周一至周五 | 9:00—22:00

期刊论文网 > 医学论文 > 肿瘤学论文 > 乳腺癌论文 溶血磷脂酸受体6在乳腺癌的表达与调控及对预后的影响

乳腺癌论文 溶血磷脂酸受体6在乳腺癌的表达与调控及对预后的影响

2018-12-19 14:05:21来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要

  目的:溶血磷脂酸受体6(Lysophosphatidic acid receptor6,LPAR6)是溶血磷脂酸(LPA)的新发现受体,近期的一些研究提示LPAR6可能参与到一些肿瘤的生物学行为过程中。此外,来自Oncomine和Gene Expression Omnibus(GEO)数据库的数据表明乳腺癌(Breast cancer,BC)组织中LPAR6的表达相对于正常组织表达显著降低,然而LPAR6的功能和机制在乳腺癌却未见报道。因此,本研究的目的在于评估LPAR6在乳腺癌患者中的表达水平,并进一步探讨LPAR6表达调控的潜在机制,最后分析LPAR6的表达与患者预后的关系。

  方法:我们总共收集98对新鲜冷冻的临床乳腺癌标本和配对的癌旁组织,使用液氮进行保存,供随后RNA提取。同时,使用人乳腺癌细胞系进行体外实验。使用定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)以及蛋白免疫印迹技术(Western Blotting,WB)来评估LPAR6在临床标本和BC细胞系的表达水平,并且使用数据库的数据再次验证。我们进一步分析LPAR6表达与乳腺癌病理分子分型等参数的关系,同时使用Kaplan-Meier曲线对数据库中差异表达LPAR6的乳腺癌患者进行生存分析。此外,我们分析LPAR6在乳腺癌中可能受甲基化调控。因此,我们使用特异性去甲基化药物地西他滨对细胞系进行干预,检验其中LPAR6的表达是否上调。

  结果:与癌旁组织相比,癌组织中LPAR6的表达显著降低(p <0.0001),这一结果与我们对数据库的分析结果相符合。而且高表达的LPAR6水平,预示患者获得更好的预后(p <0.0001)。通过分析临床病理数据与LPAR6表达的关系,我们发现LPAR6表达水平与乳腺癌分子分型(p <0.05)和组织学分级(p <0.05)有相关性。不仅如此,相对于在癌旁组织的甲基化水平,LPAR6基因的启动子区域在癌组织中呈相对高甲基化状态(p <0.05),去甲基化药物5-Aza能够在体外显著上调LPAR6表达水平。

  结论: 在乳腺癌中,LPAR6受超甲基化调控而表达水平显著降低,且LPAR6的低表达可能与预后不良有关。

  关键词:乳腺癌,LPAR6,预后,甲基化,地西他滨

  前言

  最新的癌症统计数据表明,乳腺癌(Breast cancer,BC)占所有新诊断肿瘤的30%,位列女性癌症死亡的第二位[1]。在对BC的诊疗过程中,早期诊断意味着我们可以给予及时有效的治疗,而患者由此也可以获得更好的预后;所以,用于BC诊断的敏感且有效的生物学标记一直以来是科学工作者们研究的重要方向。

  溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid,LPA)是一种脂质,通过其受体(Lysophosphatidic acid receptors,LPARs)参与肿瘤的多种生物学行为。溶血酸受体6(Lysophosphatidic acid receptor 6,LPAR6)是最近发现的LPA的G蛋白偶联受体,据现有报道它与许多肿瘤有关。然而在乳腺癌相关的研究中,尚未有研究讨论LPAR6的表达及功能。分析已有的这些研究,LPAR6的功能因肿瘤类型而异,促进或是抑制肿瘤的发生与发展尚未有定论。多个数据库(Oncomine、Gene Expression Omnibus(GEO))的对比分析表明,LPAR6在BC的组织中呈低表达水平。而这些数据来源于世界各地的基因芯片分析结果,批量配对的临床组织中LPAR6的表达还未得到验证,其在BC中的作用也尚不清楚。

  基因表达的调控是研究肿瘤发生和发展重要的环节,越来越多的研究发现抑癌基因的低表达与其DNA序列上特定区域(如启动子区)的超甲基化相关。在表观遗传学调控的水平探索对肿瘤的治疗,基本原理是使用药物解除抑癌基因的甲基化,从而发挥其相应抗癌作用,这逐渐成为近些年来的研究热门 。地西他滨,也被称为5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza),是一种DNA甲基转移酶的抑制剂,可以用来上调受超甲基化影响的基因。2004年,美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)认可地西他滨在骨髓增生综合征(Myelodysplastic Syndrome,MDS)的治疗价值;此后,大量的研究证实5-Aza不仅仅在MDS的治疗中有效,更是一类广谱抗癌药物。

  在本研究中,我们检测了LPAR6在癌和癌旁组织中的表达水平,然后结合数据库结果,分析了其与病理分子分型的关系,明确其诊断价值;分析生存来判断预后方面的价值。此外,我们分析发现LPAR6在BC中表现为先对高甲基化状态;而去甲基化药物(5-Aza)的干预可以使乳腺癌细胞系中LPAR6的表达显著上调。

