而牧草的需求量也随之上升。在需求量上而言,国内奶牛养殖行业的需求量最大,特别是对苜蓿草的需求,尤其是对紫花苜蓿的需求量最为巨大,它不仅营养价值高,生产性能好而且茎叶新鲜适口,质感好,动物都非常喜欢食用。好的牧草对奶业的生产有着很重要的影响,只有草业发展好了,才能有好的奶业生产。这样奶牛产的牛奶就有了一个很好的保证,才能有其它好的奶制品。而我们人类的健康也得到了有效的保障。在大数量的需求下呢,我们也要有品质的保证。苜蓿的生长适应能力很强,可以适应各种土地,为了让苜蓿能更好的生长发育,还是应该让苜蓿生长在沙质土壤下,且不应种植在容易积水的地方。同样要注意土壤的ph以及盐分的含量,只有适宜的条件,苜蓿才能更好的生长。播种过后,清除田间的杂草是很重要的,因为杂草的存在严重影响了苜蓿的生长发育。同时也要注意土壤水量的补充,苜蓿在生长过程中需要吸收大量的水分。对病虫害的防治也是很重要的,在苜蓿的生长发育过程中如果发现病虫害,一定要及时处理,不然的话,会影响到牧草的品质和产量。当然对药物的选择很重要,对动物的伤害要降到最低,不能让动物发生中毒现象,这是最起码的要求。苜蓿生长过后呢,那就是收割了。收割的时期一定要选择好,还有收割后留茬的高度,这都有明确的要求,不然的话会影响到苜蓿的品质。所以,我们在牧草的生产上,要进行严格的生产管理,我们要生产高品质的牧草。动物吃了高品质的牧草,才能更好更快更健康的生长,才能提供更有保障的畜产品,这样人们才能吃的更安心。

  1.2 隐花色素简述

  光是植物生长发育过程中的一个重要的环境因子,它通过光受体来影响植物生长发育的过程,而隐花色素是一类吸收蓝色光线和近紫外光线的光受体,它存在于动植物乃至于人的体内,分布很广泛。隐花色素不管是在植物体内还是在动物体内,它都有着很重要的作用。这里主要介绍的是它在植物体内的作用。它可以吸收蓝色光线与近紫外光线,通过吸收光线来调节植物的生长发育过程,影响植物的新陈代谢变化,以及植物的向光性等反应。它在蓝色光线区域和近紫外光线区域分别有三个吸收峰和一个吸收峰,其它大于500nm波长的光线对它的作用是无效的。不同的植物对蓝光效应的作用光谱表现稍有差异。

  我们对隐花色素蛋白进行序列分析可以发现,所有的隐花色素都包含有两个结构域,一个是在氨基末端与光裂合酶相似性很高的光裂合酶相关(PHR)结构域,隐花色素的光裂合酶相关结构域,它们的结构组成很相似,都含有α/β辖区、螺旋辖区和用于连接两个辖区的可变环。但是和光裂合酶相比,它并不具备DNA修复活性;此外,另一个结构域是指在隐花色素光裂合酶相关结构域后有一个羧基末端(CCT末端)的延长,而光裂合酶并不具有羧基末端延长的结构。在隐花色素之中,它们的羧基末端的基因顺序排列很少有相同的,而且不同的隐花色素之间,它们C末端的长短变化,大部分都不相同,有很大的变化。例如,在藻类植物中,它们的隐花色素含有380个氨基酸,拟南芥的CRYl含有190个氨基酸,CRY2则含有120个氨基酸,而CRY3则含有525个氨基酸,白芥的隐花色素和蕨类的隐花色素则几乎没有C末端的延长。和基因序列低相似性的C 末端区域比较,隐花色素的PHR功能域,其基因排列顺序的相似性还是比较高的。例如,在拟南芥中的CRYl、CRY2在PHR功能域的基因序列相似性有58%,但是在C末端区域仅有14%的序列相似性。隐花色素的羧基端很重要,是光作用信号的转出区域,含3个可以识别的基因序列:(1)接近隐花色素氨基末端的DQXVP基因序列;(2)在数量上有变化氨基酸残基的区域;(3)羧基末端的STAES基因序列。含有这3个基因序列的隐花色素羧基末端的延伸区域称为DAS域。拟南芥的CRY1、CRY2都具有DAS域。

