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肿瘤学了论文 MYCL1在胃癌中表达及慢病毒--干扰MYCL1对人胃癌生物学行为的影响

2018-12-14 13:32:38来源:组稿人论文网作者:婷婷

  英汉缩略词表

  (按英文字母顺序排列)

  英文缩写英文全称中文全称Acr-BisAcrylamide-bisacrylamide丙烯酰胺-双丙烯酰胺APAmmonium peroxydisulfate过硫酸铵CCK8Cell Counting Kit-8CCK8试剂盒DEPC Diethypyrocarbonate 焦碳酸二乙酯 DMEMdulbecco's modified eagle medium Dulbecco改良的Eagle培养基DMSODimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 ECLEnhanced Chemiluminescnce增强型化学发光显色ENI.SEnhanced infection solution感染增强剂FBS Fetal bovine serum胎牛血清FNFibronectin纤维连接蛋白GFPGreen fluorescent protein绿色荧光蛋白HRPHorseradish peroxidase 辣根过氧化物酶 IHCimmunohistochemical免疫组织化学LVLentiviral vector 慢病毒载体OD Optical density 吸光度值 PMSF Phenylmethanesulfonyl fluoride苯甲基磺酰氟 PVDF Polytetrafluoroethene 聚偏二氟乙烯RNAiRNA interferenceRNA干扰SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 TBSTris-Buffered SalineTris-HCL缓冲盐溶液 TEMEDN,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine四甲基乙二胺 MYCL1在胃癌中表达及慢病毒

  干扰MYCL1对人胃癌生物学行为的影响

  摘 要

  目的

  采用免疫组织化学染色(IHC)方法,检测组织中Mycl1蛋白的表达,探讨Mycl1表达与胃癌患者临床病理特征的关系,并进行预后生存分析。通过细胞学实验,检测MYCL1在细胞中的表达情况及研究慢病毒介导的RNA干扰MYCL1基因对胃癌细胞体内外生物学行为的影响,探讨MYCL1基因在胃癌发生发展中的作用。

  方法

  组织学实验

  采用免疫组织化学染色(IHC)方法,检测176例胃癌组织及相应癌旁正常组织中Mycl1蛋白的表达情况,分析Mycl1表达与胃癌临床病理特征的关系,并进行预后生存分析。

  2. 细胞学实验

  (1) 通过蛋白质印迹实验(Western Blot)和实时荧光定量PCR(real-time qPCR)方法,对人正常胃粘膜永生化细胞(GES-1)及胃癌细胞(MGC-803、NCI-N87、AGS和HGC27)进行MYCL1蛋白及mRNA表达水平的检测,筛选出稳定表达的胃癌细胞株(MGC-803细胞及HGC27细胞)。

  (2)构建靶向干扰MYCL1基因表达的慢病毒载体,感染MGC-803及HGC27细胞株,经嘌呤霉素筛选出稳转细胞株后进行体内外功能学实验,观察干扰MYCL1基因后对胃癌细胞生物学行为的影响,并通过电镜观察细胞微细结构的改变。

  3. 动物学实验

  将18只裸鼠随机分为实验组(LV-MYCL1-RNAi)、空载体组(LV-NC)、空白对照组(Control),每组6只,以1×107/0.2ml/只接种至裸鼠右侧腋窝皮下,建立人胃癌移植瘤模型。取出瘤体后测量移植瘤最大径及体重,通过Western Blot和real-time qPCR方法检测MYCL1蛋白及mRNA的表达水平,观察慢病毒介导的RNAi干扰MYCL1基因效应是否能够在裸鼠体内得到体现。

  结果

  组织中的结果

  Mycl1在癌组织中的表达远高于癌旁组织,Mycl1高表达更多地发生于低分化和(或)高TNM分期的胃癌组织;Kaplan–Meier生存分析结果:Mycl1阳性表达的患者生存时间低于Mycl1阴性表达的患者(P < 0.001,log-rank test.)

  细胞学结果

  (1)4株胃癌细胞和正常胃粘膜上皮细胞GES-1在蛋白相对表达量上的比较结果:NCI-N87>MGC803>HGC27>GES-1>AGS,在mRNA上的相对表达量的比较结果:NCI-N87>AGS>HGC27>MGC803>GES-1。MGC-803及HGC27这两株稳定表达的癌细胞被筛选出来进行后续的慢病毒干扰实验。

  (2)慢病毒稳定转染MGC803细胞及HGC27细胞后,通过Western Blot筛选出最佳靶点,采用real-time qPCR进行干扰效率验证。MGC803细胞的干扰靶点为LV-MYCL-RNAi(53814-1)时干扰效率最高,HGC27细胞的干扰靶点为LV-MYCL-RNAi(53813-1)时干扰效率最高。

  (3)生物学行为结果:慢病毒干扰MGC803细胞及HGC27细胞MYCL1表达后,LV-RNAi-MYCL1组与LV-NC及Control两组相比,其迁移、侵袭等生物学行为均有不同程度地降低,但对增殖的抑制,仅在HGC27细胞中得以体现,对MGC803细胞影响不大。

  (4)细胞超微结构变化:透射电镜下观察,干扰MYCL1后MGC803细胞微绒毛发生改变,LV-RNAi-MYCL1组细胞微绒毛突起较LV-NC组及Control组减少、变细。干扰MYCL1后HGC27细胞中线粒体发生改变,LV-RNAi-MYCL1组细胞中线粒体嵴较LV-NC组及Control组减少或消失。

