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儿科医学中家族性热性惊厥SCN1A单核苷酸多态性分析论文

2018-12-11 16:16:09来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要

  研究目的与背景:家族性热性惊厥(family febrile seizures,FS)是儿科常见的一类特殊的癫痫综合征,欧美国家的发病率为2%-5%,亚洲地区则更高。家族性FS的发病机制尚不清楚,研究证实遗传因素参与其发病,自1996年以来,共相继报道了12个家族性FS易感基因座,表明家族性FS该具有明确的遗传异质性。

  SCN1A基因是与癫痫综合征相关的最重要的基因之一,通过检索SCN1A基因突变数据库,迄今为止约发现900多种与癫痫综合征相关的基因突变。有关SCN1A基因单核甘酸多态性(singe nucleotide polymorphisms,SNP)与家族性FS相关性的报道并不少见,报道最多的是rs3812718和rs2298771多态性,研究结果不一致。前期研究中对皖北地区8个汉族人群家族性FS家系成员SCN1A基因测序,共发现32个SNP,包括与FS报道最多的rs3812718(IVS5N+5G>A)多态性。本研究拟进一步扩大家族性FS的样本量,在国内首次开展皖北地区汉族人群家族性FS与SCN1A基因SNP的相关性研究,这对进一步完善家族性FS的遗传学发病机制具有重要意义,并有望为家族性FS的防治提供新的线索。

  方法:收集2013年1月~2015年12月在蚌埠医学院第一附属医院儿科就医的有家族史的FS患儿为研究对象,FS患儿的诊断参照国际抗癫痫联盟(ILAE)关于FS的定义,排除有神经系统发育异常和或智力低下的患儿。通过询问FS先证者家族史,筛选热性惊厥家系,绘制家系图谱。参加本次研究的患儿父母均签署之情同意书。采集家系中所有FS患病成员静脉血,提取全血基因组DNA,采用iMLDR多重SNP分型技术进行目标SNP检测。同期纳入100名健康的同年组儿童作为正常对照。分析SCN1A基因SNP基因型和等位基因频率在病例组与正常对照人群分布的差异性。

  结果:共纳入18个FS家系,收集FS患者33例,其中男性19例,女性14例,表型为CFS,发作类型为全面性强直-阵挛性发作。通过对33例FS患者SCN1A基因目标SNP进行基因分型,我们发现rs3812718多态性位点突变型等位基因频率在病例组中为56.06%,对照组中为50.50%,rs7580482、rs6432860、rs2298771多态性位点突变型等位基因频率95.45%,对照组中为88.00%。突变型等位基因频率在病例组与对照组中无明显差异。SNPs的基因型与基因频率在病例组与对照组中卡方检验结果示P值均大于0.05,无统计学差异。利用单倍型分析软件PHASE2.1构建和分析目标SNPs的单倍型,共得出2个单倍型,分别为单倍型1(ACG)和单倍型2(GTA),卡方检验结果示P值为0.0821>0.05,差异无统计学意义。

  结论:通过对18个家族性FS家系33名患者与100名正常对照的SCN1A基因SNPs分析,我们得出以下结论:(1)SCN1A基因SNP(rs3812718、rs7580482、rs6432860、rs2298771)不是中国皖北地区汉族人群家族性FS发病危险因素。(2)SCN1A基因SNPs(rs7580482、rs6432860、rs2298771)单倍型ACG、GTA与中国皖北地区汉族人群家族性FS发病无关。

  【关键词】家族性热性惊厥电压门控钠离子通道a1亚单位基因单核苷酸多态性

  前言

  1.热性惊厥与遗传因素有关

  热性惊厥(Febrile seizures,FS)是幼儿时期最常见的惊厥性疾病,由于具有不同临床特征的FS发作,其预后存在明显的不同,因此,按临床特征的不同,将FS分为简单性性热性惊厥(simple febrile seizure,SFS)和复杂性热性惊厥(complex febrile seizure,CFS)。国际抗癫痫联盟(The International League Against Epilepsy,ILAE)于1993年将FS定义为:发生于年龄大于1个月的小儿惊厥样发作,通常由热性疾病而不是中枢神经系统感染引起,既往无新生儿癫痫或自发性癫痫,也不符合急性症状性癫痫(Acute symptomatic seizures)的诊断标准。FS患儿中男性患者被一致认为占更高比例(男性:女性1.1:1-2:1),然而一些大型研究认为其发病没有性别差异。FS有2个发病高峰时期:11月至1月多见于上呼吸道病毒感染,6月至8月多见于消化道病毒感染。其好发年龄通常为6个月至3岁之间,发病高峰年龄为1岁6月。大约25%~40%的热性惊厥患儿有家族史,亲属受累越多,发病风险越高。如果父母患有FS,则其后代FS的患病率为10%~25%,兄弟姐妹中患有FS,发病率为10%,父母及兄弟姐妹中均有FS患者,其发病率高达50%。流行病学调查显示热性惊厥更频繁的发生在亚洲人群中,日本儿童的发病率为3.4%~9.3%,印度儿童的发病率为5%~10%,而欧美国家儿童的发病率只有2%~5%,关岛发病率最高为14%。大多数FS患儿预后良好,但是有研究报道,FS患儿相对于一般健康儿童,其将来转变为癫痫的风险升高了5-7倍,因此,FS存在潜在的远期进展为癫痫的危害性。目前已有很多文献报道了FS与遗传因素有关,群体普查、家系分析及双生子研究都证实了FS的遗传倾向。日本学者Fukuyama等[6]共纳入307例FS患儿(131例SFS患儿和176例CFS患儿)进行遗传学分析,结果得出FS的遗传易感性约为76%,提示FS有明显的遗传倾向性。有关双生子的遗传研究也支持遗传易感性在FS发生中发挥重要作用,在以进行的双胎儿研究中,有文献报道同卵双胎儿和异卵双胎儿的同病的一致率为0.44-0.69和0.13-0.14。然家族性FS的遗传方式依然不能确定,常染色体显性伴不完全外显率或常染色体隐性都有报道。

  2.家族性热性惊厥相关致病基因

  家族性FS是儿科常见的一类特殊的癫痫综合症[8]。家族性FS的遗传学研究已取得巨大进展,有研究表明其为多基因复杂性疾病,是多基因异质性疾病没有单一的遗传方式。检索在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM),迄今为止共报道12个FS易感基因位点,分别为FEB1-FEB11,表明家族性FS是高度遗传异质性疾病。其中SCN1A、SCN9A、GPR98、GABRG2、CPA6分别为家族性FS FEB3A、FEB3B、FEB4、FEB8和FEB11的致病基因。