  蓝光受体隐花色素家族调控植物生长发育的各个方面,例如抑制植物下胚的轴生长、影响植物子叶的伸展、调节植物开花的时间、植物向光性的弯曲、植物气孔的张开、影响植物生物钟的调节等。

  隐花色素分布很广泛,包含于整个植物范围中,双子叶植物中有存在,在单子叶植物中也有,同样在蕨类、藓类、藻类中也都有隐花色素的存在。而且大多数植物中都不是只含有一种隐花色素,而是多种。比如在拟南芥中含有CRY1和CRY2两种隐花色素基因;番茄中至少含有CRY1a、CRY1b、CRY2,3种隐花色素基因。

  1.3 CRY基因功能简述

  在拟南芥植物中,隐花色素被人们最早找到,之后在其它植物中也被发现,比如苔藓、真菌、橛类、种子植物等,并在动物体内也有发现,这表明隐花色素分布非常广泛。

  拟南芥CRY1是一种可溶性蛋白,在植物生长的依光的过程中起抑制作用,因为转基因植株拟南芥中产生CRY1的数量过多,从而阻碍了植物下胚轴的生长发育,经过转基因后产生了较矮的植株种类。因为CRY1在转基因植株中产生的数量过多,从而影响了其它基因在植株中的表达,例如CAB和CHS,但对花青素、叶绿素及类黄酮的产生,有一定的积极影响。CRY1的突变体在较少光照的条件下,对植物的开花有阻碍作用,这表现出CRY1,在植物下胚轴的伸长中起到了阻碍作用,并且参与调节了类黄酮的产生过程。经研究还发现,它也参与了植物开花的生理过程,并在这个过程中起到了关键作用。

  利用拟南芥CRY2蛋白能够溶解的特点,经实验发现这种蛋白的含量在拟南芥幼苗中比较多。CRY1的部分生长调节作用和CRY2一样。比如,CRY1在调节抑制植物下胚轴的生长以及诱导花色素苷的合成中的作用和CRY2相同。而且,根据功能分析,可以发现CRY1、CRY2的N末端区域,或者C末端区域是可以相互转换的。CRY1、CRY2不仅具有相同的作用效果,每种蛋白还有各自特异的作用。比如,CRY1,它可以阻碍植物下胚轴的生长和影响植物花青素的产生以及通过蓝光影响生物钟的调节,而调控子叶张开和影响植物开花主要是CRY2来完成的。在短光照条件下,CRY2的突变,对开花并不能产生影响,拟南芥表现正常开花,可是在长日照条件下时,拟南芥的开花时间显著落后。

  1.4隐花色素诱导的信号转导途径

  隐花色素信号转导的具体机理尚不是很明白。但是根据以往的实验结果来看,吸收光子有一定几率影响了隐花色素在植物中对信号因子的作用,既通过改变和它作用蛋白质的类型,从而导致了基因异常表达,或者其他细胞活动的变化,影响了植物的隐花色素对其所需的光照条件进行特异性反应,表现出生理上的变化。

  隐花色素是以“细胞内氧化还原”这种模式来起作用的,光子作用在隐花色素的光裂合酶相关功能域上,由此隐花色素的羧基末端被激活,而活化的羧基末端,可以将CRY的活化状态信息转导给下游因子COP1蛋白,从而引起了COP1蛋白活性被破坏,使其快速分解。于是其它转录因子就开始脱离COP1蛋白,转录因子因此而被激活,基因表达开始。对调节快速的基因表达和发育过程而言,隐花色素的这种信号转导途径是很有效的。通过实验发现,在各个种类的植物,其CRY蛋白在植物中的信号传递作用机理都是相似的。

  事实上,有许多使光信号发生转导的方式,这个过程通过很多信号因子互相作用。DET1是蓝光受体信号在传递过程中的靶蛋白,与COP1的作用相同,它们都阻碍了光形态建成的过程。DET1是通过研究,在植物细胞核内发现的一种蛋白。