  3. 动物中的结果:

  检测裸鼠移植瘤的MYCL1蛋白和mRNA表达水平,LV-MYCL-RNAi组较LV-NC组及Control组降低。

  结论

  Mycl1在癌组织中的表达远高于癌旁组织,Mycl1高表达与胃癌组织的低分化、高TNM分期呈正相关,Mycl1阳性表达较阴性表达的患者生存时间短。

  干扰MYCL1基因可抑制胃癌细胞的侵袭、迁移、增殖等生物学行为,MYCL1基因可能与胃癌的侵袭转移有关。

  MYCL1是潜在的胃癌治疗靶点和判断预后的指标。

  关键词

  胃癌,慢病毒干扰,MYCL1,生物学行为,裸鼠成瘤

  前 言

  胃癌是常见的恶性肿瘤,据全国肿瘤登记中心发布的关于2015年中国癌症统计结果显示,我国胃癌发病例数约为67.9万, 死亡总例数约49.8万,发病率及死亡率均仅次于肺癌,位居肿瘤死亡率第2位。在福建省,胃癌位于高发恶性肿瘤的首位,福州地区长乐市更是全国胃癌高发区。绝大部分胃癌患者就诊时已处于癌症中晚期,即使给予积极的治疗,5年生存率仍较低。因而,加强胃癌的基础和临床防治研究在我国意义深远。

  胃癌的发生是多基因参与、多步骤演进的复杂过程,涉及到许多原癌基因激活和抑癌基因失活。常见的原癌基因包括EGFR、HER2、K-RAS、C-MYC等,常见的抑癌基因包括E-cadherin、PTEN、p53、P16等。

  其中,C-MYC基因属于MYC基因家族成员,定位于染色体8q34,介导生物信号从细胞外向细胞核内的转导,起着调控细胞凋亡和增殖的作用,众多的研究表明:C-MYC通过扩增和染色体易位重排的方式激活,与多种恶性肿瘤如胰腺癌、鼻咽癌、胃癌、乳腺癌等的发生发展密切相关,因此被公认为原癌基因。除了C-MYC基因,MYC基因家族还包括L-MYC(即MYCL1)、N-MYC两个成员。 N-MYC基因是一个胚胎期表达的原癌基因,定位于人类染色体2p23,在神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、肾母细胞瘤等多种胚胎源性肿瘤中扩增显著,并可加速肿瘤发展,促进患者病情恶化。近年来发现,N-MYC还可抑制各系造血细胞的分化,促进它们的增殖。

  同样作为MYC基因家族的成员,MYCL1基因,定位于染色体1p34.2,它包含三个外显子、两个内含子,全长6.59kb,编码含有364个氨基酸的核磷酸化蛋白,该蛋白含有碱性螺旋一环一螺旋拉链结构(bHLH结构),它与同样具有bHLH结构的Max蛋白异二聚化形成复合物,充当转录因子结合于特定DNA CACGTG序列(E-box)上,调控下游靶基因的转录,在调节细胞生长、分化、增殖、凋亡、血管生成等一系列生物学反应中发挥了重要作用。已有的研究表明,MYCL1在卵巢癌、皮肤Merkel细胞癌等一些恶性肿瘤中也有扩增和过表达,因此,MYCL1也可能是潜在的原癌基因,但与C-MYC和N-MYC相比,MYCL1与肿瘤的关系尚未引起医学界的足够重视。

  迄今为止,MYCL1与肿瘤的关系更多集中于遗传易感方面的研究,上世纪90年代和本世纪初,许多学者发现MYCL1非编码区第二内含子上的SNP(单核苷酸多态性)rs3134613(早期文献称EcoRI酶切位点)与肾癌、肺癌、乳腺癌的易感性相关;本项目组前期中等样本量的病例-对照研究发现,rs3134613与胃癌的分化密切相关,并且是预测弥漫型胃癌发生风险的潜在标志物,该研究结果已发表于2010.12的DNA and Cell Biology(SCI源刊物)上;基于此,我们希望进一步探究:MYCL1与胃癌的侵袭转移有无关系?MYCL1是否确切影响了胃癌细胞的生物学行为?MYCL1在胃癌的发生发展中起着何种作用?

  为了解答上述问题,本研究采用免疫组织化学染色法检测Mycl1蛋白在胃癌及癌旁组织中的表达情况并分析其与临床病理特征包括与生存时间的关系;通过Western Blot和real-time qPCR法检测MYCL1在不同侵袭、转移能力的胃癌细胞株中的表达水平;构建慢病毒干扰载体,通过体内外功能学实验观察干扰MYCL1前后胃癌细胞生物学行为的改变,探讨MYCL1基因对胃癌侵袭转移特性的影响。本研究有望为胃癌早期诊断、预后判断提供分子标志物,为胃癌个体化基因治疗提供新靶点,为阐明胃癌发生发展机制提供理论依据。

  第一部分

  Mycl1在胃癌及癌旁组织中的表达及意义

  引言

  我国是胃癌的高发国家,且近90%的病例在发现时已位于进展期,而同样属于胃癌高发国家的日本及韩国,由于全民胃癌筛查的实施,其胃癌的早诊率显著提高,使得胃癌患者的生存率远远高出我国。因而,提升胃癌的早诊率,成为胃癌防治的重要手段。患者预后的预测和提供有效的治疗靶点对降低死亡率亦非常关键。