  3.家族性热性惊厥与SCN1A基因单核甘酸多态性的相关性

  电压门控钠离子通道a1亚单位基因(voltage-gated sodium channel1-subunit gene,SCN1A)由Baulac和Moulard于1999年定位于染色体2q24.3,含有26个外显子,基因组DNA全长91480 bp,编码电压门控钠离子通道a1亚单位(NaV1.1)。电压门控钠离子通道由一个a亚基和多个辅助β亚基组成,α亚基是电压门控钠离子通道的功能性亚单位,相对分子量260000,它由4个高度保守的同源跨膜结构域(DI~DIV)组成,形成中心孔道样结构;每一个跨膜结构域均由6个α螺旋跨膜片段(S1~S6)构成,其中S4片段的氨基酸序列高度保守,研究认为S4片段是钠离子通道的电压感受器。连接片段S5和S6片段的发卡样结构称为P环,决定了钠离子通道的选择性和传导性,参与介导动作电位的去极化过程。β亚基是单一的跨膜片段,分子量33000~36000,通常认为是辅助性亚基,具有调节α亚基表的达及功能的特性,β亚基可以通过改变动作电位兴奋性、调节钠通道失活过程,进而调控α亚基的功能。

  电压门控钠离子通道,是引起动作电位的基本单位,编码电压门控钠离子通道a1亚单位的基因突变是引起癫痫综合征最常见的基因突变之一,被称为超级罪犯基因,迄今为止大约有900多种不同的突变被报道。意大利学者对一个四代FS家系进行SCN1A基因突变筛查,包括12例简单型FS患者,结果发现SCN1A基因第1跨膜结构域的第1α螺旋跨膜片段(DIS1)存在一个错义突变c.434T>C(p.Met145Thr),表明家族性FS与SCN1A基因突变有关。前期实验中,对皖北地区8个汉族人群家族性FS家系成员进行了SCN1A测序分析,首次报道SCN1A基因c.2650G>A(p.Gly884Ser)错义突变,进一步证实了家族性FS与SCN1A基因突变有关。此外,一些位于编码区或非编码区的单核苷酸多态性位点(singe nucleotide polymorphisms,SNP)引起的钠通道蛋白的变化也可能是FS的发病原因之一。

  SNP是个体之间最简单的DNA变异,定义为基因组水平上由单个核苷酸(A,腺嘌呤;T,胸腺嘧啶;C,胞嘧啶;G,鸟嘌呤)的变异所引起的DNA序列多态性,这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起,也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。从碱基突变发生频率而言,基因组中,群体的SNP最小等位基因频率(minor allele frequency)至少>0.01,通常将0.01作为SNP和突变的分界点。据估计人类基因组中每500-1000个碱基中就有1个SNP,迄今已发现了300万个SNP或更多。约50%的SNP位于基因编码区(coding regions),后者中约25%为同义SNP(synonymous SNP),其碱基的改变并不造成氨基酸的改变,25%为非同义SNP(non-synonymous SNP),即碱基的突变造成氨基酸的改变,从而改变蛋白质的功能,导致其蓝本编码蛋白质生物学性状变化的直接因素。SNP为第三代DNA遗传标记,SNP具有数量多、分布广泛、适于快速规模化筛查等优点,它一出现就很快应用于多基因遗传的复杂性疾病的统计学研究。SNP可以解释个体之间多样性、基因组进化、一些常见的家族性状(如卷发)、对药物反应的个体差异性,以及对一些常见疾病如糖尿病、肥胖、高血压、精神疾病的易感性,也可能影响基因启动子的转录活性、mRNA的稳定性、改变其编码蛋白质生物学形状,由此引起相关疾病的发生。SCN1A基因SNP与家族性FS的相关性文献报道较多。与癫痫或FS相关性报道最多的是rs3812718和rs2298771单核苷酸多态性,研究结果并不一致。

  我们前期对皖北地区8个汉族人群家族性FS家系成员进行了SCN1A测序分析,共发现了32个SNP,3个SNP位于外显子区,为编码SNP,分别为rs7580482多态性、rs6432860多态性和rs2298771多态性,剩余均为非编码SNP,其中包括与FS相关性报道最多的rs3812718多态性。本研究拟进一步扩大家族性FS的样本量,探讨中国皖北地区汉族人群家族性FS与SCN1A基因SNP的相关性,以期发现家族性FS SCN1A基因致病性或保护性SNP位点。

  资料与方法

  一.研究对象

  本次研究为病例-对照研究,以2013年1月~2015年12月间在蚌埠医学院第一附属医院就诊的年龄为6个月至6岁有FS患儿为研究对象,FS的诊断参照ILAE的定义。排除有神经系统发育异常和或智力低下的患儿。所有研究对象均为汉族。通过询问FS先证者家族史,筛选FS家系。参加本次研究的患儿父母均签署之情同意书。纳入100名同年龄组健康儿童作为对照组。

  采集家系中所有FS患病成员静脉血1-2 ml,置入枸橼酸钠抗凝试管中。

  二.国际生物学信息途径

  2.1美国国立生物技术信息中心单核苷酸多态性数据库

  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/

  2.2 HapMap数据库

  http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/

  2.3点突变预测软件

  Polyphen-2:http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml

  Sorting Intolerant From Tolerant(SIFT):http://sift.jcvi.org

  2.4测序结果分析软件:GeneMapper 4.1

  2.5连锁不平衡分析软件:Haploview软件

  2.6单倍型分析软件:PHASE2.1软件

  三.实验方法

  3.1家系调查:询问FS先证者的家族史,筛选FS家系,收集患病成员的信息(性别、首次发作年龄、发作次数、末次发作年龄、发作类型等),绘制家系图谱。采集所有患病成员静脉血2 ml用于提取全血基因组DNA,采用基因型分型方法检测对SCN1A基因目的单核甘酸多态性。

  3.2提取全血基因组DNA:采用天根生化科技(北京)有限公司提供的血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型),步骤如下。

  取全血300ul,至于1.5mlEP管中,加入500ul的细胞裂解液CL,颠倒混匀数次,充分裂解,10,000 rpm离心1 min,弃去上层液,重复上一裂解步骤。加入200µl缓冲液GS,振荡至彻底混匀。

  (2)加入4ul RNA酶(100mg/ml),振荡15s,室温放置5min(减少RNA对结果产生的影响)。

  (3)加入20l蛋白酶K溶液,上下颠倒,充分混匀。

  (4)加入200l缓冲液GB,充分混匀,恒温加热器中56℃放置10 min,期间颠倒混匀数次直至溶液变为清亮。

  (5)加入200l无水乙醇,充分颠倒混匀。

  (6)将上一步骤所得加入吸附柱CB3(吸附柱CB3放入收集管中),12,000 rpm离心30 s,丢弃收集管中的废液。

  (7)向吸附柱CB3中加入500l缓冲液GD(已加入无水乙醇稀释),12,000 rpm离心30 s,丢弃收集管中的废液。

  (8)向吸附柱CB3中加入600l漂洗液PW(已加入无水乙醇稀释),12,000 rp离心30 s,丢弃收集管中的废液。

  (9)重复上一步骤。

  (10)12,000 rpm离心2 min,倒掉废液,将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干残余的漂洗液。

