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妇产科医学论文 TGF-β、PDGF在子宫内膜异位症患者异位组织中的表达及意义

2018-12-16 19:56:39来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要

  目的 通过分别检测转化生长因子(transforming growth factor beta,TGF-β)与血小板衍生生长因子(platele derived endotheliaeen growth factor,PDGF)在正常子宫内膜及子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs)患者的异位内膜组织中的表达,探讨它们与子宫内膜异位症的发生发展过程可能存在的关系,以期为子宫内膜异位症的临床诊治提供更多的理论依据。

  方法 通过免疫组织化学方法检测30例正常子宫内膜组织和30例EMs 患者异位内膜组织中TGF-β和PDGF的表达情况。

  结果 1.TGF-β在子宫内膜的腺上皮细胞及间质细胞中均有表达,其在异位内膜组中的表达阳性与强阳性(++~+++)例数为23例,表达阴性与弱阳性(-~+)例数为7例;其在正常子宫内膜组中的表达阳性与强阳性(++~+++)例数为12例,表达阴性与弱阳性(-~+)例数为18例。两组之间有统计学意义(P<0.05)。

  PDGF主要表达在子宫内膜间质细胞中,其在异位内膜组中的表达阳性与强阳性(++~+++)例数为19例,表达阴性与弱阳性(-~+)例数为11例;其在正常子宫内膜组中的表达阳性与强阳性(++~+++)例数为9例,表达阴性与弱阳性(-~+)例数为21例。两组之间有统计学意义(P<0.05)。

  结论 1.TGF-β在异位子宫内膜组织中的表达明显高于在正常子宫内膜组织,其与EMs的发生发展存在一定关系。

  PDGF在异位子宫内膜组织中的表达明显高于在正常子宫内膜组织,其与EMs的发生发展存在一定关系。

  利用理化及生物等手段抑制TGF-β及PDGF的表达或许可为EMs的治疗提供新的手段。

  关键词

  子宫内膜异位症;转化生长因子-β(TGF-β) ;血小板衍生生长因子(PDGF);免疫组织化学

  前 言

  子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs)是指具有活力的子宫内膜组织(腺体或间质)在子宫内膜以外的组织或器官存活并生长形成病灶。EMs是育龄女性常见疾病,发病率为 6%~10%, 并呈逐年上升的趋势。该病的临床表现多种多样,并因病变部位的不同而呈现特有的临床表现,且与月经周期有极为密切的联系。疼痛和不孕是该病的两大常见症状。有将近四分之三的患者的首发症状为疼痛,这种疼痛多表现为机械性痛觉过敏,疼痛的部位多位于腰骶部和下腹部,并可向阴道、肛门、会阴或大腿等部位放射。疼痛严重时会影响EMs患者的工作和生活质量,并会对她们的社会幸福感及心理健康带来不利影响。约30%~50% 的患有不孕症的女性罹患此病。有研究者认为,EMs患者的卵巢组织遭到破坏,卵巢储备功能下降,进而患者的生育能力受到影响而减弱。另外盆腹腔微环境的改变会影响精子与卵子结合及运送,免疫功能异常致抗子宫内膜抗体的增加会影响正常在位子宫内膜的功能进而影响受精卵的种植。以上因素均减弱患者的生育能力甚至发生不孕症。另外还有患者表现为性交不适和月经的改变,特殊部位的EMs患者可出现相应的症状,如膀胱内异症患者可出现尿痛、尿频等症状,肠道内异症患者可主诉腹痛、腹泻或周期性便血等。EMs患者的症状及体征常常与疾病的严重程度不成正比,容易造成医生的漏诊或误诊,进而延误治疗,造成较严重的后果。