  1 材料

  1.1 主要试剂和耗材

  试剂名称公司名称Trizol reagentLife Technologies, Thermo Fisher Scientific(美国沃尔瑟姆)氯仿成都市科龙化工试剂厂(中国成都)异丙醇成都市科龙化工试剂厂(中国成都)二甲苯成都市科龙化工试剂厂(中国成都)乙醇成都市科龙化工试剂厂(中国成都)甲醇成都市科龙化工试剂厂(中国成都)乙酸成都市科龙化工试剂厂(中国成都)TAEBeyotime(中国上海)AgaroseBiowest(法国卢瓦尔谷)PrimeScriptTM ⅡcDNA Synthesis KitTakara Bio Inc(中国大连)GoldviewBioteke(中国北京)SYBR Premix Ex TaqTM ⅡTakara Bio Inc(中国大连)RIPALife Technologies, Thermo Fisher Scientific(美国沃尔瑟姆)BCA Protein Assay KitBio-Rad Laboratories(美国伯克利)兔抗人二抗Proteintech Group(中国武汉)PMSFThermo Fisher Scientific(美国沃尔瑟姆)DMEMGibco, Thermo Fisher Scientific(美国沃尔瑟姆)DMSOThermo Fisher Scientific(美国沃尔瑟姆)Bovine Calf Serum Gibco, Thermo Fisher Scientific(美国沃尔瑟姆)0.25% Trypsin-EDTAGibco, Thermo Fisher Scientific(美国沃尔瑟姆)DEPC-Treated water生工生物工程(中国上海)5-AzaSigma-Aldrich Co(美国圣路易斯)LPAR6抗体Abgent(中国苏州)GAPDH抗体Proteintech Group(中国武汉)

  1.2 主要设备名称

  设备名称公司名称-80℃超低温冰箱Thermo Fisher Scientific(美国沃尔瑟姆)-20℃低温冰箱中科美菱公司(中国合肥)超纯水生产系统(ELIX)Millipore Inc(美国麻省)全自动高压灭菌锅Sanyo Inc(日本大阪)全自动制冰机Sanyo Inc(日本大阪)2100振荡器Agilent(中国北京)磁力搅拌器其林贝尔(中国江苏)低速离心机Backman Coulter(美国加州)低温高速离心机Backman Coulter(美国加州)CFX-96 Real time PCR仪Bio-Rad Laboratories(美国伯克利)电泳仪Bio-Rad Laboratories(美国伯克利)电子天平Thermo Fisher Scientific(美国沃尔瑟姆)分析天平Thermo Fisher Scientific(美国沃尔瑟姆)摇床其林贝尔(中国江苏)PCR仪Bio-Rad Laboratories(美国伯克利)电磁炉中国美的有限公司(中国重庆)光学显微镜Nikon Inc(日本东京)恒温水域箱宁波新芝圣物科技公司(中国浙江)酶标仪TECAN(中国上海)Nanodrop 2000Thermo Fisher Scientific(美国沃尔瑟姆)凝胶成像仪Bio-Rad Laboratories(美国伯克利)超净工作台Thermo Fisher Scientific(美国沃尔瑟姆)细胞培养箱Thermo Fisher Scientific(美国沃尔瑟姆)凝胶电泳仪Bio-Rad Laboratories(美国伯克利)电泳槽Bio-Rad Laboratories(美国伯克利)电转槽Bio-Rad Laboratories(美国伯克利)电动匀浆器易扩仪器有限公司(中国上海)加样枪Eppendorf公司(德国汉堡)

  1.3 引物的设计

  引物序列LPAR6 forward5’-TTT GCA CTG GCG TGT GGT T-3’reverse5’-TCT GAG GCA TTG TTA CCC TGA-3’GAPDH forward5’-TTC CAG GAG CGA GAT CCC T-3’ reverse5’-GGC TGT TGT CAT ACC TTC TCA TGG-3’

  1.4 病例入组及临床标本的收集

  重庆医科大学第一附属医院是我们标本采集地点,我们共收集了98对BC临床标本。所有病人均提前告知并嘱签署知情同意书。肿瘤组织和配对的正常乳腺组织(即癌旁组织)采集后转移到液氮中进行保存(15分钟内),以防止RNA的降解。术后,病例的临床数据和病理检测报告也同时进行收集汇总。本研究严格依照《Declaration of Helsinki》的原则进行,并经由重庆医科大学第一附属医院伦理委员会(第2017-16号)讨论并获得批准。

  1.5 人乳腺癌细胞系

  实验使用的人乳腺癌细胞株包括:Luminal A型细胞株MCF7、T47D以及ZR-75-1,Basal-like型细胞株BT549、MB468、MB231和MCF10A,HER2型细胞株SK-BR-3。

  2 方法

  2.1 RNA提取(RNA extraction)

  Ⅰ.临床肿瘤组织及癌旁组织

  (1)取约100mg的组织,添加液氮于研钵中碾碎(注意不让液氮挥发,必要时可以补充液氮),倒入无酶灭菌EP管中,立即加入1ml Trizol试剂,再以电动匀浆器碾磨均匀,室温静置10min(或者使用摇床)。

  (2)向静置后的EP管中加入0.2ml氯仿,剧烈震荡15s,室温静置3min,然后使用低温高速离心机,设置4℃ 12000rpm参数,离心15min。小心转移离心后的上清(水相层)至新标记好的EP管。

  (3)向转移上清后的EP管中加入50ul的异丙醇,颠倒混匀8-10次;室温静置10min,使用高速离心机,设置参数4℃ 12000rpm,离心10min。

  (4)吸掉EP管内上清液,并且弃置。保留底层半透明白色的RNA沉淀;向EP管中加入1ml 75%的乙醇(现用现配),充分冲洗沉淀。使用高速离心机,参数4℃ 12000rpm,离心5min。去除上清液。

  (5)重复上述过程一次。

  (6)室温干燥RNA沉淀,3-5min。

  (7)向已经干燥的EP管内加入适量的无酶水,用加样枪反复吹打,再悬浮溶解RNA;可以使用55-60℃水浴加快溶解。带溶解完全后,保存于-80℃超低温冰箱或者液氮中。