  (11)将吸附柱CB3转入一个新的1.5 ml Ep管中,向吸附膜中间位置悬空滴加洗脱缓冲液TB 70l,室温放置5 min,之后12,000 rpm离心2 min,将溶液收集到离心管中。

  (12)紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度与纯度,测定结果标注在Ep管盖上,将DNA置于冰箱中-20℃保存备用。

  3.3琼脂糖凝胶电泳鉴定:以0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组DNA,具体步骤如下。

  制胶:称取琼脂糖0.24 g,置于锥形瓶中,加入30 ml 0.5×TBE(稀释TBE),微波炉中加热煮沸,适当摇匀,防止爆沸,直至琼脂糖充分融化,无气泡。

  染色:加入4ul溴化乙锭(ethidium bromide,EB),充分混匀至色泽均匀,置于室温冷却。

  (3)胶板制备:清洗制胶模具,室温晾干,玻璃板封闭胶板,插入梳子。将冷却的凝胶液倒入制胶槽中。使凝胶液缓慢均匀展开,直到整个制胶槽表面形成胶层,室温下静置直至凝胶凝固,垂直轻拔梳子,避免破坏加样孔周围凝胶面。将凝胶及胶托放入电泳槽正中央,胶孔方向朝向负极,添加一定量的0.5×TAE电泳缓冲液至刚好将凝胶淹没。

  (4)加样:取4l DNA加入1l 5×DNA loading Buffer,在parafilm上充分混匀。将混合样品垂直加入加样孔中。在一侧加样孔中加入5l DNA marker。

  (5)电泳:盖上电泳槽盖,设置电泳参数,电压120V,电流400mA,时间30min。接通电源,开始电泳。

  (6)凝胶成像:切断电源,取出凝胶,置于凝胶成像仪上,拍照并保存。

  3.4单核甘酸多态性检测

  单核甘酸多态性的检测采用上海天昊生物公司的多重聚合酶链-连接酶检测反应技术(improved multiple ligase detection reaction,iMLDR)。用于SCN1A基因四个目标的SNP的基因分型。iMLDR技术是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别,是检测SNP的一种常见方法,提高了基因分型数据的准确性和成功率,成功率高达98%。每个SNP的等位基因是由不同的等位基因荧光标记区分寡核苷酸探针。

  图1 iMLDR技术基因分型原理图

  3.4.1具体操作步骤如下:

  稀释样本DNA:采用1μl 1%琼脂糖(agarose)凝胶电泳对其DNA样本进行浓度估计,然后将其稀释到工作浓度,即10ng/μl。

  2)多重PCR反应:

  PCR引物:见表1

  表1 SCN1A基因SNP多重PCR引物序列及扩增片段长度

  SNPsPCR引物(5’-3’)片段长度(bp)rs3812718FP:AATCGTCTTCAATGCTCGGAGAAC236RP:TTTTTCAGCTCTTCGCACTTTCAGrs7580482FP:AAAGGTCAGTGCCATGAGACAGG231RP:GCTGCTGGGAAAACGTACATGArs6432860FP:GCACATTATTGAAATGGTCCGTCATT227TCTAGAACTTGAAGAATCCAGGCAGAArs2298771FP:TTTCAACACTGCTGCCAGTTCC285RP:ACCTTGCAGCCACTGATGATGA

  PCR反应体系:

  总体积为20μl,包含1x HotStarTaq buffer,3.0mM Mgcl2,0.3mM脱氧核糖核苷三磷酸,1 U HotStarTaq polymerase,1µl样本DNA和1µl PCR引物。

  PCR循环程序

  共分为四个步骤,第一步:95℃预变性2 min,94℃变性20 s。第二步:62℃退火40 s,72℃延伸l.5min,以后每个循环的退火温度依次降低0.5℃,直至57℃,共有11个循环。第三步:94℃变性20 s,59℃退火30 s,72℃延伸l.5 min,共有24个循环。第四步:72℃延伸2 min,反应终止后置4℃保存。

  多重PCR产物纯化

  取10ul PCR产物,加入5U虾碱酶(SAP,Shrimp Alkaline Phosphatase)和2U核酸外切酶(Exonuclease I),37ºC加热1小时,75ºC灭活15分钟。

  4)连接反应

  a)反应体系:连接缓冲液1ul、高温连接酶0.25ul、5’连接引物混合液(1µM)0.4ul,3’连接引物混合液(2µM)0.4ul、纯化的PCR产物2ul、去离子水(ddH2O)6ul充分混匀。

  b)连接引物:

  表2 SCN1A基因iMLDR检测技术PCR连接引物序列

  SNP连接引物rs3812718P1:FC:TTCCGCGTTCGGACTGATATAGGTACAAAGAGCCTATCCTTTACTCTAATCACATCP2:FT:TACGGTTATTCGGGCTCCTGTAGGTACAAAGAGCCTATCCTTTACTCTAATCACGTTFP:TTACCTGGAATTACMGAAATAGTTTTCArs7580482P1:FC TTCCGCGTTCGGACTGATATGTAGAATGAGCCCAAGAAAATGACCTACP2:FT:TACGGTTATTCGGGCTCCTGTGTAGAATGAGCCCAAGAAAATGACCCATFP:ACAAAAAATATCATGTACGTTTTCCCAGrs6432860P1:FG:TCTCTCGGGTCAATTCGTCCTTCAGGTCAACAAATGGGTCCATGACGP2:FA:TGTTCGTGGGCCGGATTAGTCAGGTCAACAAATGGGTCCATGACAFP:ACCAGGTTGACAACATGTTTCACTTTTTTTTTTTTTTTTTTrs2298771P1:RT:TGTTCGTGGGCCGGATTAGTACAAGAAAGACAGTTGTATGTCCAATCATAGAAP2:RC:TCTCTCGGGTCAATTCGTCCTTACAAGAAAGACAGTTGTATGTCCAATCATAGAGFP:RP CAGAAATTGGGAAAGATCTTGACTATCTT注:P1、P2为特异性连接引物,FP为通用连接引物。

  c)连接程序:

  94ºC预变性1min,56ºC延伸4分钟,共38个循环。反应终止后置于4ºC保存。

  5)连接产物上ABI3730XL测序仪

  取0.5μl的连接产物,与0.5μl Liz500分子量内标,9μl甲酰胺(Hi-Di)充分混匀,95ºC变性5分钟,使用ABI3730XL测序仪进行测序

  6)用GeneMapper 4.1分析原始数据。

  结果

  一.家系调查结果

  共收集到18个家族性FS家系,FS家系图谱见图2。家系1(Family 1)、家系10(Family 10)为连续3代发病,考虑其遗传方式为常染色体显性遗传。家系6(Family 6)先证者(F6)双亲不是FS患者,姑姑为FS患者,遗传方式可能为常染色体隐性遗传。共有收集33例FS患者,其中男性19例,女性14例,表型均为典型的SFS,发作类型为全面性强直--阵挛性发作(Generalized tonic-clonic seizures,GTCS),有短暂意识丧失但很快恢复,均无中枢神经系统感染病史及头部外伤史、电解质紊乱,无神经系统发育异常和或智力低下。18个FS家系患者FS首次发作年龄为2-4岁,中位年龄3岁。家系成员无近亲婚配史,所有家系中先证者均进行了脑电图,头颅CT或脑脊液检查,结果未见明显异常。所有FS家系均跨越3代,除了家系1(Family 1)、家系10(Family 10)外,其余家系的第一代FS病史询问不清,其是否为FS患者的信息未知。33例FS患者相关临床资料见表3。

  图2 18个家族性FS33名患者的家系图谱

  表3 18个热性惊厥家系33例患者的临床资料

  家系编号性别就诊年龄FS首发年龄FS末发年龄发作类型临床表型脑电图头颅CT脑脊液检查1Ⅲ-1(F1)男1岁9月1岁4月–GTCSSFSN/AN/A正常Ⅲ-2(F1S)女12岁2岁4岁GTCSSFS正常正常正常Ⅱ-3(F1F)男30岁2岁2岁GTCSSFSN/AN/AN/A2Ⅲ-1(F2)男2岁8月2岁5月–GTCSSFS正常正常正常3Ⅲ-1(F3)男4岁4岁–GTCSSFS正常N/AN/A4Ⅲ-1(F4)男2岁1岁5月–GTCSSFS正常N/AN/AⅡ-3(F4F)男28岁4岁4岁GTCSSFSN/AN/AN/A5Ⅲ-1(F5)男2岁2岁–GTCSSFS正常N/AN/A6Ⅲ-1(F6)女1岁3月1岁3月–GTCSSFS正常正常正常7Ⅲ-1(F7)男2岁2岁–GTCSSFS正常正常正常8Ⅲ-1(F8)男2岁4月2岁4月–GTCSSFS正常正常N/A9Ⅲ-1(F9)男5岁2岁–GTCSSFS正常正常正常Ⅱ-1(F9F)男32岁2岁6月4岁GTCSSFSN/AN/AN/A10Ⅲ-1(F10)男9岁7月6岁GTCSSFS正常正常正常Ⅱ-2(F10M)女39岁2岁6岁GTCSSFSN/AN/AN/AⅠ-2(F10MM)女66岁2岁5月6岁GTCSSFSN/AN/AN/A11Ⅲ-1(F11)女4岁4岁-GTCSSFS正常正常正常Ⅱ-1(F11F)男30岁3岁3岁GTCSSFSN/AN/AN/A12Ⅲ-2(F12)男10月10月-GTCSSFS正常正常正常Ⅲ-1(F12S)女5岁2岁6月-GTCSSFS正常正常N/AⅡ-2(F12M)女26岁2岁2岁GTCSSFSN/AN/AN/A13Ⅲ-1(F13)男2岁2岁-GTCSSFS正常正常正常Ⅱ-1(F13F)男29岁2岁6月-GTCSSFSN/AN/AN/A14Ⅲ-1(F14)男4岁1岁6月-GTCSSFS正常正常正常Ⅱ-2(F14M)女29岁2岁4岁GTCSSFSN/AN/AN/A15Ⅲ-1(F15)女2岁1岁-GTCSSFS正常正常正常Ⅱ-2(F15M)女25岁2岁6月4岁GTCSSFSN/AN/AN/A16Ⅲ-1(F16)女7月7月-GTCSSFS正常正常正常Ⅱ-1(F16F)男28岁2岁2岁GTCSSFSN/AN/AN/A17Ⅲ-2(F17)女1岁5月1岁5月-GTCSSFS正常正常正常Ⅱ-1(F17F)男30岁2岁2岁GTCSSFSN/AN/AN/A18Ⅲ-1(F18)女1岁2月1岁2月-GTCSSFS正常正常正常Ⅱ-2(F18M)女24岁2岁2岁GTCSSFSN/AN/AN/A

  二.全血基因组DNA提取结果

  所有提取的基因组DNA均经紫外分光光度计测定纯度和浓度,纯度即OD(optical density)值,OD值在1.69-1.88之间,浓度均高于50 ng/l,经0.8%琼脂糖凝胶电泳验证,条带清晰,无降解(图3),符合实验要求。

  图3部分标本全血基因组DNA 0.8%琼脂糖凝胶电泳图编号1,2,3,4,5,6,7为随机抽取的部分病例标本全血基因组DNA。分子量标准为λDNA hindⅢMarker,包含7个长度不等的条带,分别是23130 bp,9416 bp,6557 bp,4361 bp,2322 bp,2027 bp,564 bp

  三.基因型分型结果

  采用上海天昊生物公司提供的iMLDR技术及该公司的imLDRTM多重SNP分型试剂盒对基因组DNA进行SCN1A基因SNP位点分型。

  3.1 SCN1A基因4个SNP基因分型信息表见下

  表4 4个SNP基因分型信息表

  SNPA 1A 2F1L1F2L2A1_SizeA2_SizePOS.(A1)POS.(A2)rs7580482CTFAM48VIC49979893.4695.83rs2298771CTNED55PET53105103102.04104.63rs3812718CTFAM56VIC57105106102.26104.42rs6432860GANED47PET45109107106.79109.39注:从以上SNP基因分型信息表中可以看出,SNP基因分型的关键信息为一个是毛细管电泳位置(POS),一个是荧光基团颜色;从上表中可以看到位置在93.46~95.83是rs7580482位点,而蓝色峰代表C等位基因,绿色峰代表T等位基因,那么在这个位置上,出现一种颜色,则为纯合子(只出现蓝色峰为CC纯合,只出现绿色峰为TT纯合),两个颜色峰都出现则为CT杂合子;以此类推位于102.04~104.63/102.26~104.42是rs2298771以及rs3812718位点,102的位置处黑色峰(标记为黄色,峰图显示为黑色)代表rs2298771的C等位基因,蓝色峰代表rs3812718的C等位基因,104位置处红色峰代表rs2298771的T等位基因,绿色峰代表rs3812718的T等位基因,从而依据该位置是否有峰以及峰的颜色判断基因型;同样rs6432860位点的判断也是如此。