  实验表明,GUS和CCT形成的融合蛋白存在于拟南芥植株中并能在无光环境下大量生成,表现出在植株体内几乎所有的细胞中持续表达的光形态建成反应。在有光或无光条件下,GUS::CCT1(CRY1C--端区域)在拟南芥植株能够表达,植株形态呈现出了下胚轴短小、子叶舒展,生理变化为花色素苷的数量变多,而GUS::CCT2(CRY2C--端区域)和它相同。研究者们认为CRY1 N-terIIlinal domain(CNT)在植物体内表现为同源二聚体的结构,在蓝光的作用下,通过CNT二聚体的改变,生色团的空间序列有了改动,导致CCT二聚体结构变动,CCT功能开始发生作用。在拟南芥植株中,GUS和功能与CNT二聚体相同,都可以与CCT形成结合蛋白从而使CCT发挥其功能。

  1.5 苜蓿的秋眠性

  紫花苜蓿(Medicago sativa)的秋眠性(Fall Dormancy)是苜蓿在秋季因日照长度变短和气温下降时所表现出的一种适应性生长特性,是栽培苜蓿选择品种时考虑的首要指标。从本质上讲,秋眠性是对日照长度的反应,短日照是其主要的影响因子[46]。苜蓿作为长日照植物,晚春及夏季长日照条件下有利于其生长发育,秋冬季短日照则休眠,说明苜蓿秋眠存在着光周期效应。

  目前,研究已发现的前三种光信号接受的光受体,即红光和远红光的受体——光敏色素(Phytochrome )、蓝光受体和紫外光受体(UV-receptor)。隐花色素(Cryptochrome)在植物中是很重要感受光的受体,光形态建成反应的必需元素,但在苜蓿的秋眠中发挥的作用机理目前还是未知。高等植物受蓝光调节的反应主要包括:向光性、抑制茎芽的生长、叶绿体的转移、刺激气孔张开和关闭,从而调节相关基因的表达。蓝光光受体——隐花色素可以调控植物开花时间以及昼夜节律循环,CRY2B(Cryptochrome2B)作为主要的蓝光受体接受和传递光信息,并且紫花苜蓿转录组高通量测序结果差异基因的统计也证明,调控苜蓿秋眠的蓝光受体CRY2B的Log2 (Fold Change)是最大的,这证明CRY2B作为重要的光受体在调控苜蓿的秋眠中发挥着至关重要的作用。

  本研究拟构建紫花苜蓿蓝光受体CRY2B过表达载体,过表达载体的构建本质上是基因重组的过程。构建紫花苜蓿蓝光受体CRY2B过表达载体是获得紫花苜蓿CRY2B转基因植株的关键步骤和基础。

  2 材料与方法

  2.1试验材料

  2.1.1植物材料

  供试的紫花苜蓿(Medicago sativa L.)品种:紫花苜蓿一级品种驯鹿,由河南农业大学牧医工程学院草业科学实验室培养提供,采集叶片后迅速放入液氮速冻后-80℃保存。

  2.1.2菌株

  大肠杆菌(Escherichia.coli)DH5α,农杆菌菌株GV3301,均由河南农业大学草业科学实验室提供。

  2.1.3载体

  克隆载体pMDl8-T(Takara).

  植物表达载体pCAMBIA3301(含有CaM 35 S启动子和Nos polyA终止子,如图1)由河河南农业大学牧医工程学院草业科学实验室提供。

  图1 pCAMBIA3301的结构图

  2.1.4 主要试剂

  表1主要试剂

  所用试剂DNA 凝胶回收试剂盒IPTG/异丙基-β-D 硫代半乳糖苷RTase M-MLV 试剂盒Marker(TaKaRa)限制性内切酶 NcolI 同尾酶 BspHIAmp/抗生素氨苄PmlIKan/卡那霉素EcorI及 T4 连接酶(NEB)Rif/利福平(Sigma)Taq DNA 聚合酶X-gal /5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(TaKaRa)质粒抽提纯化试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)