  Ⅱ.人乳腺癌细胞(贴壁细胞)

  (1)对需要提取RNA的细胞,可以有两种处理方式:

  a.吸弃培养液,用1xPBS轻柔冲洗,直接按照Trizol 1ml/6cm dish的比例向培养皿中(或者培养瓶)加入裂解液,使用细胞刮板将细胞完整刮离生长面,室温静置10min;

  b.将贴壁生长的细胞使用胰酶进行消化,再使用1xPBS洗涤后,向EP管加入1ml Trizol裂解液,吹打均匀后,室温静置10min。

  (2)-(7)同组织RNA提取。

  2.2 逆转录(Reverse transcription)

  (1)RNA浓度测定:对2.1步骤经充分溶解的RNA使用分光光度计Narodrop 2000仪进行测定;注意仪器使用前,对其进行探头洗涤,调零等准备工作;测定后的RNA浓度记录在EP管上,做好清晰的标注。

  (2)去除基因组DNA:根据操作说明,因实验使用SYBR Green qRTPCR法进行后续实验,这里反转录按照1ug的总RNA量进行计算,按照下表进行:

  试剂使用量5×gDNA Eraser Buffer2.0 ulgDNA Eraser 1.0 ulTotal RNA1000ng/conc.RNase Free dH20Up to 10 ul→42℃ 2min(PCR仪上设定)

  (3)逆转录反应:反应的混合液在应该冰上进行配置,配置Mix的时候,按照反应数目+1或者更多额的量进行配置,以避免加样误差而耽误后续。然后再分装10 ul到每个反应管中。混匀后,再进行逆转录反应。逆转录反应Mix的配置如下表所示(SYBR Green qRTPCR法):

  试剂使用量步骤2中的反应液10.0 ulPrimeScript RT Enzyme MixⅡ1.0 ulRT Primer Mix1.0 ul5×PrimerScript Buffer4.0 ulRNase Free dH204.0 ulTotal20 ul→37℃ 15min,85℃ 5sec

  (4)所得的产物即为cDNA,可保存于-20℃条件。

  2.3 实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR)

  (1)按照下表,使用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂进行RTPCR反应液的配置(10ul反应体系,对操作要求更加精准):

  试剂使用量Forward Primer(10uM)0.4 ulReverse Primer(10uM)0.4 ulSYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ5.0 ulcDNA(步骤2.2获得,约为100ng/ul)2.0 ulRNase Free dH202.2 ulTotal10 ul注意:反应液的配置和加样均在冰上进行操作。

  (2)一般反应为:a.目的片段/产物的扩增,荧光的检测;反应按照(95℃ 10min,95℃ 15s,60℃ 60s)×40循环;b.溶解曲线:一般将(95℃ 15s,58~60℃ 60s,95℃ 15s,60℃ 15s)设定仪器。

  (3)实际需要根据2.4的标准曲线测定后,确定反应。

  2.4 qRTPCR引物标准曲线测定(Determination of primer standard curve)

  (1)针对目的基因或靶标的每一对引物都必须制作标准曲线,明确引物的扩增效率,方能进行后续的数据分析与比较。

  (2)标准曲线的检验要求:a.扩增效率在±100%;b.R2≥0.989。

  (3)按照2.2的实验步骤进行cDNA的获取。

  (4)明确反应体系,10ul或者20ul或者50ul体系。实验中一般使用20ul体系进行反应。

  (5)建立梯度稀释模板:一般设立8个梯度,取8个EP管,标记1-8,第1管为cDNA原液,其余2-7管中分别加入45ul无酶水(同时避免酒精等干扰PCR反应的物质污染),从第1管中吸取5ul原液加入管2,充分混匀;再从管2中吸取5ul加入管3,以此类推。这样我们建立了浓度10倍比稀释的梯度模板。

  (6)进行qRTPCR反应,注意仪器的参数设定,选择Standard curve进行分组,每组3个副孔,注意设立NTC组。

  (7)分析标准曲线结果;可能因为Tm值的反复设定,需要多次重复,或者根据最后结果可能需要更换引物。

  2.5 琼脂糖凝胶电泳(Agarose gel electrophoresis)

  (1)根据实际需要选择配置不同大小的凝胶,一般按照20ml(8孔)1xTAE和0.2g琼脂糖,或者40ml 1xTAE加入0.4g琼脂糖;加入锥形瓶,微波炉加热,1min30s高热,冷却至60℃。

  (2)加入2ul的核酸染料Goldview,轻轻摇匀,注意避免产生气泡

  (3)倒胶,插入合适的齿梳,等待胶凝固,约20min,夏天可以适当延长。

  (4)加入10ulDNA或者RNA与10xLoading Buffer混合均匀,拔出齿梳,并且将凝胶移至电泳槽,注意对齐。

  (5)加样,电泳;注意电泳液(1x TEA)应该覆盖凝胶。

  (6)120v电泳20min,注意过程中观察loading buffer的位置,至胶的3/4的位置停止电泳。

  2.6蛋白质免疫印迹技术(Western Blotting)

  (1)提取细胞总蛋白:实验使用贴壁生长的乳腺癌细胞,对欲提取的细胞进行上层培养基吸弃,用1x PBS漂洗一次,吸弃PBS,加入含蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA缓冲液(3cm dish加入200ul),冰上充分混匀后,置于4℃冰箱静止10min充分裂解组织,使用超声裂解仪对细胞进行裂解。预冷高速冷冻离心机,4℃,12000rpm,离心20min,取上清液。用BCA试剂盒测定蛋白浓度,按比例加入蛋白上样缓冲液和裂解液配平各组间蛋白浓度,100℃沸水煮沸变性5min,冷却后分装,负80℃储存。