  3.2 DNA样本电泳峰型图。

  rs6432860

  rs2298771 rs3812718

  rs7580482

  图4 DNA样本毛细管电泳峰型图,rs7580482位点位置处存在蓝绿两种峰,则为CT杂合;rs2298771位置处出现黑红两种峰则为CT杂合;rs3812718位置处只出现了蓝色峰,没有绿色峰则为CC纯合;rs6432860位置处出现了黑红两种峰则为GA杂合

  rs6432860

  rs2298771

  rs3812718

  rs7580482

  图5 DNA样本毛细管电泳峰型图,rs7580482位点位置处存在蓝绿两种峰,则为CT杂合;rs2298771位置处出现黑红两种峰则为CT杂合;rs3812718位置处出现了蓝绿两种峰则为CT杂合;rs6432860位置处出现了黑红两种峰则为GA杂合

  3.3 18例家族性FS 33例患者SCN1A基因4个SNP的基因型和等位基因分布

  33例患者4个SNP中,rs3812718多态性突变型等位基因频率为56.10%,rs7580482、rs6432860、rs2298771多态性突变型等位基因频率均为95.45%,具体数据见下表。

  表5 33例家族性FS患者SCN1A基因4个SNP的基因型和等位基因分布

  Simple nameSNP rs3812718

  g.25606G>ASNP rs7580482

  g.31705A>GSNP rs6432860

  g.37286T>CSNP rs2298771

  g.42362G>AGenotype AlleleGenotype AlleleGenotype AlleleGenotype AlleleGAAGTCGAF1G/GGG/GGC/CCA/AAF1FG/AGAG/GGC/CCA/AAF1SG/GGG/GGC/CCA/AAF2A/AAG/GGC/CCA/AAF3G/AGAG/GGC/CCA/AAF4G/GGG/GGC/CCA/AAF4FG/GGG/GGC/CCA/AAF5G/AGAG/GGC/CCA/AAF6G/GGG/GGC/CCA/AAF7A/AAG/GGC/CCA/AAF8G/GGG/GGC/CCA/AAF9A/AAG/GGC/CCA/AAF9FG/AGAG/GGC/CCA/AAF10G/AGAG/GGC/CCA/AAF10MG/AGAA/GAGT/CTCG/AGAF10MMA/AAG/GGC/CCA/AAF11G/AGAG/GGC/CCA/AAF11FG/AGAG/GGC/CCA/AAF12G/AGAG/GGC/CCA/AAF12MG/AGAG/GGC/CCA/AAF12SG/AGAG/GGC/CCA/AAF13A/AAG/GGC/CCA/AAF13FA/AAG/GGC/CCA/AAF14G/AGAG/GGC/CCA/AAF14MA/AAG/GGC/CCA/AAF15A/AAG/GGC/CCA/AAF15MG/AGAA/GAGT/CTCG/AGAF16A/AAG/GGC/CCA/AAF16FG/AGAG/GGC/CCA/AAF17A/AAG/GGC/CCA/AAF17FG/AGAA/GAGT/CTCG/AGAF18G/AGAG/GGC/CCA/AAF18MG/AGAG/GGC/CCA/AAAllele frequency(%)43.9056.104.5495.454.5495.454.5495.45注:Genotype基因型;Allele等位基因;Allele frequency等位基因频率。

  四.统计学分析结果

  4.1.病例组和对照组SCN1A基因4个SNP哈迪-温伯格平衡检验

  病例组和对照组SNP基因型分布均符合哈迪-温伯格平衡(P>0.05),见表6。提示病例组和对照组SNP基因型分布能分别代表家族性热性惊厥患儿和非家族性热性惊厥幼儿。

  表6病例组与对照组SCN1A基因cSNP哈迪-温伯格平衡检验

  SNPGroupGenotype and genotype frequency2P-Valuers3812718G/GG/AA/A(g.25606G>A)Case6(0.1818)17(0.5152)10(0.3030)0.06880.7931Control22(0.2200)55(0.5500)23(0.2300)1.00220.3168rs7580482A/AA/GG/G(g.31705A>G)Case0(0.0000)3(0.0909)30(0.9091)0.07480.7844Control2(0.0200)20(0.2000)78(0.7800)0.28120.5969rs6432860T/TT/CC/C(g.37286T>C)Case0(0.0000)3(0.0909)30(0.9091)0.07480.7844Control2(0.0200)20(0.2000)78(0.7800)0.28120.5959rs2298771G/GG/AA/A(g.42362G>A)Case0(0.0000)3(0.0909)30(0.9091)0.07480.7844Control2(0.0200)20(0.2000)78(0.7800)0.28120.5959

  4.2.病例组和对照组SCN1A基因4个SNP基因型和等位基因频率比较

  统计分析采用SPSS19.0软件进行统计分析,采用卡方检验方法分别比较病例组与对照组的4个多态位点的基因型频率及等位基因频率,P值<0.05有统计学意义,具体结果见表7、表8。SCN1A基因rs3812718多态性位点,基因型在病例组分布为GG型(野生型纯合子)6例,GA型(突变型杂合子)17例,AA型(突变型纯合子)10例,突变型等位基因A的频率为56.06%;对照组中,基因型在病例组分布为GG型22例,GA型55例,AA型23例,突变型等位基因A的频率为50.50%;FS病例组与对照组的卡方检验的结果为2=0.091,P=0.762,无统计学差异。SCN1A基因rs7580482多态性位点,病例组中基因型分布为GG型(突变型纯合子)30例,AG型(突变型杂合子)3例,未见AA(野生型纯合子)基因型,突变型等位基因G的频率为95.45%;对照组中rs7580482多态性基因型分布为GG型78例,AG型20例,AA型2例,突变型等位基因G的频率为88.00%;FS病例组与对照组的卡方检验的结果为2=2.262,P=0.133,无统计学差异。SCN1A基因rs6432860多态性位点,病例组中基因型分布为CC型(突变型纯合子)30例,CT型(突变型杂合子)3例,未见TT(野生型纯合子)基因型,突变型等位基因C的频率为95.45%;对照组中rs7580482多态性基因型分布为CC型78例,CT型20例,TT型2例,突变型等位基因C的频率为88.00%;FS病例组与对照组的卡方检验的结果为2=2.262,P=0.133,无统计学差异。SCN1A基因rs2298771多态性位点,病例组中基因型分布为AA型(突变型纯合子)30例,GA型(突变型杂合子)3例,未见GG(野生型纯合子)基因型,突变型等位基因A的频率为95.45%;对照组中rs7580482多态性基因型分布为AA型78例,GA型20例,GG型2例,突变型等位基因A的频率为88.00%;FS病例组与对照组的卡方检验的结果为2=2.262,P=0.133,无统计学差异。