  MYCL1,最初从人类肺小细胞肺癌癌株中分离出来,是MYC家族的重要成员。有研究表明,MYCL1参与了许多生物学过程,包括细胞增殖、分化和凋亡,在一些恶性肿瘤中被发现有扩增和过表达。因此,MYCL1被认为是原癌基因。在之前的研究中,我们发现MYCL1基因的一个位于内含子上的单核苷酸多态性位点(SNP)与弥漫型胃癌的发生风险和胃癌的分化相关。然而,MYCL1在胃癌中的表达及其临床意义尚未可知。

  因此,在本部分研究中,我们拟采用免疫组化方法检测胃癌及癌旁正常组织中Mycl1蛋白的表达水平,通过分析Mycl1表达与胃癌临床病理特征的关系并进行生存分析,评估用Mycl1作为胃癌预后标志物和治疗靶点的可行性。

  结 果

  Mycl1在胃癌和相邻正常胃组织中的表达

  Mycl1蛋白表达于胃癌细胞和正常胃粘膜上皮和腺上皮中,间质细胞中未见阳性染色。蛋白阳性染色或位于胞浆或位于胞核或二者皆有。图1-1显示了胃癌和癌旁正常组织中Mycl1表达的代表性图像。此外,早期和进展期胃癌组织中Mycl1表达的强度和面积未见明显差异。

  图1-1 Mycl1在胃癌及癌旁组织中的表达

  Mycl1蛋白表达在胃癌组织的细胞浆中(×400). (B) Mycl1蛋白表达在胃癌组织的胞核和胞浆中(×400). (C)Mycl1蛋白表达在正常胃组织的胞浆中(×400). (D) Mycl1蛋白表达在正常胃组织的胞核中(×400).

  表1-1 Mycl1在胃癌组织和癌旁正常组织之间表达的比较

  组别总数Mycl1表达(+)Mycl1表达(-)P值n% n %胃癌组织17611062.56637.50.002*癌旁正常组织1768146 9554在176例中,同时表达于癌和癌旁组织的有76例(43.2%);只表达于癌组织的有34例(19.3%),有5例(2.8%)仅表达于正常组织。如表1-1所示,Mycl1在肿瘤组织中的阳性表达率显著高于癌旁正常组织(62.5% vs 46.0%,P=0.002)。

  Mycl1表达与胃癌临床病理特征的相关性

  我们分析了Mycl1表达与胃癌临床病理特征的相关性。如表1-2所示,与年长组(>64岁)、中或高分化组、早期胃癌组相比,Mycl1更多地表达于年轻组(≤64岁)、低分化组和进展期胃癌组(分别73.4% vs 53.6%,p=0.007;71.4% vs 49.3%,p=0.003; 72.1% vs 48.6%,p=0.002)。然而,Mycl1的表达与其它参数如性别、肿瘤大小、淋巴结有无转移等均无显著相关性。

  表1-2 Mycl1表达和胃癌临床病理特征的关系

  病理特征总数Mycl1表达p值阳性(n=110)(%)  阴性(n=66)(%)年龄64(34-83)0.007*≤64岁7958(73.4)21(26.6)>64岁9752(53.6)45(46.4)性别0.764男12579(63.2)46(36.8)女5131(60.8)20(39.2)大小0.067 <69151(56.0)40(44.0)≥68559(69.4)26(30.6)分化a0.003*中或高分化7135(49.3)36(50.7)a低分化10575(71.4)30(28.6)淋巴结转移0.106无转移4423(52.3)21(47.7)有转移13287(65.9)45(34.1)TNM 分期0.002*早期(Ⅰ期或

  Ⅱ期)7235(48.6)37(51.4)进展期(Ⅲ或

  Ⅳ期)10475(72.1)29(27.9)*P<0.05表示差异有统计学意义

  a低分化,包括粘液腺癌和印戒细胞癌。

  3. 总生存率的单变量与多变量分析

  表1-3显示了胃癌患者预后相关因素的单变量和多变量分析结果。单变量分析显示肿瘤分化、TNM分期和Mycl1表达与总生存率显著相关(均P<0.01)。如图1-2所示,Mycl1表达阳性组的预后显著差于Mycl1表达阴性组的预后(n=66;p<0.001)。多变量分析也显示Mycl1表达(HR=3.785,95%CI:1.158-4.108,p=0.009)、肿瘤分化(HR=2.318,95%CI:1.543-5.442,p=0.017)和TNM分期(HR=3.556,95%CI:1.693-6.035,p=0.011)是胃癌患者总生存率的独立预后因素。

  表1-3 总生存率的单变量和多变量分析

  变量单变量分析多变量分析P值HR(95%CI)P值年龄(岁)>64 vs. ≤640.4940.835(0.486-1.563)0.537性别女 vs.男0.1520.654(0.356-1.248)0.164大小≥6岁vs.<6岁0.2891.465(0.787-2.643)0.346分化低分化vs.中或高分化0.002*2.318(1.543-5.442)0.002* 淋巴结转移有转移 vs.无转移0.5281.379(0.767-2.843)0.633TNM 分期Ⅲ或Ⅳ期vs. Ⅰ或Ⅱ期0.000*3.556(1.693-6.035)0.011*Mycl1 表达阳性vs.阴性<0.001*3.785(1.158-4.108)0.009*CI,confidence interval;vs., versus.