  其他化学试剂均为国产分析纯试剂。

  2.1.5 仪器设备

  表2仪器设备

  所用设备MJX 智能型培养箱(宁波莱福)电子分析天平(梅特勒-托利多)MODEL-B100S 颗粒制冰机(太仓)-80℃超低温冰箱(Thermo)常规 PCR 仪(Applied Biosystems)4℃速台式离心机(Thermo)紫外分析仪(NanoDrop 2000)高压锅(上海申安)电泳凝胶成像分析系统(Syngene)烘箱(天津华北)电泳仪(北京六一仪器厂)恒温培养摇床(上海智城)无菌超净工作台(苏州安泰)气浴恒温摇床(江苏金坛荣华)移液抢(德国 eppendorf,1ml、200ul、10ul 等)

  2.2试验方法

  2.2.1 抗生素、培养基的配制

  注意:配制溶液后需要使用 0.22um 滤膜过滤除菌,小份分装于 1.5mL 离心管中,标记名称、浓度、日期,用封口膜封好。

  如下表

  表3抗生素、培养基的配制

  (1)Kan 溶液(卡那霉素 50mg/mL,使用浓度为 100 mg/L)

  称取 Kan 0.25g 加入 4mL 无菌水,充分混合溶解后定容至 5mL,浓度为 50mg/mL 的母液,小份分装,-20℃冰箱中备用。

  (2)Carb 溶液(羧苄青霉素 200 mg/mL,使用浓度为 300-400 mg/L)

  称取 Carb 1g 加入 4mL 无菌水,充分混合溶解定容至 5mL,浓度为 200mg/mL 的母液,小份分装,-20℃冰箱中备用。

  (3)Amp 溶液(氨苄青霉素 50 mg/mL,使用浓度为 100 mg/L)

  称取 Amp 0.25g 加入 4mL 无菌水,充分混合溶解定容至 5mL,浓度为 200mg/mL 的母液,小份分装,-20℃冰箱中备用。

  (4)Rif 溶液(利福平 25 mg/mL, 使用浓度为 25 mg/L)

  称取 0.125gRif,用 DMSO(二甲基亚砜)溶解,定容 5mL, 浓度为 25mg/mL 的母液,小份分装,-20℃冰箱中备用。

  (5)X-gal(使用浓度 20ul/20ml 平板)

  2%母液(用铝箔或黑纸包住,以防止受光照被破坏),-20℃保存备用。

  (6)IPTG(使用浓度 40ul/20ml 平板)

  母液的浓度为 100mmol/L,-20℃冰箱保存。

  (7)LB 培养基、YEB 培养基

  LB 液体培养基中不用添加琼脂(固体培养基加琼脂),将配好的 LB 固体培养基高压灭菌后冷却至不烫手即可,加入 Amp 抗生素溶液,终浓度为 100ug/ml,摇匀后铺板(Amp 的 LB 固体培养基)。

  

  LB 培养基 高压灭菌 30 分钟

  胰蛋白胨 10g/L

  酵母膏 5g/ L

  NaCl 10g/ L

  PH=7.0

  固体加琼脂粉 15g/ LYEB 培养基: 高压灭菌 30min

  蛋白胨 5g/ L

  酵母膏 1g/ L

  MgSO4·7H2O 4g/ L

  牛肉膏 5g/ L

  蔗糖 5g/ L

  PH=7.4

  固体加琼脂粉 15g/ L

  2.2.2 CRY2B基因引物设计

  利用Primer Premier 5设计引物,并送上海生物工程有限公司合成。

  AATCTGAAAATAGGTATGAATAGGACCATAGTTTGGTTTAGGAGGGACCTAAGAA

  TTGAGGACAA………TACCATAACAATGTTCCTCTCCTCTTCTACTAATATAAAGTTGTCATGGTAAGAACATAG(加粗部分划线为起始密码子和终止密码子)。

  此基因序列编码区696-2498(基因过表达要求引物设计的长度必须包含完整的开放阅读框,CRY2B完整的开放阅读框696-2498),设计引物要包含此阅读框,选择过表达载体上NcolI、PmlI为酶切位点,设计带酶切位点的引物(696-2553),划线部分为限制性酶切位点,为保证酶切质量,酶切位点前面为保护碱基,如下表1。