  表7病例组与对照组SNP基因型的2检验

  SNPGroupGenotype and genotype frequency2P-Valuers3812718G/GG/AA/A(g.25606G>A)Case6(0.1818)17(0.5152)10(0.3030)0.7610.684Control22(0.2200)55(0.5500)23(0.2300)rs7580482A/AA/GG/G(g.31705A>G)Case0(0.0000)3(0.0909)30(0.9091)2.877*0.237Control2(0.0200)20(0.2000)78(0.7800)rs6432860T/TT/CC/C(g.37286T>C)Case0(0.0000)3(0.0909)30(0.9091)2.877*0.237Control2(0.0200)20(0.2000)78(0.7800)rs2298771G/GG/AA/A(g.42362G>A)Case0(0.0000)3(0.0909)30(0.9091)2.877*0.237Control2(0.0200)20(0.2000)78(0.7800)

  表8病例组与对照组SNP基因频率的2检验

  SNPGroupGene frequency2P-ValueOR(95%CI)rs3812718GA(g.25606G>A)Case29(0.4394)37(0.5606)0.0910.7621.096Control99(0.4950)101(0.5050)(0.606-1.983)rs7580482AG(g.31705A>G)Case3(0.0454)63(0.9545)2.2620.133*0.349Control24(0.1200)176(0.8800)(0.102-1.200)rs6432860TC(g.37286T>C)Case3(0.0454)63(0.9545)2.2620.133*0.349Control24(0.1200)176(0.8800)(0.102-1.200)rs2298771GA(g.42362G>A)Case3(0.0454)63(0.9545)2.2620.133*0.349Control24(0.1200)176(0.8800)(0.102-1.200)

  OR,odds ratio,比值比;95%CI,confidence interval,95%可信区间;Genotype,基因型;Case group,病例组;Control group,对照组;*,连续校正2检验;

  4.3.SNPs单倍型分析

  确认目标SNPs位于同一个连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD)区域

  为明确SCN1A基因SNP单倍型与FS之间的关系,拟利用目标SNPs(rs3812718、rs7580482、rs6432860、rs2298771)构建单倍型,在构建SNP单倍型之前须明确上述4个SCN1A基因SNP是否属于一个连锁不平衡区域,通过检索HapMap数据库,将中国汉族人群(CHB)上述4个SNPs的等位基因数据输入haploview 4.2软件,结果显示rs7580482、rs6432860、rs2298771同属一个连锁不平衡区域,即目标SNPs联合遗传的频率明显高于预期的随机频率,结果表明以上3个SNPs可以进行单倍型分析,见下图5。

  图6 haploview 4.2软件分析示rs7580482、rs6432860、rs2298771均属于Block1区,距离为10kb。

  SNPs单倍型分析

  利用单倍型分析软件PHASE2.1,将33个FS患者及100个健康对照的3个SNPs的等位基因数据输入后,共得到2个单倍型,见表9。单倍型1、单倍型2进行2检验,2=3.024,P值为0.0821>0.05,无统计学意义,见表10。

  表9由SCN1A基因SNPs构建的单倍型

  rs2298771

  (g.42362G>A)rs6432860

  (g.37286T>C)rs7580482

  (g.31705A>G)单倍型1ACG单倍型2GTA

  表10病例组与对照组SCN1A基因单倍型分析

  单倍型Case(freq)Control(freq)2P-ValueOR(95%CI)1(ACG)63.00(0.955)176.00(0.880)2(GTA)3.00(0.045)24.00(0.120)3.0240.0821*0.349[0.102~1.200]讨论

  FS是小儿时期最常见的惊厥性疾病,是具有明显遗传倾向性的特殊癫痫综合征,FS更频繁的发生在亚洲人群中,而欧美国家儿童的发病率则较低。这种地域之间FS发病率的差异,有可能是儿童感染性疾病的患病率差异造成的,也有可能与地理环境有关,遗传易感性也是其原因之一。迄今为止,FS病因及发病机制尚不清楚,但公认遗传因素在其发病中起主要作用,迄今为止已报道有12个易感基因座,可见其遗传异质性。FS存在潜在的远期进展为癫痫的危害性。在所有已知的癫痫相关基因中,SCN1A基因是人类癫痫最常见的突变基因,被称为超级罪犯基因,迄今为止,大约有900多种不同的突变被报道。与癫痫或FS相关性报道最多的是SCN1A基因rs3812718及rs2298771多态性位点,但对其基因多态性与癫痫易感性或抗癫痫药物的关联性研究,各文献报道的结果并不一致。

  1.SCN1A rs3812718多态性

  rs3812718多态性位于SCN1A基因内含子(Intron)4,为非编码SNP,不引起编码蛋白质氨基酸系列的改变。Heinzen等于2007年报道SCN1A基因IVS5N+5G>A(rs3812718)多态性,可以导致该基因外显子5的选择性剪切,分别外显子5A和外显子5N,进而改变成熟外显子5A与新生外显子5N基因转录的比例,等位基因(A)的破坏5'剪接位点外显子5的新生拷贝,能极大地减少新生外显子5N的表达(见图6)。该多态性位点突变所导致的外显子5的2种转录版本的区别在于其所翻译的氨基酸序列的的差异,为3个氨基酸的替换(见图7)。Schlachter等为了研究SCN1A rs3812718多态性与FS的相关性,开展了一项病例对照研究,纳入90名幼年无FS病史癫痫患者和486名有FS病史的癫痫患者及701名健康对照,等位基因A和基因型AA病例组中的分布频率显著高于对照组,作者认为SCN1A rs3812718多态性突变型等位基因A可增加FS的易感性。法国学者Le Gal等纳入164名FS患者和199名健康对照,研究人群均为白种人,采用基因探针对其进行SCN1A基因rs3812718多态性筛查,结果显示病例组中突变型等位基因A和基因型AA频率显著高于正常人群,提示该多态性增加FS的发病风险。Tang等于2014年汇总了6项遗传学研究共包括2719名癫痫伴FS患者和2317名健康对照进行Meta分析,结果提示SCN1A rs3812718多态性是癫痫伴FS和癫痫发病的危险因素。以上三项研究结果都显示SCN1A rs3812718多态性与癫痫或FS发病的危险因素,研究对象均为白种人群。SCN1A基因rs3812718多态性与FS发病的相关性可能与该多态性所致外显子5的选择性剪切有关,然而,香港中文大学Zhang等于2010年对SCN1A基因rs3812718多态性与中国汉族人群癫痫的相关性进行了研究,共纳入728例中国汉族癫痫患者及848名种族匹配的健康对照,基因分型法进行SNP检测,结果显示rs3812718多态性与我国汉族人群FS的发病不相关。Zhang等研究结果一方面需进一步验证,另一方面也提示SCN1A基因rs3812718多态性与FS的相关性可能存在人种差异性。本次研究的结果显示,33名FS患者中rs3812718多态性基因型分布为GG型(野生型纯合子)6例,GA型(突变型杂合子)17例,AA型(突变型纯合子)10例,突变型等位基因A的频率为40.9%。病例组与对照组在rs3812718多态性位点的基因型和等位基因频率上的不同无统计学差异,提示在本次研究人群中rs3812718位点与FS可能不相关。以上研究均说明,对SCN1A基因rs3812718多态性位点与FS的易感性的研究结论尚不完全一致,FS易感性不但与SNP相关,同时还可能存在人种的差异性。本研究未发现SCN1A基因rs3812718 G/A多态性与家族性FS的相关性,其原因也有可能为研究对象均为简单性FS,疾病谱较窄。