  (2)电泳:配制10%的下层分离胶和5%的上层堆积胶,浸泡在电泳液中,4℃过夜备用。取50ng/孔蛋白样品上样,60V电压电泳,待出现maker红线出现后调电压至120V,直至蛋白条带分离,远端蛋白条带距凝胶下层1cm,停止电泳。

  (3)电转:恒压100V电转15min至1h,至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭2h。

  (4)孵育一抗:分别加入相应一抗anti-LPAR6(1:1000),anti-GAPDH(1:2000),4℃孵育过夜。

  (5)孵育二抗:第二日TBST漂洗3次,每次10min。加入相对应二抗(兔抗人二抗,1:5000)。37℃孵育2h, 漂洗3次,每次10min。

  (6)显影:采用超敏ECL显影试剂盒和Fusion凝胶成像系统成像。分析灰度值。

  2.7 细胞复苏、培养、传代培养、冻存(Cell recovery, culture, subculture, frozen storage)

  (1)细胞复苏:①取出冻存的一管或几管(注意如一次复苏的细胞不要太多,防止细胞因缺氧而出现生张抑制)细胞置于冰盒内,迅速转移至37℃水浴中溶解至完全溶解;②吸取冻存管内的细胞悬液至离心管,800rpm 4min低俗离心;③弃上清,用10%培养基重悬;④将重悬的细胞转入已加入培养基的6cm培养皿中,轻柔吹打混匀;⑤将所有需要转入培养箱的细胞株转入培养箱中,以细胞生长正常条件进行培养。

  (2)细胞传代培养:①显微镜下观察细胞形态、生长密度,肉眼观察培养基的颜色,确定是否需要对其进行细胞传代,及传代的稀释倍数;②吸弃上层培养基(贴壁细胞),加入2ml 1x PBS清洗1至2次,加入适量体积的胰酶消化液(覆盖所有细胞即可);③室温或浮箱内孵育1-3min(细胞不同,黏附能力不同,消化时间也存在差异;注意,在不清楚细胞特点的时候必须要小心谨慎,消化过程中密切观察消化程度);当细胞出现形态变圆,轻轻拍打可以脱落时,终止消化过程;④加入消化液等量的新鲜培养基终止消化反应,轻柔吹打细胞使细胞完全脱落,转至EP管,800rpm离心5min;⑤弃上清液,加入适量(一般1ml)的新鲜培养基,轻柔吹打,混匀,避免气泡的产生;⑥将细胞按照预估比例分至培养皿或者培养瓶中进行传代培养(预先加入适当新鲜培养基),最后转入培养箱中按照正常细胞培养条件培养。

  (3)细胞冻存:①冻存前一天对细胞进行换液处理,注意无菌操作,且细胞生长处在对数期,密度大约70至80%;②配置细胞冻存液:90%的胎牛血清+10%DMSO按照冻存细胞数量进行提前配置;③按照不同细胞消化时间的差异,应用消化操作对细胞进行消化处理;④离心后弃上清,加入1ml的细胞冻存液,轻柔混合均匀,再分入已标记好的细胞冻存管中;⑤放入冻存盒(没有则使用半小时梯度降温的办法),转至-80℃超低温冰箱。

  2.8 细胞药物干预(Drug intervention)

  挑选在对数生长阶段的细胞进行消化,并将其传代培养至6孔板,每个孔约为1万个细胞。按照已报道的方法,使用终浓度为10μM的5-Aza对细胞干预4天的时间。在药物干预后,收集细胞用于进一步的RNA和蛋白质提取。

  2.9 数据库分析(Database Analysis)

  Oncomine databases数据库(https://www.oncomine.org/)[16]和Gene Expression Omnibus databases 数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)用于分析基因芯片数据结果中的LPAR6表达差异。Kaplan-Meier曲线在线绘制(http://kmplot.com/analysis/)用来进行LPAR6差异表达的生存分析 ADDIN EN.CITE [17]。MethHC数据库(http://methhc.mbc.nctu.edu.tw/)[18]则用来比较癌组织和癌旁组织之间LPAR6甲基化的差异。Methprimer软件(http://www.urogene.org/)用来预测LPAR6的CpG岛。

  2.10 统计分析(Statistical analysis)

  所有的数据图都是使用GraphPad Prism 6(GraphPad软件公司,美国加州)和Adobe Illustrator CC(Adobe公司,美国圣何塞)软件制作生成的。SPSS 20.0(SPSS 软件公司,美国芝加哥)用于各类数据的统计学分析。Wilcoxon配对秩和检验用于判断qRTPCR结果中,癌和癌旁组织LPAR6的表达是否存在差异。卡方检验用于分析LPAR6表达水平同病例临床病理数据之间的相互联系。Student’s t检验用于分析qRTPCR和WB实验结果中各组间的表达差异。每个验证实验至少重复三次。在每项实验中,p<0.05认为具有统计学意义。

  3 结果

  3.1 LPAR6在临床乳腺癌标本中低表达

  在Oncomine数据库中,LPAR6表达水平在BC中显著降低(p<0.0001,图1A)。GSE数据库的GSE59246数据集,也能够分析出相同结果(p<0.05,图1B)。我们的98对临床BC癌与癌旁组织的验证分析表明,在癌组织中LPAR6表达水平明显低于癌旁组织(27.6% vs.72.4%,p<0.0001,图1 C和D)。上述结果提示,差异表达的LPAR6可能是BC潜在的诊断指标。

  图1 LPAR6在乳腺癌组织中显著低表达

  Figure 1. Significantly low expression of LPAR6 in BC

  (A) LPAR6 expression in the Oncomine database. TCGA Breast Statistics (Invasive BC vs. Normal Breast). In the data for 593 samples, with 20423 measured genes, LPAR6 ranked as 466 among all downregulated genes.