  表4 基因引物序列

  引物名称碱基序列CRY2B-F(696)CGCTCATGAATAGGACCATAGTTTGCRY2B-R(2553)GCGCACGTGGAACTATGTTCTTACCATG选择过表达载体上NcolI、PmlI双酶切的酶切位点(载体上没有BspHI酶切位点),NcolI酶切(A/CATGT),为了使氨基酸翻译正确,CRY2B引物添加NcolI酶切位点时要使用同尾酶BspHI(T/CATGA)。使用同尾酶可产生相同的粘性末端。

  PCR反应体系如下:

  表5 PCR反应体系

  组成成分体积2*Taq premix10uL上游引物primer(10um)0.4uL下游引物primer(10um)0.4uL模板cDNA1uLDEPC水无酶水8.2uLTotal总体积20uL2.2.3 CRY2B基因克隆与测序

  PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的片段,进行PMD18-T克隆转化,菌液PCR检测为阳性后送上海生工测序。测序结果在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行比对,CRY2B克隆成功。用质粒提取试剂盒提取质粒,保存并命名为PMD18-T-CRY2B。

  2.2.4 纯化回收的产物与PMD-18T载体的连接

  采用北京百泰克生物技术有限公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收,严格按照回收试剂盒的操作步骤进行,回收到的产物置于-20℃冰箱中保存备用。

  纯化回收产物CRY2BPMD-18T载体连接前,使用BspHI/PmlI内切酶,分别双酶切CRY2B目的片段和植物表达载体pCAMBIA3301,为提高CRY2B和pCAMBIA3301载体两个目的片段的酶切效率和准确性,先将目的片段与PMD-18T载体连接,增加CRY2B目的片段的拷贝数。

  目的片段与载体连接体系如下:

  表6 目的片段与载体连接体系

  试剂体积PMD-18T载体0.5uL模板CRY2B9.5uLsolution 1连接反应液10uLTotal总体积20uL16℃孵育过夜。

  DH5α感受态细胞转化,用于扩繁、培养,进行PCR鉴定。

  2.2.5 提取阳性克隆DNA质粒

  利用百泰克公司小量质粒提取试剂盒提取,严格按照提取质粒试剂盒的操作步骤进行:

  接 1%含质粒的大肠杆菌细胞于 2ml LB 培养基。

  37℃振荡培养过夜。

  取 1.5ml 菌体于 Ep 管,以 4000rpm 离心 3min,弃上清液(重复上述步骤,最后收集足够多的菌体,尽可能的倒干上清)。

  加 0.lml 溶液 I(1%葡萄糖,50mM/L EDTA pH8.0,25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合(注:如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低)。

  加入 0.2ml 溶液 II(0.2 mM/L NaOH,1% SDS),轻轻翻转混匀(温和地混合,不要剧烈震荡,以免基因组 DNA 剪切断裂,不超过 5min,以免质粒受到破坏),置于冰浴 5 min 。

  加入 0.15m1 预冷溶液 III(5 mol/L KAc,pH4.8),轻轻翻转混匀,置于冰浴 5 min。

  再以 10,000rpm 离心 20min,弃上清。

  用 70%乙醇 0.5ml 洗涤一次,室温放置 3-5min,除去残留乙醇 。

  待沉淀干燥后,溶于 0.05mlTE 缓冲液中(洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要质粒浓度较高,可以适当减少洗脱体积)

  2.2.6 含有T载体的CRY2B片段质粒与pCAMBIA3301质粒双酶切

  双酶切反应体系:

  CRY2B-T载体pCAMBIA3301CutSmart Buffer2uL2uLCutSmart Buffer----DNA质粒10uL10uL100×BSA0.2uL0.2uLBspHI2uL2uLPml11uL1uLddH2O4.8uL4.8uLtotal20uL20uL操作步骤在冰上进行,反应液混匀后37℃酶切反应1h。