  EMs的诊断包括:1. 典型的临床症状和体征:与月经周期相关的腹痛,不孕,性交不适等;妇科检查时可触及附件区包块,对于重度患者,双合诊时可发现子宫相对固定,于阴道后穹窿部位可触及压痛样结节。2. 影像学检查:彩超检查对卵巢子宫内膜异位囊肿的诊断意义较大,比较典型的卵巢子宫内膜异位囊肿的超声影像表现为无回声区内有密集光点;经阴道或直肠的超声检查、CT 增强平扫或MRI 检查对浸润直肠或阴道直肠隔的深部病变的诊断和评估有重要意义。3. 腹腔镜检查:是目前EMs诊断的重要手段,可作为诊断该病的金标准,术中不仅可通过腹腔镜下对病灶的部位及形态进行观察,还可以同时去除或破坏病灶,这些病灶在腹腔镜下的表现多样,病灶的颜色可以是红色、白色或黑色,深色的病变是由于月经期内膜碎片积存,其中的含铁血黄素沉积而成;术中要仔细探查盆腔壁及盆腔内各脏器,特别是子宫直肠陷窝、宫骶韧带、卵巢窝等部位。EMs确诊需要依靠病理检查,组织病理学结果是EMs确诊的基本证据(但在临床工作中,有部分病例虽确诊但未能找到组织病理学证据)。4. 血清糖原抗体水平检测:EMs患者血清中CA125水平增高,但一般不超过200U/ml,早期EMs患者体内CA125水平升高不明显,其水平升高更多见于重度子宫内膜异位症或盆腔炎症反应明显、合并子宫腺肌病或子宫内膜异位囊肿破裂者,CA125水平检测可用于EMs治疗后复发的监测。CA19-9水平同样与EMs的严重程度正相关。5. 怀疑膀胱内异症或肠道内异症等特殊部位EMs时,术前可行膀胱镜或肠镜检查,必要时可同时行活检,以排除器官本身的病变,特别是恶性病变。活检诊断内异症的概率约为10%~15%。

  对EMs的治疗,应充分考虑患者年龄、症状、病变部位及范围以及对生育要求等情况,强调治疗个体化。治疗方法包括药物治疗、手术治疗、介入治疗、中药治疗及辅助治疗等。对于没有症状的患者不需要特殊治疗,治疗的目的是去除病灶、缓解症状、促进生育和延缓复发。1.药物治疗:通过抑制卵巢分泌激素功能,阻止EMs病情的的进展,降低病灶内细胞的活性,减少病灶与周围组织之间粘连的形成。常用药物包括口服避孕药、孕激素受体拮抗剂、促性腺激素释放激素激动剂、芳香化酶抑制剂、雄激素类衍生物等,应根据患者病情、药物副作用、费用、药物效果及用药经验等选择合适药物,必要时可联合用药。2.手术治疗:手术的目的为去除病灶和恢复解剖,对于轻度的EMs,手术治疗很有争议,切除术和消融术效果相似;对于中、重度EMs,手术能否提高不孕症的治疗效果有争议,且术后可增加盆腹腔内粘连,并有可能降低卵巢储备功能;子宫及双附件切除术可基本缓解EMs导致的盆腔疼痛,适用于无生育要求的患者。药物治疗对EMs引起的不孕症效果不佳,手术治疗可以提高妊娠率,但提高程度尚不清,若术后患者仍不能妊娠,应选择试管婴儿助孕,再次或多次手术会影响试管婴儿的成功率。

  EMs是一种古老而又年轻的疾病,尽管该病被命名距今已经接近一百年,但它的发病机制至今还没有完全弄清楚。美国医学家Sampson于1921年首先提出经血逆流学说[9],该学说又称异位种植学说。异位种植学说认为有活力的子宫内膜组织随月经血逆流进入腹腔或卵巢并在其内种植、生长并形成了异位病灶。该学说得到了多数临床及实验资料的支持。但后来的研究发现,约90%育龄期妇女存在经血逆流,但罹患EMs的妇女仅占10%,这是经血逆流学说无法解释的。经过充分的研究,中国协和医科大学的郎景和教授继承并发展了Sampson经血逆流种植学说,提出了“在位内膜决定论”,该观点认为异位子宫内膜在宫腔外需经黏附、侵袭、血管形成等过程,得以种植、生长、形成病灶,该过程中,激素水平、免疫因素以及局部环境起着重要作用,但在位子宫内膜的生物学特性是内异症发生的的决定因素。