  (B) LPAR6 expression in GSE59246. The data set was downloaded from the GEO database (NCBI), and significant differences were analyzed by Student’s t test.

  (C) Summary plot of 98 paired specimens. Red bar graphs show the level of LPAR6 expression in the tumor tissue, and the matched light blue bar graphs show LPAR6 expression level in the para-cancer tissue. Expression levels in tumor samples were normalized to the level in matched para-cancer samples by using the 2-ΔΔCt method.

  (D) Plot of 98 matched specimens. Each red circle represents the tumor tissue, while the light blue square at the other end of the line represents the para-cancer tissue. Two sets of data were calculated by using the 2-ΔΔCt method, and significant differences were analyzed using the Wilcoxon matched-pairs signed rank test.

  *p<0.0001, †p<0.05, ‡ p<0.0001

  3.2 LPAR6的表达与临床病理数据分析

  此次研究中所有收集的病例都是女性患者。表1给出了LPAR6表达与临床病理资料之间的关系。高组织学分级的患者表现为低水平的LPAR6(p=0.018)。然而,年龄、更年期状况、肿瘤大小、淋巴结转移情况、雌激素受体(Estrogen receptor,ER)、孕酮受体(Progesterone receptor, PR)、人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)状态或病理亚型与LPAR6表达没有显著关联。在分析BC的分子分型 ADDIN EN.CITE [19]与LPAR6表达水平的关系时,我们发现LPAR6表达仅在Luminal A和Basal-like亚型之间存在差异(Mann-Whitney检验,p<0.05,图2)。上述结果表明, LPAR6与BC的分子分型和恶性程度有关。

  表1 样本临床病理参数(n=98)

  Table 1. Clinicopathological parameters of the study cohort (n=98)

  ParameterNo.(%)LPAR6 expression levelp-valueHigh in cancer (n=27) No.(%)Low in cancer (n=71) No.(%)Age (yr)≤4015(15.3)3(11.1)12(16.9)>4083(84.7)24(88.9)59(83.1)0.477MenopauseYes47(48)14(51.9)33(46.5)No51(52)13(48.1)38(53.5)0.634Pathologic subtypeDuctal94(96)26(96.3)68(95.8)Lobular3(3)1(3.7)2(2.8)Others1(1)0(0.0)1(1.4)0.806Tumor Size≤2 cm34(34.7)8(29.6)26(36.6)>2 cm and ≤5 cm57(58.2)18(66.7)39(54.9)>5 cm7(7.1)1(3.7)6(8.5)0.508Lymph node metastasisPositive44(44.9)13(48.1)31(43.7)Negative54(55.1)14(51.9)40(56.3)0.690Histological gradeI16(16.3)1(3.7)15(21.1)II66(67.4)24(88.9)42(59.2)III16(16.3)2(7.4)14(19.7)0.018Molecular typeLuminal A20(20.4)7(25.9)13(18.3)Luminal B21(21.4)4(14.8)17(23.9)HER229(29.6)10(37.1)19(26.8)Basal-like28(28.6)6(22.2)22(31.0)0.468Neoadjuvant chemotherapyYes18(18.4)5(18.5)13(18.3)No80(81.6)22(81.5)58(81.7)0.981ER statusPositive41(41.8)11(40.7)30(42.3)Negative57(58.2)16(59.3)41(57.7)0.892PR statusPositive38(38.8)10(37.0)28(39.4)Negative60(61.2)17(63.0)43(60.6)0.828HER2 statusPositive39(39.8)12(44.4)27(38.0)Negative59(60.2)15(55.6)44(62.0)0.562ER=estrogen receptor; PR=progesterone receptor; HER2=human epidermal growth factor receptor 2.

  图2 LPAR6在乳腺癌不同分子分型的表达水平

  Figure 2. Expression of LPAR6 in different molecular types of BC

  Kruskal-Wallis test was used to analysis the differences among the four groups; p=0.2111. Mann-Whitney test was employed to determine the difference between each two groups (Luminal A vs. Luminal B, p=0.1029; Luminal A vs. HER2+, p=0.3892; Luminal A vs. Basal-like, *p<0.05; Luminal B vs. HER2+, p=0.5934; Luminal B vs. Basal-like, p=0.6930; HER2+ vs. Basal-like, p=0.2544).

  HER2=human epidermal growth factor receptor 2

  3.3 高表达LPAR6的病人预后可能更好

  为进一步评估LPAR6的临床价值,我们使用Kaplan-Meier曲线来分析LPAR6表达和病人预后之间的关系。如图3所示,我们对数据库中3951例BC患者分析后发现,高表达LPAR6的病例可以获得更高的无复发生存率(RFS;p<0.0001)。此外,对1,402名患者进行了总体生存率(OS)的评估,结果与RFS评估一致(p<0.0001),提示LPAR6还可能是BC的潜在预后标志。

  图3 高表达LPAR6提示更好的预后结果

  Figure 3. High expression of LPAR6 predicted a favorable prognosis

  (A) LPAR6 expression level and relapse-free survival; HR=0.73(95% CI 0.66−0.82).