  *P<0.05表示差异有统计学意义。

  图1-2显示:Mycl1阳性表达较阴性表达的患者生存时间更短(log-rank检验示P<0.001)。

  图1-2 胃癌患者总生存率的Kaplan-Meier分析(n=176)

  结 论

  Mycl1蛋白在胃癌组织中的表达远高于相邻正常胃组织,它的高表达与胃癌分化低、TNM分期高呈正相关。

  Mycl1表达阳性组较阴性组预后更差,患者生存时间更短。

  Mycl1是潜在的胃癌治疗靶点和预后判断指标。

  第二部分

  慢病毒介导的RNA干扰MYCL1

  表达对胃癌细胞体内外生物学行为的影响

  第一章

  筛选稳定表达的胃癌细胞株

  引言

  第一部分通过免疫组织化学染色(IHC)方法检测了Mycl1蛋白在胃癌组织中的表达情况,发现Mycl1在癌组织中的表达远高于癌旁组织,且其高表达更多地发生于低分化和(或)高TNM分期的胃癌组织。那么,在不同胃癌细胞株中,MYCL1的蛋白及mRNA的表达是否也有差异呢?本部分采用蛋白印迹法(Western Blot)和实时荧光定量PCR法(real-time qPCR)对人正常胃粘膜永生化细胞(GES-1)及四株胃癌细胞(MGC-803、NCI-N87、AGS和HGC27细胞)中的MYCL1蛋白及mRNA的表达水平进行检测,观察癌株间MYCL1的表达差异,从而筛选出用于后续慢病毒介导的RNA干扰实验的稳定表达的胃癌细胞株。

  ,

  结 果

  MYCL1在胃癌细胞株中的表达

  1.1 Mycl1蛋白在胃癌细胞株中的表达

  Western Blot实验中,Mycl1蛋白相对表达量用Mycl1灰度值/β-actin灰度值表示。如图1-1所示:MGC803、HGC27、NCI-N87三株细胞表达高于GES-1细胞,AGS细胞表达低于GES-1细胞。图1-2为不同胃癌细胞株Mycl1蛋白相对于β-actin蛋白的相对表达量,结果分别为GES-1:0.8±0.422;MGC803:1.58±1.1;HGC27:1.09±0.547;NCI-N87:1.83±1.554;AGS:0.63±0.384。

  图1-2 Mycl1蛋白在胃癌细胞株中的表达

  图1-3 Mycl1蛋白在胃癌细胞株中的相对表达量

  1.2 MYCL1 mRNA在胃癌细胞株中的表达

  Real-time qPCR检测mRNA,结果用2-ΔΔCt值表示。以GES-1为对照组,得出胃癌细胞相对于正常胃粘膜上皮细胞的mRNA相对表达量用均值±标准差表示,分别为GES-1:1;MGC803:1.69±0.524;HGC27:1.7±0.257;NCI-N87:4.51±3.443;AGS:1.95±1.549,如图1-3。四株胃癌细胞均较GES-1细胞表达高。

  图1-4 MYCL1 mRNA在胃癌细胞株中的相对表达量

  结 论

  Mycl1在蛋白表达水平上:相较于正常胃粘膜上皮细胞(GES-1),三株低分化/未分化胃癌细胞(NCI-N87、MGC803、HGC27细胞)的表达均更高;

  MYCL1在mRNA表达水平上:相较于正常胃粘膜上皮细胞(GES-1),四株胃癌细胞(NCI-N87、MGC803、HGC27、AGS细胞)的表达均更高。

  总结:综合第一部分的免疫组织化学染色的结果和细胞中Western Blot及real-time qPCR的结果,我们推断:MYCL1可能赋予了胃癌细胞更高的侵袭表型和转移潜能,是潜在的胃癌癌基因。因此,我们选择在蛋白和mRNA水平上均稳定高表达的胃癌细胞株(MGC803细胞和HGC27细胞)进行后续实验,以验证MYCL1对胃癌细胞生物学行为的影响。

  第二章

  RNA干扰慢病毒载体制备及感染胃癌细胞后有效靶点的筛选

  引言

  载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。目前常用的有病毒载体和非病毒载体两类,病毒载体由于转导效率较高且可用于体内和体外的基因转导,是目前基因治疗研究和临床应用的主要工具。慢病毒作为载体,具备感染非分裂细胞、有效地将目的基因导入宿主细胞并整合到宿主细胞基因组中、使之稳定表达的特点,因此在体内基因治疗中被广泛使用。RNAi干扰技术可特异性抑制或关闭特定基因的表达,由慢病毒载体介导的RNAi是运用慢病毒载体将RNAi片段导入宿主细胞,从而抑制同源mRNA的表达。本部分将采用上海吉凯基因制备的慢病毒表达载体,感染两株胃癌细胞株(MGC803细胞及HGC27细胞),通过观察两株细胞荧光感染情况、检测蛋白及mRNA表达情况,确定最佳干扰靶点,以进行后续的体内外功能学实验。

  RNAi 慢病毒克隆的制备

  二.慢病毒包装与质量检测

  结果

  1. 慢病毒感染293T细胞

  此图片由吉凯基因提供,为设计的LV-MYCL-RNAi(53812-1)、LV-MYCL-RNAi(53813-1)、LV-MYCL-RNAi(53814-1)三个靶点,病毒使用量为1E-0μl时感染293T细胞72h时通过Celigo 细胞成像分析仪(Brooks Automation)获得。