  1%的琼脂糖凝胶电泳,电泳观测酶切效果,酶切正确的目的片段切胶纯化回收目的片段,回收DNA片段以备连接反应。

  2.2.7 连接反应

  将纯化回收酶切后的CRY2B目的片段连接到酶切后的pCAMBIA3301上,连接反应目的片段与载体的浓度摩尔比例为1:6-10,反应体系:

  试剂体积10×buffer缓冲液2.5uLCRY2B目的片段0.3pmpCAMBIA3301载体0.03pmNEB T4连接酶2uL补ddH2O至总体积25uL

  2.2.8 连接产物转化及鉴定

  pCAMBIA3301载体与CRY2B目的片段连接产物转化操作同上述DH5α感受态细胞转化步骤, 由于载体pCAMBIA3301含有Kan、Amp的特性,所以配制含有Kan、Amp的特性的LB培养基,转化后对含有目的片段菌液进行PCR检测。PCR检测为阳性克隆的菌液进行测序并提取质粒长期保存,然后进行酶切检测。

  2.2.9 酶切检测

  由于CRY2B基因上游添加的酶切位点是NcolI的同尾酶BspHI,因此重新整合的重组质粒不能用原来的酶切位点NcolI或PmlI去进行酶切鉴定,利用generunner分析可知CRY2B基因片段上含有和pCAMBIA3301载体上相同的酶切位点EcoR1,此酶切位点不在pCAMBIA3301载体的表达区。利用EcorI进行酶切,经琼脂糖凝胶电泳,如果能得到两个10000bp大小和2000bp大小的片段,则说明目的片段pCAMBIA3301-CRY2B重组质粒构建成功,如果没有得到两个片段,质粒重组不成功。

  3结果与分析

  3.1 CRY2B克隆PCR扩增效果

  根据克隆的基因以及所需的酶切位点设计引物,进行PCR扩增,用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图2所示,目的片段条带清晰明亮,可进行目的片段纯化回收。

  M 1 2

  图2 CRY2B PCR 扩增

  Fig. 2 CRY2B PCR amplification

  M: DNA分子量标记;1-2: CRY2B

  M: DNA ladder; 1-2: CRY2B

  3.2 pCAMBIA3301载体与CRY2B目的片段连接的菌液PCR检测

  将纯化回收酶切后的CRY2B目的片段连接到酶切后的pCAMBIA3301连接产物转化到DH5α大肠杆菌过夜培养。根据克隆的CRY2B基因以及所需的酶切位点所设计的引物,以菌液为模板,进行PCR扩增检测。扩增出图3清晰明亮的目的片段,说明目的片段已经成功连接到pCAMBIA3301载体上可以测序鉴定与酶切反应。

  M 1 2

  图3 CRY2B 菌液PCR 扩增

  Fig. 3 CRY2B microbial PCR amplification

  M: DNA分子量标记;1-2: CRY2B

  M: DNA ladder; 1-6: CRY2B

  3.3pCAMBIA3301载体与CRY2B目的片段连接产物的酶切效果与分析

  pCAMBIA3301载体与CRY2B目的片段连接产物转化操作同上述DH5α感受态细胞转化步骤, 由于载体pCAMBIA3301含有Kan、Amp的特性,所以配制含有Kan、Amp的特性的LB培养基,转化后对含有目的片段菌液进行PCR检测,检测为阳性克隆的菌液,然后进行EcoRI酶切鉴定检测。酶切出现两个条带(10000bp大小和2000bp大小的片段),如图4。

  M 1

  图4 pCAMBIA3301- CRY2B大肠杆菌质粒酶切鉴定

  1: pCAMBIA3301-CRY2B 酶切;M: DNA 分子量标记;

  1-2 pCAMBIA3301- CRY2B restriction enzyme analysis; M: DNA ladder

  对酶切鉴定出现正确片段的菌液送往生工生物公司测序,并提取阳性克隆菌液质粒保存,操作步骤如上所述,测序结果和目的片段序列一致,如下图5,表明pCAMBIA3301-CRY2B重组质粒构建成功。