  (B) LPAR6 expression level and overall survival, HR=0.68 (95% CI 0.54−0.84).

  3.4 乳腺癌中LPAR6的低表达水平与基因超甲基化相关

  基因的启动子序列是基因转录调控的重要区域。启动子甲基化会导致基因转录抑制,大约70%的启动子包含一个CpG岛[20]。在甲基化数据库的BC数据集中,癌组织LPAR6启动子区域的甲基化水平明显高于癌旁(p<0.05,图4A)。在LPAR6启动子序列中分布着多个GC-富集区域(图B,红色短竖线),我们通过MethPrimer软件预测了其中一个CpG岛(图4B和C)。综上所述,我们推测在BC中LPAR6的表达可能受到甲基化水平调控。

  图4 LPAR6在乳腺癌中呈高甲基化水平

  Figure 4. LPAR6 was hypermethylated in BC

  (A) LPAR6 promotor methylation level in BC. Red boxes indicated cancer tissue methylation levels, and green boxes indicated para-cancer tissue methylation levels. Analysis data from TCGA database.

  (B) CpG island prediction at the LPAR6 promotor region. MethPrimer software was used to predict CpG islands at the promotor region. Light blue area represents the CpG island; black line represents the percentage of GC residues; dark blue line represent the ratio of observed and expected CpG islands; short red line represents the DNA sequence of LPAR6 promotor region; and long red line represents the CpG prediction enrichment zone.

  (C) LPAR6 CpG island predicted by MethPrimer software. *p<0.05 †Starting and ending number of CpG islands corresponding to the nucleotide number of the LPAR6 promotor sequence.

  3.5 地西他滨在体外上调LPAR6的表达

  首先,我们在各个BC细胞系中验证LPAR6的mRNA表达水平,因为ZR-75-1细胞系表达中等水平的LPAR6,我们将其作为参考标准,作图如下(图5A)。同时,我们对细胞系的LPAR6蛋白水平进行检测(图5B)。结合临床验证结果,通过BC分子分型的两两比较, LPAR6仅在Luminal A和Basal-like亚型中存在差异。所以我们选择在这两种分子亚型中进行甲基化相关的实验。因为LPAR6表达在Luminal A中相对较高,同时在蛋白水平上,LPAR6仅在ZR-75-1细胞系中表达相对明显。因此,在Luminal A型的乳腺癌细胞系中我们选择ZR-75-1进行后续实验。而在Basal-like分子亚型乳腺癌细胞系中我们选择MB231及MB468进行后续实验。

  我们使用去甲基化药物5-Aza对上述细胞系进行干预。在ZR-75-1细胞系中,5-Aza同时在mRNA和蛋白质水平上显著地增加了LPAR6的表达(图5 C和E)。而在MB231和MB468细胞系中,5-Aza都在mRNA的水平上(图5D)上增加了LPAR6表达;而蛋白质水平上,由于蛋白丰度过低,WB数据无法分析差异。上述结果证明LPAR6在BC细胞系中呈过度甲基化状态,进而可能成为去甲基化药物的治疗靶点。

  图5 地西他滨在细胞系中显著上调LPAR6的表达

  Figure 5. 5-Aza significantly upregulated LPAR6 expression in BC cell lines

  (A) Relative LPAR6 mRNA levels in cell lines. RNA was extracted from eight BC cell lines, and LPAR6 expression level was measured by qRT-PCR with GAPDH as an endogenous reference.

  (B) Relative LPAR6 protein level in cell lines. LPAR6 expression level was measured by WB with GAPDH as the endogenous reference.

  (C, D, E) Relative LPAR6 mRNA level after drug intervention. Cell lines were treated with 10 µM of 5-Aza for 4 days.

  (F) Relative LPAR6 protein level after drug intervention in ZR-75-1 cells. Values were shown as the mean±SD of three independent experiments.

  * p<0.01;†, ‡ p<0.0001

  4 讨论

  我们这项研究的亮点是:1)我们验证了LPAR6在98对乳腺癌和癌旁组织的表达差异,发现乳腺癌组织中LPAR6的表达显著降低,对数据库的数据进行临床样本的支持和扩展。2)临床病理数据分析表明,LPAR6的低表达与较高的组织学分级相关,且Luminal A亚型中LPAR6的表达要明显高于Basal-like亚型。3)LPAR6表达水平减低可能与基因的超甲基化相关,去甲基化药物明显上调了其表达水平。

  LPAR6是LPA的一类受体,最初被发现与脱发有关。而近年来,LPAR6在癌症中参与的生物学过程逐渐被人们研究而发现。在结肠直肠癌中,LPAR6对肿瘤细胞迁移产生负性调节作用,而且LPAR6表达在p53突变的病例中呈低表达水平。相比之下,LPAR6却促进了肝癌、前列腺癌和胰腺癌的肿瘤形成。在我们的实验中发现,LPAR6在癌组织中呈低表达水平;此外,Kaplan-Meier曲线结果分析表明,高LPAR6表达提示良好的预后水平有关。LPAR6表达与其他临床参数之间的相关性在统计学上没有显著性,可能是由于样本容量的限制。在我们后续的研究中,针对LPAR6研究的样本数目将会持续增加。

  先前的研究已经证明,BC的表观遗传变化与BC的发生和发展密切相关,而针对表观遗传调控的治疗已逐渐成为BC治疗的一种全新而且有效的方法。最近,同样有许多关于基因超甲基化而影响癌症的发生与发展的研究,如CDKN2A、KLF17和FOXA1。在本研究中,LPAR6在BC组织中呈低水平表达,而这可能是因为在LPAR6的启动子区的基因超甲基化;去甲基化药物5-Aza可以显著增加LPAR6的表达反过来也证明了这点。据我们所知,这是第一个揭示乳腺癌中 LPAR6的表达水平和调控水平的研究。后续的研究将探索LPAR6在癌细胞生物行为中的作用。