  EMs是良性病变,但其发生发展过程与肿瘤发生发展过程极为相似,表现有局部种植浸润、新生血管发生、远处转移生长、侵犯多种组织器官等特点,临床研究发现EMs存在0.7%~1.2%的恶变率。多家医院临床统计发现,在罹患卵巢癌的患者中,同时患有EMs的情况比较常见,尤其是患有卵巢子宫内膜样癌或透明细胞癌的患者,合并有EMs的比例更高,因此子宫内膜异位症相关卵巢癌的概念便被某些研究者提出。同时也有人提出了卵巢不典型子宫内膜异位症(atypical endometriosis,aEMs)的说法,并描述了aEMs的镜下特点。北京协和医院的研究发现,aEMs无论在组织细胞形态特征方面,还是基因表达的延续性方面,都表现出明显的恶变潜质,由此有研究者认为EMs是一种类肿瘤样疾病或者成为癌前病变。肿瘤的发生、生长以及生物学行为与微血管的生成有重要关系,异位子宫内膜种植存活并增殖亦伴随着微血管的形成,新生成的血管为异位内膜组织提供生长需要的营养,并创造合适的免疫环境,大量的基础和临床研究已证实了该观点。在临床方面,抗新生血管生成的治疗方法已广泛应用于肿瘤的治疗,并取得了较为可靠的临床经验,该类治疗是否可以应用到EMs的防治,需进一步的研究。

  在关于肿瘤的发病机制的探究中,对于新生血管生成的研究一直是热点。转化生长因子(transforming growth factor beta,TGF-β)及血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)是两种较常见的血管生长因子,它们在新生血管生成中的作用已被很多的研究证实。TGF-β是一种具有多功能的肽类细胞因子,体外实验研究发现其可刺激细胞外基质的分泌与沉积,其在胚胎形成、血管形成、细胞周期调控、诱导细胞凋亡及免疫应答等方面起着重要的调节作用, 参与多种疾病的发生和发展过程。TGF-β和其他促进血管生成的细胞因子共同作用,在肿瘤转移灶周围形成一个易于血管形成的环境, 导致营养肿瘤细胞生长的血管生成增多。PDGF 是由体内多种细胞(如巨嗜细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、胚胎癌细胞) 合成并分泌的肽类生长因子,具有较多的的生物学功能。它可以参与许多重要的细胞活动,如化学趋化作用、促使细胞骨架重排作用、促血管收缩作用、诱发新生血管生成的作用、参与胚胎的发育和成长等。研究发现PDGF在体外可趋化内皮细胞,在体内可诱导血管生成,其在结肠癌、肺癌、肾癌、子宫内膜癌等疾病发生发展过程中均有促血管生成作用。

  目前对于TGF-β和PDGF在恶性肿瘤发生、发展以及损伤修复过程中的作用机制已经有了较多研究,关于它们在EMs发生、发展过程中可能有的作用机制的阐述还不太多。本研究通过应用免疫组织化学技术分别检测正常子宫内膜组织及EMs患者异位子宫内膜组织中TGF-β和PDGF的表达情况,并探讨它们与EMs发生及发展之间可能存在的关系,以期为该疾病的治疗提供新的思路与方法。

  材料与方法

  1 材料与方法

  1.1 标本组织来源

  收集 医院病理科存档蜡块(2014年~2015年)进行分组,分为实验组和对照组。其中实验组子宫内膜异位症组织蜡块30例:经病理检验确诊为子宫内膜异位症且不合并子宫内膜其他病变,其中卵巢子宫内膜异位囊肿24例、腹壁切口子宫内膜异位症6例,患者年龄26~46岁,平均年龄34±2.4岁,各患者术前均未行激素类药物治疗,且无内分泌、免疫和代谢性疾病等慢性病史。对照组正常子宫内膜组织蜡块30例:选择因宫颈上皮内瘤变、宫颈原位癌切除子宫的病例,术后病理诊断子宫内膜为正常子宫内膜且不合并子宫内膜病变或子宫内膜异位症,其中增生期内膜18例、分泌期内膜12例,患者年龄38~50岁, 平均年龄46±1.6岁。各组病例标本均经我院病理科再次诊断复核。

  1.2 主要试剂及药品

  (1)兔抗TGF-β1抗体 稀释浓度为1:100 福州迈新生物技术开发有限公司

  兔抗PDGF抗体 稀释浓度为1:100 北京中杉金桥生物技术公司

  免疫组化SP试剂盒 北京中杉金桥生物有限公司

  (4)二甲基联苯胺(DAB)酶底物显色试剂盒 罗氏Ventana公司

  (5)磷酸盐缓冲液(PBS):(自配) NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO4•12H2O 3.63g, KH2PO4 0.24g,溶于900ml双蒸水中,用盐酸调pH值至7.4,加水定容至1L,常温保存备用。