  钠离子通道负责脑神经元初始去极化,动作电位的形成及传播。因此,它们是广泛使用的一线抗癫痫药物包括卡马西平和苯妥英的作用靶点。有大量研究表明SCN1A基因不仅是癫痫易患基因,也影响着抗癫痫药物的反应,其SNP在抗癫痫药物的药代动力学和药效学起着越来越重要的作用,是研究药物靶基因和临床反应两者之间联系的最佳候选基因。最近,有报道称在中国及英国癫痫患者中SCN1A基因rs3812718多态性位点与卡马西平(Carbamazepine,CBZ)和苯妥英钠(Phenytoin,PHT)血清浓度的维持剂量的最大量呈显著相关。Tate等[29]研究发现癫痫患者中,GG基因型抗癫痫药物的剂量是最低的,AA基因型抗癫痫药物剂量是最高的,而GA基因型位于中间。在同一位作者开展的独立研究中,分析了SCN1A基因IVS5N+5G>A单核甘酸多态性与中国血统的癫痫患者抗癫痫药物的剂量的关系,发现维持癫痫患者苯妥英钠的有效血药浓度,抗癫痫药物的最高剂量到最低剂量的基因型分别为AA→GA→GG。此外,也有文献报道,SCN1A基因rs3812718多态性位点与癫痫患者对CBZ的耐药相关。zhou等为了调查卡马西平对于中国汉族人群癫痫患者耐药性与SCN1A基因单核甘酸多态性的关系,共纳入448名癫痫患者进行单核甘酸多态性检测,并单独予以卡马西平治疗,随访2年,卡马西平耐药性以癫痫发作的减少和复发率进行评估,结果发现对于rs3812718多态性,AA基因型携带者的癫痫发作频率显著高于AG基因型携带者和GG基因型携带者,作者认为rs3812718 G/A多态性影响癫痫患者对CBZ的耐药性。日本学者Abe等纳入228名癫痫患者,予以卡马西平治疗1年,卡马西平疗效和SCN1A基因rs3812718 G/A多态性的相关性采用logistic回归分析评估,结果显示AA基因型频率在CBZ耐药性患者显著高于CBZ敏感性患者。SCN1A IVS5N+5G>A多态性与抗癫痫药物包括卡马西平(CBZ)和苯妥英钠(PHT)血清浓度的维持剂量的最大量、CBZ耐药等联系可以用其突变造成外显子5的剪接改变解释,该突变影响电压门控钠离子通道第Ⅳ结构域的S5区跨膜区的蛋白转录,改变了其生理特性,从而改变钠蛋白通道α亚基的功能。

  Fig.7 Schematic of exons the SCN1A gene.5A means the version of the adult mRNA transcript forms of exon 5.5N means the version of the neonatal mRNA transcript forms.The asterisk(*)indicated splice donor site after exon 5N.

  图7 SCN1A基因外显子4〜6图,5A是外显子5转录生成的成熟mRNA,5N是外显子5转录生成的新生mRNA,星号(*)表示外显子5N后的剪接供体位点。

  Fig.8 The position of the SCN1A IVS 5N+5G-A polymorphism and schematic of the variation of the amino acid sequences expressed by exon 5N and 5A in the SCN1A gene

  图8 SCN1A IVS5N+5G-A多态性的位置及SCN1A基因外显子5N和5A表达氨基酸序列变化的原理。

  2.SCN1A rs7580482多态性

  rs7580482位于SCN1A基因外显子(Exon)9,为同义编码SNP(synonymous cSNP),为同义突变(又称沉默突变),不影响其所编码蛋白质氨基酸序列第404位缬氨酸(Val)的翻译。迄今尚未见rs7580482多态性位点与癫痫相关性疾病发病风险的报道。本次研究结果显示33名FS患者中rs7580482多态性基因型分布为GG型(突变型纯合子)30例,GA型(突变型杂合子)3例,未见AA基因型,突变型等位基因G的频率为95.5%。对照组中rs7580482多态性基因型分布为GG型(突变型纯合子)78例,GA型(突变型杂合子)20例,AA型(野生型纯合子)2例。经卡方检验,病例组与对照组在rs7580482多态性位点的基因型和等位基因频率均无统计学差异,提示在本次研究人群中rs7580482 A/G多态性位点与家族性FS发病可能不相关,c.1212A>G为同义突变,不影响氨基酸序列的改变,SCN1A基因rs7580482多态性位点突变型等位基因G可能不是我国皖北地区汉族人群FS的易感因素。

  3.SCN1A rs6432860多态性

  rs6432860位于SCN1A基因Exon13,为同义编码SNP(synonymous cSNP),不造成其所编码蛋白质氨基酸序列第764位缬氨酸(Val)的改变。有关SCN1A基因rs6432860多态性位点与FS或癫痫发病风险的报道并不多见,Feenstra B等于2014年进行了一系列的全基因组扫描比较麻疹、腮腺炎和风疹联合疫苗(Measles,mumps and rubella vaccine,MMR疫苗)相关性FS、疫苗无关的FS与SCN1A基因SNP相关性,共纳入MMR疫苗相关性FS患者929例,疫苗无关性FS患者1070例,共1999例患者,健康对照4118例。作者认为SCN1A基因rs6432860多态性突变型等位基因C为MMR疫苗相关性FS的遗传危险因素。Smith等开展了一项前瞻性队列研究,目的是分析参与颞下颌关节紊乱病(temporomandibular disorder,TMD)发生发展的遗传危险因素,作者认为SCN1A基因rs6432860多态性与TMD发病相关的表型的非特异性颜面部症状相关。本次研究中FS患者和100名健康对照基因型分布符合哈迪-温伯格平衡定律(P值均>0.05),表明群体基因遗传平衡,能分别代表FS患儿和正常健康儿童,经卡方检验,病例组与对照组在rs6432860多态性位点的基因型和等位基因频率均无统计学差异,提示在本次研究人群中rs6432860 T>C多态性位点与家族性FS发病可能不相关。