  明场视野

  绿色荧光

  视野

  LV-MYCL-RNAi (53812-1) LV-MYCL-RNAi (53813-1) LV-MYCL-RNAi (53814-1)

  图2-1 慢病毒感染293T细胞

  2. 病毒滴度

  在成功构建慢病毒干扰载体后,进行滴度测试,病毒滴度均较高。

  病毒名称滴度(TU/mL)LV-MYCL-RNAi(53812-1)6E+8LV-MYCL-RNAi(53813-1)5E+8LV-MYCL-RNAi(53814-1)6E+8阴性对照病毒CON077

  (hU6MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-Puromycin)8E+8

  3. 慢病毒感染MGC803细胞及HGC27细胞后的荧光表达情况

  由吉凯基因构建的慢病毒,分别感染处于对数生长期且状态良好的MGC803细胞及HGC27细胞。感染后48h可见微弱绿色荧光,至72h时荧光较强。图2-2 (MGC803细胞)及2-3(HGC27细胞)可见:LV-RNAi-MYCL1组荧光表达强度较LV-NC组弱。

  明场视野

  绿色荧光

  视野

  LV-NC LV-MYCL-RNAi (53814-1)

  图2-2 MGC803细胞慢病毒感染40x

  明场视野

  绿色荧光

  视野

  LV-NC LV-MYCL-RNAi (53813-1)

  图2-3 HGC27细胞慢病毒感染40x

  4. 慢病毒干扰后Mycl1蛋白表达情况

  选取LV-MYCL-RNAi (53813-1)及LV-MYCL-RNAi (53814-1)两个干扰靶点分别感染MGC803细胞及HGC27细胞,根据Western Blot方法检测不同靶点的干扰效率,选取合适的干扰靶点进行后续实验。如图2-4及2-5所示,MGC803细胞的干扰靶点为LV-MYCL-RNAi (53814-1)时,干扰效率最高,故选其作为后续实验的干扰靶点。如图2-6及2-7所示HGC27细胞的干扰靶点为LV-MYCL-RNAi (53813-1)时,干扰效率最高,故选其作为后续实验的干扰靶点。

  图2-4 MGC803细胞经慢病毒干扰前后Mycl1蛋白表达情况

  图2-5 MGC803细胞经慢病毒干扰前后Mycl1蛋白的相对表达量

  图2-6 HGC27细胞经慢病毒干扰前后Mycl1蛋白表达情况

  图2-7 HGC27细胞经慢病毒干扰前后Mycl1蛋白相对表达量

  慢病毒干扰后MYCL1 mRNA表达情况

  通过Western Blot方法筛选出两株细胞的最佳干扰靶点后,用real-time qPCR检测慢病毒干扰MYCL1后mRNA相对表达水平,此时均使用相应细胞的最佳干扰靶点进行检测。结果显示:MGC803和HGC27细胞经慢病毒干扰MYCL1基因后,Control组与LV-NC组相比,差异无统计学意义;LV-RNAi-MYCL1组与LV-NC组相比,mRNA相对表达水平下降,差异有统计学意义(P<0.05),如图2-8及2-9所示。

  图2-8 MGC803细胞经慢病毒干扰前后MYCL1 mRNA相对表达量

  图2-9 HGC27细胞经慢病毒干扰前后MYCL1 mRNA的相对表达量

  结 论

  慢病毒感染MGC803细胞、干扰靶点为LV-MYCL-RNAi(53814-1)时,干扰效率最高,选其作为后续实验的干扰靶点;.慢病毒感染HGC27细胞、干扰靶点为LV-MYCL-RNAi(53813-1)时,干扰效率最高,选其作为后续实验的干扰靶点。

  通过观察荧光表达情况及应用Western Blot和real-time qPCR实验方法进行验证,表明慢病毒感染MGC803细胞及HGC27细胞成功,且能有效干扰MYCL1的表达。

  第三章

  RNAi靶向抑制MYCL1基因表达对胃癌细胞生物学行为的影响

  引言

  在前述实验中我们发现:Mycl1蛋白在胃癌组织中的表达远高于癌旁组织,Mycl1高表达与胃癌低分化和(或)高TNM分期成正相关;相较于高分化胃癌细胞,Mycl1在低或未分化胃癌细胞中表达更高。因此我们推断,MYCL1基因可能赋予了胃癌细胞更多的恶性潜能。那么下调MYCL1表达是否能抑制胃癌的侵袭转移、减少其恶性增殖呢?本部分我们采用RNAi技术靶向干扰MYCL1基因的表达,观察干扰前后胃癌细胞生物学行为的差异(本部分MGC803细LV-RNAi-MYCL1组对应的干扰靶点为LV-MYCL-RNAi(53814-1),HGC27细胞LV-RNAi-MYCL1组对应的干扰靶点为LV-MYCL-RNAi(53813-1))。

  结果

  1. CCK8法检测慢病毒干扰MYCL1后胃癌细胞增殖情况

  将MGC803细胞(2000个/孔)和HGC27细胞(3000个/孔)分别种于96孔板中,分别于种板24、48、72、96后加CCK-8,孵育1.5h后在酶标仪上检测450nm波长处OD值。结果:如图3-1所示,MGC803细胞的Control组与LV-NC组相比,LV-RNAi-MYCL1组与LV-NC组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。如图3-2所示,HGC27细胞的Control组与LV-NC组相比,差异无统计学意义(P>0.05);LV-RNAi-MYCL1组与LV-NC组相比,OD值明显较小,差异有统计学意义(P=0.01<0.05)。说明干扰MYCL1的表达可降低HGC27胃癌细胞的增殖,对MGC803胃癌细胞的影响不大。