  综上所述,在乳腺癌的诊疗过程中,LPAR6可以作为诊断和预后的标志,而且它在肿瘤中的表达受到甲基化的调控。这为我们接下来研究LPAR6分子在乳腺癌中的功能和作用奠定了重要的基础。

  文献综述

  溶血磷脂酸受体家族在肿瘤中的研究进展

  摘要:溶血磷脂酸(LPA)通过其受体溶血磷脂酸受体(LPAR)1~6发挥重要的生理功能,在肿瘤中,LPA通过LPAR介导的通路影响肿瘤的发生发展。LPAR1~5在肿瘤中研究相对较多,而LPAR6作为新发现的LPA的受体,最早发现其功能与脱发相关,在肿瘤方面的研究内容和深度有限。本文旨在分析LPAR家族各成员在肿瘤的研究进展,分析并探讨其最新研究的生物学功能,重点探讨新发现的LPAR6在肿瘤研究中的新进展及未来可能的研究方向。

  关键词:溶血磷脂酸受体,肿瘤

  1 肿瘤与溶血磷脂酸通路

  溶血磷脂酸(lysobisphosphatidic acids,LPA)是迄今发现的一种最小、结构最简单的磷脂,它是真核细胞磷脂生物合成早期阶段的关键性前体,可以作为重要的生物学标志物。它由一个单一的脂肪酸酰基链和一个甘油酯组成的骨架,加上一个游离的磷酸基组成;与其他大多数其他的磷脂不同,溶血磷脂酸具有水溶性的特点。LPA通过与之相关的G蛋白受体介导的多种信号传导通路发挥其生物学效应;也可以通过非蛋白介导的信号传导过程调控细胞各项生理和病理活动。此外,LPA可以诱导细胞形状的改变,增加内皮渗透性,并抑制相邻细胞之间的联系。研究表明LPA是由自毒素(autotaxin,ATX)产生,而ATX及其代谢产物与肿瘤的血管生成和肿瘤的转移密切相关。总的来说,LPA通过参与影响各种信号通路,进而引起肿瘤的病理生理学改变,对帮助了解肿瘤的侵袭迁移机制意义巨大。

  2 溶血磷脂酸受体家族

  1996年,Hecht JH等学者首次鉴定出溶血磷脂酸受体1(lysophosphatidic acid receptor1,LPAR1)[37],截至目前为止LPA的6种G蛋白偶联受体相继被鉴定出来。LPAR1~5这5个LPA受体自鉴定出来以后,相关肿瘤研究就如雨后春笋般出现,它们通过各种信号通路,经由不同机制影响肿瘤的生物学行为。LPAR6是新鉴定的LPA受体,最开始发现与遗传有关的脱发有联系,遗传性单纯少毛症( Hypotrichosis simplex)的发生就是LPAR6基因突变的结果,而与之相关的文章主要围绕脱发的机制及相应的治疗展开。同时也有报道LPAR6可能参与子宫构造改变,参与妊娠早期LPA信号通路的调节[39]。近些年来研究发现LPAR6也同样参与到一些肿瘤的生物学行为过程中,并通过不同的信号通路影响肿瘤的发生和发展。因肿瘤类型的不同,LPAR6抑癌或促癌作用有所区别,所以本文分别探讨其抑癌和促癌方面的研究。

  3 LPAR1~5在肿瘤中的研究进展

  3.1 LPAR1的最新研究

  在乳腺癌中,已证实阻断LPAR1可以抑制乳腺癌的转移,在此基础之上,Debashish Sahay团队在三阴性乳腺癌中继续探讨LPAR1的下游机制,发现其通过LPA1/PI3K/ZEB1依赖通路,最终激活致癌miR-21,导致肿瘤的侵袭能力增加。Jill M. Westcott团队提出了乳腺癌中的“集群式侵袭”(collective invasion)现象,即乳腺癌中存在着一群先驱细胞,特征性高表达一系列分子(包括LPAR1),这些分子帮助其他肿瘤细胞通过共同通道机制成群性的发生侵袭。这一研究丰富了乳腺癌的侵袭途径,并且再次表明LPAR1参与肿瘤发生发展。在胰腺癌中,Fukushima K等同样发现了LPA通过LPAR1影响肿瘤的侵袭能力。此外,Kajitani N等和Park E等研究发现,LPAR1在神经和免疫方面同样具有重要的功能,或许可以帮助我们解释肿瘤研究中的原发灶以外出现的病理改变。

  3.2 LPAR2的最新研究

  Shida D等研究人员在结直肠癌病人的标本中检测LPAR2的表达发现其中20/27例患者的LPAR2表达明显上调,为结直肠癌的治疗找到全新靶点。Cheng-Lan Jiang等研究分析得出,LPAR2在肺癌中呈低甲基化状态,这可能解释了LPAR2作为促癌基因表达上调的原因。在乳腺癌病人中,Li M等研究发现,高表达LPAR2在乳腺癌中提示不良预后,而且LPAR2能够促进肿瘤细胞的生长。