  3.SCN1A rs2298771多态性

  rs2298771位于SCN1A基因EXON16,cDNA水平位于c.3199G>A。rs2298771为非同义编码SNP(non-synonymous cSNP),是SCN1A基因外显子区域一个非常常见的多态性位点。导致其所编码蛋白质氨基酸序列第1067位丙氨酸(Ala)突变为苏氨酸(Thr)(p.Ala1067Thr)。最近,伊朗学者Ebrahimi等[35]报道34个独立的癫痫家系,其中病例组A/G等位基因频率为0.71/0.29,对照组则为0.52/0.48,等位基因A/G的分布频率在病例组与对照组中有显著差异,与伊朗家族癫痫显著相关,突变型等位基因A可能为癫痫的易感等位基因。Lakhan等[37]纳入336癫痫患者和160名健康对照分析SCN1A基因rs2298771多态性位点与北印度人群癫痫发病风险的联系,采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术进行基因分型,指出癫痫患者rs2298771多态性AG基因型携带者显著高于健康对照,因此,该基因型被认为是增加癫痫发作的风险,但并未发现它与抗癫痫药物之间的相关联系。该SCN1A基因c.3199 G→A导致高度保守的编码区域氨基酸丙氨酸变化为苏氨酸,可能调节细胞质流出和钠离子的涌入影响灭活门运作,另一种可能性是,这种多态性处于同基因其他遗传变异连锁不均衡,赋予该多态性增加癫痫的的发病风险[36]。然而,一项来自台湾的研究共纳入104名FS患儿和83名健康对照,聚合酶链反应检测SCN1A基因rs2298771多态性,结果显示病例组与对照组rs2298771多态性基因型频率和基因频率差异无统计学意义,SCN1A基因rs2298771多态性与FS发病无关[37]。我们研究结果显示rs2298771多态性基因型分布为AA型(突变纯合子)30例,GA型(突变型杂合子)3例,未见GG基因型,突变型等位基因A的频率为95.5%;对照组中突变型等位基因A的频率为88%;突变型等位基因A在病例组和对照组中无显著差别,提示在皖北地区汉族人群中SCN1A基因rs2298771多态性位点与FS可能不相关。我们的研究结果与台湾的研究结果一致,尚未见该突变所致编码蛋白质的电生理学方面和生物学性状方面的研究,所以不能解释位点突变引起通道蛋白结构的改变对功能的影响。我们运用PolyPhen-2和SIFT预测p.Thr1067Ala对SCN1A蛋白结构和功能的影响,PolyPhen-2预测分数为0.000,提示p.Ala1067Thr为良性变异体(见图8);SIFT预测分数为0.64,提示1067位Thr突变成Ala不影响SCN1A蛋白功能,是可以耐受的(见图9)。综合以上分析,我们认为rs2298771(p.Ala1067Thr)是FS的非致病性突变。近期,有文献报道SCN1A基因rs2298771多态性位点与CBZ耐药性患者有关,Wang等[38]纳入628位癫痫患者,对SCN1A基因rs2298771多态性位点与抗癫痫疗效水平进行相关性研究,予以CBZ单药治疗12个月,对抗癫痫疗效水平进行分类:发作完全控制,发作减少>75%,发作减少50%~75%,发作减少<50%;结果显示rs2298771位点G等位基因携带者发作完全控制率显著低于基因型AA患者,作者认为rs2298771多态性位点与CBZ抗癫痫的疗效显著相关。

  图9 PolyPhen-2预测SCN1A基因rs2298771多态性对其编码蛋白质功能的影响

  图10 SIFT预测SCN1A基因rs2298771多态性对其编码蛋白质功能的影响

  SCN1A基因单倍型分析

  单倍型(haplotype),即单倍体基因型的简称,指在同一染色体上进行共同遗传的多个基因座上等位基因的组合,也是指一个染色单体里面具有统计学关联性的一类SNPs[39]。单倍型分析可以提供比单个SNP更为丰富的信息,对于复杂的多基因遗传疾病,单独分析易感基因中SNP位点的基因型及等位基因往往不能真实的反映出与疾病相关性,多位点单倍型分析能够发现单倍型-疾病表型之间的关联,这种关联要明显强于单个位点-疾病表型之间的关联,能够更加真实的反应易感基因与相关疾病的相关性[40]。

  有关SCN1A基因SNP单倍型与相关癫痫综合征的报道并不多见,Fendri-Kriaa等[41]于2011年对2名突尼斯婴儿严重肌阵挛性癫痫(severe myoclonic epilepsy in infancy,SMEI)患者及10名健康对照进行SCN1A基因SNP rs3812718、rs6432860、rs2298771位点进行单倍型分析,采用PHASE2.2软件,结果显示ACA单倍型频率在病例组中为100%,显著高于对照组(17±11.4%),SNP单倍型(ACA)在这2例患者中为纯合子,作者认为ACA可能为与SMEI发病相关的单倍型。Hung等[42]纳入234名癫痫患者和189名健康对照,给予CBZ治疗规律1年,分析包括SCN1A基因在内的相关基因SNP单倍型与癫痫患者CBZ治疗的相关性,单倍型分析显示由SCN1A基因IVS5-91G>A(rs3812718)和c.3199G>A(rs2298771)的单倍型与CBZ的浓度-剂量比显著相关,然而其在病例组及对照组中的分布无明显差异。本研究关于SCN1A基因SNPs(rs2298771、rs6432860、rs7580482)的单倍型分析,结果示在33名患者及100名健康对照中,可见2个单倍型,分别为单倍型1(ACG)、单倍型2(GTA),其在病例组和对照组的分布无显著差异,卡方检验结果P值>大于0.05,无统计学意义。SCN1A基因SNPs的单倍型ACG、GTA与家族性FS的发病无关。以上差异可能为本次研究对象均为简单型FS,疾病谱较窄的原因。

  研究意义

  FS发展为癫痫的风险高,可对儿童智力、认知及生活质量将产生有害影响,对家庭和社会也是沉重的负担,不利于国民素质的提高。本课题为首次在国内开展的SCN1A基因SNP基因型、等位基因频率及单倍型与家族性FS相关性分析,虽未发现家族性FS的致病性或保护性SNP及单倍型,然丰富了家族性FS的遗传学发病机制,对家族性FS的基因筛查、基因治疗提供了重要线索。

  结论

  SCN1A基因SNP(rs3812718、rs7580482、rs6432860、rs2298771)不是中国皖北地区汉族人群家族性FS发病危险因素。

  SCN1A基因SNPs(rs7580482、rs6432860、rs2298771)单倍型ACG、GTA与中国皖北地区汉族人群家族性FS发病无关。

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