  图3-1

  图3-1 MGC803细胞经慢病毒干扰前后细胞增殖情况

  图3-2 HGC27细胞经慢病毒干扰前后细胞增殖情况

  2. 细胞平板克隆形成实验

  贴壁依赖性细胞不一定每个都能形成克隆,而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性及增殖能力两个重要性状。本实验发现:如图3-3及3-5所示,MGC803细胞和HGC27细胞均能形成克隆。如图3-4,MGC803细胞的LV-RNAi-MYCL1组与LV-NC组相比,无明显统计学差异(P>0.05)。如图3-6,HGC27细胞的LV-RNAi-MYCL1组较LV-NC、Control两组克隆形成率均降低,有统计学差异(P=0.04<0.05)。

  表3-1干扰MYCL1对MGC803细胞及HGC27细胞的影响

  MGC803细胞 HGC27细胞

  组别 克隆数 克隆形成率 克隆数 克隆形成率

  Control组 112±19.79 22.4% 113.5±2.21 11.35%

  LV-NC组 60.5±16.26 12.1% 100.0±7.07 10%

  LV-RNAi-MYCL1组 44.0±5.65 8.80% 54.0±8.485 5.4%

  Control组 LV-NC组 LV-MYCL-RNAi组

  图3-3 MGC803细胞克隆形成情况 图3-4 克隆形成率

  Control组 LV-NC组 LV-MYCL-RNAi组

  图3-5 HGC27细胞克隆形成情况 图3-6 克隆形成率

  3. Transwell检测慢病毒干扰MYCL1后胃癌细胞侵袭情况

  采用Transwell实验,将MGC803细胞(2×104个)和HGC27细胞(5×104个),各分为三组,接种于已铺Matrigel胶的Corning细胞侵袭小室的上室,孵育28h后显微镜下观察穿过Transell小室的细胞数量。结果显示,两株细胞的Control组与LV-NC组相比,差异无统计学意义;LV-RNAi-MYCL1组与LV-NC组相比,细胞穿膜数显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。说明干扰MYCL1的表达可降低胃癌细胞的侵袭性。

  Control组 LV-NC组 LV-MYCL-RNAi组

  图3-7 MGC803细胞穿膜情况 (x200倍)

  Control组 LV-NC组 LV-MYCL-RNAi组

  图3-8 HGC27细胞穿膜情况 (x200倍)

  MGC803细胞各组侵袭情况的比较 HGC27细胞各组侵袭情况的比较

  4. 细胞划痕实验检测慢病毒干扰MYCL1后胃癌细胞迁移情况

  将MGC803细胞(5×105个/孔)和HGC27细胞(1×106个/孔)分别种于六孔板中,细胞融合度90%左右可进行细胞划痕。分别于划痕后0h、24h、48h拍照记录迁移情况。图3-9及图3-10分别为MGC803细胞及HGC27细胞0h、24h、48h细胞迁移情况。结果如图:对MGC803细胞,0h至24h,Control组较LV-NC组及LV-RNAi-MYCL1组迁移率高,差异有统计学意义,而LV-RNAi-MYCL1组与LV-NC组相比,差异无统计学意义;对HGC27细胞,0h至24h,三组间迁移率差异不大,无统计学意义。图3-11及图3-12分别为两株细胞从0h至24h至48h各组迁移率的比较,结果显示,48h时两株各组细胞迁移率均较24h时迁移率高,至48h时,两株细胞的Control组与LV-NC组相比,迁移率相差不大,差异无统计学意义;LV-RNAi-MYCL1组与LV-NC组相比,细胞迁移率均有不同程度下降,差异有统计学意义(P<0.05)。说明干扰MYCL1的表达可降低胃癌细胞的迁移能力。

  Control组 LV-NC组 LV-RNAi-MYCL1组

  图3-9 MGC803细胞迁移情况(x40倍)

  Control组 LV-NC组 LV-RNAi-MYCL1组

  图3-10 HGC27细胞迁移情况(x40倍)

  图3-11 MGC803细胞迁移率 图3-12 HGC27细胞迁移率

  5. 慢病毒干扰MYCL1后胃癌细胞超微结构改变

  透射电镜下观察,干扰MYCL1表达后MGC803细胞微绒毛发生改变,如图3-13所示LV-RNAi-MYCL1组细胞微绒毛突起较Control组及LV-NC组减少、变细。干扰MYCL1表达后HGC27细胞线粒体发生改变,如图3-14所示,LV-RNAi-MYCL1组细胞中线粒体嵴较Control组及LV-NC组发生改变,表现为线粒体嵴减少或消失。

  Control组 LV-NC组 LV-RNAi-MYCL1组

  图3-13 MGC803细胞MYCL1干扰前后细胞超微结构

  Control组 LV-NC组 LV-RNAi-MYCL1组

  图3-14 HGC27细胞MYCL1干扰前后细胞超微结构

  结 论

  慢病毒干扰MYCL1后感染胃癌细胞,胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力不同程度地降低了。