  3.3 LPAR3的最新研究

  基于LPAR3调控促红细胞生成的过程,Ho YH等研究人员发现在人类红白血病细胞系K562中,LPAR3可以促进巨核细胞分化,活化氧自由基的生存。Sun K等在三阴性乳腺癌标本中验证了LPAR3的表达,发现乳腺癌组织表达更高水平的LPAR3,抑制LPAR3可以明显降低肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。另外,在多发性骨髓瘤中,Kanehira M等研究发现LPAR3并不直接影响肿瘤细胞,而是通过周围间充质基质细胞的分化作用,丰富了LPAR3的作用机制。而在黑色素瘤的研究中,Jia W等发现通过对LPAR3使用siRNA可以同时抑制LPAR3和黑色素瘤细胞。进而发现LPAR3的SH3配体结合域是发挥作用的关键。

  3.4 LPAR4的最新研究

  Pan W等对中国甲状腺乳头状癌的病例进行突变分析发现,LPAR4是其中重要的突变位点。揭示LPAR4可能存在抑癌作用的功能,但其在甲状腺肿瘤中的角色还有待实验的验证。最近Takara K等研究者发现LPA通过LPAR4参与肿瘤血管网络的形成,LPAR4使肿瘤血管通透性升高,利于抗肿瘤药物的渗透,从而间接发挥抑癌作用。这项研究增丰富了LPAR4的功能,为未来研究LPAR4提供新思路。

  3.5 LPAR5的最新研究

  Dong Y等学者发现,在人骨肉瘤细胞系HOS和纤维肉瘤细胞系HT1080中敲减LPAR5以后,瘤细胞的侵袭和迁移能力明显增高,提示LPAR5对肿瘤的运动和侵袭能力起到负性调节作用。A Araki M等同样在骨肉瘤细胞中验证了这一现象 ADDIN EN.CITE [56]。在黑色素瘤细胞中,Fukushima K等研究发现长期使用达卡巴嗪和顺铂类药物可以上调LPAR5的表达,而且长期使用药物的细胞较正常培养的细胞活动性明显增强,提示LPAR5可能参与肿瘤的耐药,并与肿瘤的增殖能力相关。

  4 LPAR6在肿瘤中的研究进展

  LPAR6作为LPA的受体,在体内各个器官表达水平不同,其中,胰腺和骨髓中分布最低,而在胎盘、食管中相对较高。LPAR6在人体组织器官的表达差异性是其功能和机制差异性的基础。在LPAR6与肿瘤的已有的研究中,我们只在结直肠癌的研究中发现LPAR6可能对肿瘤的行为存在负性调控作用。在2012年,Venkat R. Katkoori等对P53突变的结直肠癌患者测序分析发现,LPAR6在P53的病人中表达明显减低,提示P53可能从参与LPAR6的表达调控。2016年,Kaede Takahashi等研究发现,敲除LPAR6的结直肠癌细胞株细胞增殖能力/迁移能力均增高,LPAR6可能存在抑制细胞增殖能力以及抑制细胞迁移能力的作用。

  LPAR6促进肿瘤的研究相对较多。前列腺癌中,过表达LPAR6的肿瘤细胞移植进入小鼠后,肿瘤的转移能力增强;而肿瘤细胞敲减LPAR6后,再转入小鼠体内成瘤,肿瘤的转移能力明显减低。前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力受与赖氨酸相关的脱乙基酶1(LSD1)的调节,2014年A Ketscher等对LSD1的敲减,可以增强LPAR6信号通路,引起癌细胞迁移能力增加,类似地,Shuhei Ishii等在胰腺癌细胞中敲减LPAR6,同样抑制了肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。Antonio Mazzocca等对肝癌患者的研究发现,高表达LPAR6的肝癌病人和低表达组病人比较,预后更差;而敲减LPAR6后进行的异种移植实验发现肿瘤细胞成瘤能力明显下降,并发现LPAR6的促癌作用是通过Pim3基因实现的。Biljana Stangeland团队和Eugene Sokolov团队通过测序生物信息学技术分析,发现LPAR6还可以作为脑胶质细胞瘤和肝细胞肝癌临床诊断生物学标记和个体化治疗的靶点。综合上述研究结果,我们发现LPAR6功能上可能参与肿瘤的侵袭和迁移过程,也与部分肿瘤的增殖能力相关,但具体的机制和方式尚不清楚,研究内容尚不丰满,研究深度也不够。后续需要在更多的肿瘤类型中验证LPAR6的功能,以此来更好的分析LPAR6在肿瘤中的真正角色。

  5 展望

  肿瘤统计2018版已经发表在CA CANCER J CLIN上,肿瘤依旧是主要危害人类健康的主要疾病之一,肿瘤的形势仍然不容乐观。肿瘤的发生与发展是多基因参与,多因素调控,多条件影响的复杂病理过程,肿瘤发生发展各个环节都是研究的热点难点。及早的诊断和恰当而及时的个体化治疗,是帮助改善患者预后的重要内容。发现新兴,有效的生物学标记能够更好的帮助对肿瘤的临床诊断与后续靶向治疗。

  LPAR家族的成员在肿瘤的侵袭和迁移方面作用显著,参与肿瘤的多种生物学行为调控,未来针对该家族各个分子的研究仍是探索肿瘤发病机制尤其是转移机制重要的方向。在LAPR家族中,LPAR6作为新发现的LPA受体家族的重要成员,本身的研究还过于稀少,通过Oncomine和TCGA数据库我们发现,LPAR6在乳腺癌、肺癌、膀胱癌、皮肤癌等肿瘤中同样存在癌和癌旁组织显著的差异表达,但是这些肿瘤中LPAR6的研究仍是空白,未来LPAR6定会是肿瘤研究的热点。相信对LPAR家族的进一步探索能够帮助我们更好的理解肿瘤的发生与发展,为肿瘤的诊断和治疗提供帮助。

栏目分类