  图5 克隆片段与CRY2B基因的片段序列的比对

  3.4 重组质粒PCR检测

  将重组质粒pCAMBIA3301-CRY2B导入农杆菌GV3101感受态细胞,在含有50mg/L Kan + 50mg/L rif的YEB培养基上涂板,28℃培养48小时。以菌液为模板,进行PCR扩增,阳性菌落的PCR琼脂糖凝胶电泳图如图6。挑选的单菌落都为阳性菌落,表明植物表达载体pCAMBIA3301-CRY2B已转化进农杆菌GV3101中,可用于后期紫花苜蓿的遗传转化。

  图6 pCAMBIA3301- CRY2B质粒PCR扩增

  1-12CAMBIA3301-CRY2B PCR扩增;M: DNA 分子量标记;

  1-12CAMBIA3301- CRY2B PCR amplification; M: DNA ladder

  3.5酶切鉴定重组质粒

  利用上述菌液提取质粒进行酶切,pCAMBIA3301-CRY2B利用EcoRI酶切鉴定结果如图7所示,酶切出两条正确的基因片段。

  M 1 2

  图7 pCAMBIA3301- CRY2B农杆菌质粒酶切鉴定

  1: pCAMBIA3301-CRY2B 酶切;M: DNA 分子量标记;

  1-2 pCAMBIA3301- CRY2B restriction enzyme analysis; M: DNA ladder

  4讨论

  在转录水平,CRY2B 在光信号转导途径苜蓿秋眠的调控中发挥着关键的作用,而 PHYA、PHYB的作用发生在转录之前,作为光信号的传递因子,在转录水平上通过其下游调控元件参与生物节律循环。PHYA、PHYB 在转录之前参与了对苜蓿秋眠的调控,而 CRY2B 在转录水平参与了苜蓿秋眠的调控。对拟南芥的研究发现,隐花色素和光敏色素具有拮抗和互补的作用。植物中的许多生理和生化反应都表现出对一天24小时的昼夜节律(circadian rhythm)现象,这些昼夜节律循环调节的现象类似于生物钟。在光的形态建成的研究中,光敏色素是主要的红光和远红光光受体,植物通过叶片中的光敏色素来感受和测量日照长短,光敏色素A(Phytochrome A,A) PHYA,和光敏色素B(Phytochrome B,B) PHYB是两种最主要的光敏色素(远红光和红光受体),也是在正常光照条件下功能最突出的两种光敏色素基因,拟南芥研究发现现有的5种不同的光敏色素基因。日照长度的变化导致光受体基因表达量发生变化,进而调控了植物的开花和休眠,光受体基因通过光周期也参与了对苜蓿秋眠的调控。蓝光光受体——隐花色素可以调控植物开花时间以及昼夜节律循环,并且参与对光周期的调控。

  在构建过表达载体和转化苜蓿植株的过程中,需要注意:

  a) 在构建载体时,酶切位点的选择和同尾酶的选择;

  本试验通过在CRY2B基因的引物两端加入NcolⅠ的同尾酶BsphⅠ和PmlⅠ位 点。注:重新整合的重组质粒不能用原来的酶切位点 NcolI 或 PmlI 去进行酶切鉴定,利用 generunner 分析可知 CRY2B 基因片段上含有和 pCAMBIA3301 载体上相同的酶切位点 EcoR1,此酶切位点不在 pCAMBIA3301 载体的表达区。

  b) 在构建载体过程中,要注意目的片段和载体在连接时的浓度和比例。

  5 结论

  本试验通过在CRY2B基因的引物两端加入NcolI的同尾酶BspHI和PmlI位点,以提取的苜蓿RNA为模板PCR扩增得到CRY2B基因片段。然后将目的片段CRY2B和过表达载体pCAMBIA3301经过双酶切,利用NEB公司T4连接酶分别将酶切后基因片段与酶切后pCAMBIA3301质粒整合到一起,构建pCAMBIA3301-CRY2B重组质粒,然后经过PCR检测、碱基序列测序和酶切鉴定确定成功构建了pCAMBIA3301-CRY2B过表达载体,植物表达载体pCAMBIA3301-CRY2B已转化进农杆菌GV3101中,可用于后期转基因紫花苜蓿的遗传转化。

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