  慢病毒干扰MYCL1后,胃癌细胞的超微结构发生了改变。

  第四章

  MYCL1基因干扰对MGC803胃癌细胞体内成瘤实验的影响

  引言

  我们通过前述实验发现,MYCL1在胃癌组织及胃癌细胞中的表达均较非癌组织或非癌细胞表达高,通过慢病毒介导的RNAi技术干扰MYCL1表达后,胃癌细胞的侵袭、迁移等生物学行为受到抑制。本部分我们将应用慢病毒介导的RNAi技术,验证RNA干扰MYCL1表达的效果是否能在体内得以体现;观察测量移植瘤的大小及重量,从体外角度验证MGC803胃癌细胞中MYCL1的干扰表达是否影响移植瘤的生长。

  结 果

  1. 慢病毒干扰后MGC803细胞裸鼠皮下移植瘤的体重变化

  Control组、LV-NC组、LV-RNAi-MYCL1组裸鼠的皮下成瘤率均为100%,其中Control组及LV-NC组在接种第三天能摸到接种处形成绿豆大小的瘤体,而LV-RNAi-MYCL1组在第七天才能摸到瘤体。其后,LV-RNAi-MYCL1组逐渐与LV-NC组、Control组相差不大。至第20天取出瘤体时,各组瘤体肉眼观察差异不大。如图4-1。

  Control组

  LV-NC组

  LV-RNAi

  -MYCL1组

  图4-1 各组裸鼠移植瘤大小

  取出瘤体后测量各组移植瘤最大直径。用均数±标准差表示分别为Control组:1.457±0.4533,LV-NC组:1.383±0.1608,LV-RNAi-MYCL1组:1.29±0.2035。三组中两两间比较用配对样本T检验,差异无统计学意义。如表4-1。

  表4-1 各组裸鼠移植瘤大小

  组别移植瘤最大径(cm)Control组1.31.00.81.82.01.7LV-NC组1.61.21.21.51.41.3LV-RNAi-MYCL1组1.51.21.01.51.31.2取出瘤体后称重,各组移植瘤重量为Control组:1.2616±0.393,LV-NC组:0.9536±0.227,LV-RNAi-MYCL1组:0.9203±0.239。三组中两两间比较用配对样本T检验,差异无统计学意义。如表4-2。

  表4-2 各组裸鼠移植瘤重量

  组别 移植瘤重量(g)

  Control组 1.5789 1.5025 1.4895 1.3526 1.1132 0.5327

  LV-NC组 1.1982 1.1870 0.9584 0.9267 0.8667 0.5846

  LV-RNAi-MYCL1组 1.3212 1.0032 0.9601 0.8640 0.7363 0.6372

  2. Western blot检测移植瘤组织中Mycl1蛋白的表达情况

  如图4-2所示,Western Blot结果显示,在相同组不同裸鼠中Mycl1蛋白的表达量不尽相同,但总体趋势一致,即:Control组与LV-NC组相比,差异无统计学意义(P>0.05);LV-RNAi-MYCL1组与LV-NC组相比,蛋白表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。

  图4-2 移植瘤组织中Mycl1蛋白的表达情况

  图4-3 移植瘤组织中Mycl1蛋白的相对表达量

  3. real-time qPCR检测移植瘤组织中MYCL1 mRNA的表达

  通过real-time qPCR检测18只裸鼠瘤组织中MYCL1 mRNA的表达,结果如表4-3所示,与Western Blot结果一致,在相同组不同裸鼠中MYCL1 mRNA的表达量不尽相同,但总体趋势一致,各组移植瘤mRNA相对表达量用均值±标准差表示,分别为Control组:1.04±0.34644 ,LV-NC组:1.0082±0.34744,LV-RNAi-MYCL1组:0.5848±0.25562。如图4-4所示,Control组与LV-NC组相比,mRNA表达量无显著差异(P>0.05);LV-RNAi-MYCL1组与LV-NC组相比,mRNA表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。

  表4-3 各组裸鼠移植瘤mRNA表达量

  组别 2-ΔΔCT 值

  Control组 1.0000 1.5369 1.2142 1.0943 0.4931 0.9013

  LV-NC组 1.6021 1.0353 0.6417 0.7792 0.8179 1.1728

  LV-RNAi-MYCL1组 0.3560 0.6483 0.6113 0.8932 0.4569 0.3711

  图4-4 移植瘤组织中MYCL1 mRNA的相对表达量

  结 论

  慢病毒介导的MGC803胃癌细胞经MYCL1基因干扰表达后,接种到裸鼠皮下成瘤,瘤组织中MYCL1表达仍能有效下调。

  MYCL1干扰表达后,MGC803细胞接种到裸鼠皮下成瘤,最初几天(7天内)生长较对照组缓慢,但随着时间推移,最终(第20天时)瘤体体重及大小与对照组无明显差异(P>0.05),说明MYCL1对某些胃癌细胞如MGC803细胞的增殖效应不明显,与体外结果一致。

  讨 论

  本研究结果表明,MYCL1与胃癌的发生、发展密切相关,证据如下:组织学上,Mycl1蛋白在胃癌组织中的表达远高于癌旁正常胃组织,且更多地表达于低分化癌和高TNM分期癌中,Mycl1蛋白表达可以作为预测胃癌患者总生存率的独立预后因素,其阳性表达与不良预后相关。细胞学上,Mycl1蛋白在多株低分化、未分化胃癌细胞中的表达高于在高分化胃癌细胞中的表达,干扰MYCL1表达能够使胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力得到不同程度的降低。

  与MYCL家族的其它两个成员C-MYCL和N-MYCL一样,MYCL1也被认为可能是人类几个致癌过程的关键基因。MYCL1基因首次被报道在人类原发性小细胞肺癌和其它亚型肺癌细胞株中有扩增。此后,在髓母细胞瘤、Merkel细胞癌和卵巢癌等其他一些恶性肿瘤中也陆续报道有MYCL1的扩增和过表达。然而,迄今为止,对MYCL1在大多数肿瘤组织中的表达模式及其临床意义的研究尚很少,更未见及MYCL1对肿瘤细胞生物学行为影响的报道。

  本研究免疫组化结果显示,Mycl1蛋白在胃组织中的阳性表达并非是癌的特异现象,Mycl1蛋白不仅表达在胃癌组织中,也表达在非癌胃组织中。然而,前者的表达率显著高于后者(62.5% vs 46.0%,p=0.002),并且在癌组织中,即使在早期阶段,Mycl1蛋白表达的强度和面积并不弱于进展期,提示Mycl1参与了胃癌的发生。Morgenbesser等发现MYCL1的过表达直接影响了细胞的分化过程[5],Schwab等发现MYC产物的首要功能是阻止细胞的终末分化并促进增生。因此,我们相信MYCL1可能参与了胃癌细胞的恶性转化过程。这个发现也与MYCL1在肿瘤中充当“癌基因”的推测相符合。

  本研究显示,Mycl1的蛋白表达在低分化或未分化胃癌中显著高于中/高分化胃癌(组织中:71.4% vs 49.3%,p=0.003,细胞中:NCI-N87>MGC803>HGC27

  >AGS)。与早期癌相比,Mycl1更常表达于进展期癌(组织中:72.1% vs 48.6,p=0.002)。相比于中/高分化胃癌,低分化癌的细胞间粘附力更弱并拥有更强的生长优势,MYCL1可能赋予了肿瘤细胞更加侵袭性的恶性表型和转移特性。本研究采用慢病毒介导的RNAi技术成功干扰MYCL1表达后,通过Transwell实验和细胞划痕实验进一步证实MYCL1表达下调的确能够降低胃癌细胞的侵袭和迁移能力,MYCL1的高表达与胃癌的侵袭转移特性呈正相关。此结果为MYCL1作为判断肿瘤细胞生物学行为的指标提供了实验依据和理论支持。

  本研究还发现,Mycl1蛋白的表达率在年轻患者(≤64岁)中高于年长患者(>64岁;73.4% vs 53.6%,p=0.007),这部分解释了为什么胃癌在年轻人中较老年人进展更快的原因。此外,本研究结果显示,除了肿瘤分化和TNM分期,Mycl1表达是预测胃癌总生存率的独立预后指标(HR=3.785,,95%CI1.158-4.108,p=0.009);Mycl1表达阳性较阴性的患者显示了更差的临床预后(p<0.001)。综上所述,我们有理由相信,Mycl1极有可能是潜在的胃癌治疗靶点和判断预后的指标,对处于早期但Mycl1表达阳性的胃癌患者手术后加强辅助治疗是非常有必要的。

  在本研究中,慢病毒干扰MYCL1表达后,MGC803及HGC27两种胃癌细胞的侵袭和迁移能力均降低了,但体内和体外实验均证实,下调MYCL1仅对HGC27细胞的增殖能力产生影响,对MGC803细胞的增殖并未产生明显效应,这说明肿瘤细胞的增殖能力与侵袭、迁移能力并不完全成正比,这可能与肿瘤演进过程中发生的异质性现象有关。

  透射电镜下观察慢病毒干扰MYCL1表达的MGC803细胞,与对照组比较,发现细胞表面微绒毛突起减少、变细。微绒毛突起的形成与细胞伪足以及细胞皱褶等的形成原因类似,均是为适应细胞的趋化、迁移等的作用而做出的形态学改变,结合前述MYCL1对胃癌细胞生物学行为的影响,我们推测MYCL1可能参与了胃癌演进过程中癌细胞内的骨架重构,从而影响了癌细胞的侵袭和迁移,具体机制还有待进一步研究。透射电镜下观察慢病毒干扰MYCL1表达的HGC27细胞,与对照组比较,发现细胞内线粒体嵴数量减少或消失。线粒体嵴是线粒体内膜向线粒体基质折褶形成的一种结构,承担着复杂的生化反应。线粒体嵴上有许多线粒体基粒,基粒中含有的ATP合酶促进了能量ATP的合成。需要较多能量的细胞,线粒体嵴的数目一般也较多。线粒体嵴减少或消失,意味着细胞代谢能力下降,细胞功能减弱。电镜下的超微结构改变,一定程度上为MYCL1促胃癌细胞侵袭、迁移的生物学特性提供了形态学证据。

  动物学实验结果表明,慢病毒介导的RNAi技术在裸鼠体内也成功干扰了MYCL1基因的表达,但遗憾的是,HGC27细胞在慢病毒感染后成瘤能力明显减弱,无法在体内进一步观察MYCL1改变对其增殖的影响。此外,MYCL1在胃癌侵袭转移中的效应尚未在体内得到证实,建立MYCL1干扰前后胃癌细胞裸鼠体内转移模型以深入研究是下一步工作的方向。

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