  (6)0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液:(自配)柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g,加水定容至1L,常温保存备用。

  (7)其他试剂:伊红染色剂、苏木素复染剂、二甲苯、蒸馏水、10%甲醛溶液、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、3%过氧化氢溶液、中性树胶等。

  1.3主要仪器及设备

  微量移液器(10ul,40ul,200ul,1000ul)

  显微镜 Olympus BX-41

  切片机 德国Leica-RM2235

  微量振荡器 江苏正大

  电热恒温干燥箱 上海跃进医疗器械厂

  微波炉 格兰仕

  冰箱 海尔BCD-539WF

  高压锅 苏泊尔

  1.4实验方法

  1.4.1实验原理:

  免疫组化染色法是一种利用生物抗原、抗体特异性结合的原理,通过抗原与抗体间的化学反应,使标记抗体的某些显色剂(金属粒子、荧光素、同位素等)显色,以最终确定组织或细胞内抗原,对染色部位进行定位、定性和定量。本实验通过利用兔抗TGF-β1抗体和兔抗PDGF抗体分别与异位子宫内膜组织及正常子宫内膜组织中的相应抗原结合,应用DAB对免疫反应抗原抗体复合物进行染色,进而检测异位子宫内膜组织及正常子宫内膜组织中TGF-β1和PDGF的表达情况。

  1.4.2 实验步骤

  首先对选取蜡块进行切片,连续切片3张,厚 4μm,1张待常规HE染色,2张待免疫组化染色,将组织切片置于载玻片上,放到60℃电热烤箱中烘烤2小时后备用。

  1.4.2.1 HE染色步骤

  ①将载有组织的玻片放入二甲苯液中浸泡脱蜡10分钟×2次;

  ②梯度酒精脱蜡:100%酒精浸泡10min×2次,95%酒精浸泡5min×2次,85%酒精浸泡5min×2次,75%酒精浸泡5min×2次,去离子水洗3min×3次(操作轻柔,以免将组织冲走);

  ③苏木素染色3min,自来水充分冲洗;

  ④l%盐酸酒精分化;

  ⑤PBS液5min;

  ⑥0.5%伊红液染色 2min;

  ⑦蒸馏水1min×2次、75%酒精浸泡1min×2次,85%酒精浸泡5min×2次,95%酒精浸泡1min×2次,100%酒精浸泡3min×2次,二甲苯液浸泡3min×2次;

  ⑧中性树胶封片,室温下晾干;

  ⑨读片。

  1.4.2.2免疫组化(SP)步骤

  ①将载有组织的玻片放入二甲苯液中浸泡脱蜡10min×2次;

  ②梯度酒精脱蜡:100%酒精浸泡10min×2次,95%酒精浸泡5min×2次,85%酒精浸泡5min×2次,75%酒精浸泡5min×2次,去离子水洗3min×3次(操作轻柔,以免将组织冲走);

  ③高温热抗原修复:将组织切片浸于配置好的枸橼酸盐缓冲液中,用支架固定于盛有蒸馏水的高压锅中,加热至水沸腾煮腾,使交联的蛋白质打开,方便抗原的暴露,5~10 min后,关火,冷却至室温后取出切片;

  ④PBS液冲洗3min×3次,滴加过氧化物酶阻断试剂,室温下孵育10min,再用PBS液冲洗3min×3次;

  ⑤甩净PBS液后,在切片上滴加第一抗体(兔抗TGF-β1抗体和兔抗PDGF抗体稀释液 1:100),室温下孵育60min;

  ⑥PBS液冲洗3min×3次,滴加生物素化二抗工作液,室温下孵育2小时,PBS液冲洗3min×3次;

  ⑦DAB 显色:于每张切片滴加DAB显色剂,并在显微镜下密切观察,控制显色时间(3~10min),之后自来水充分冲洗;

  ⑧苏木素复染:苏木素染色3min,自来水充分冲洗;

  ⑨l%盐酸酒精分化,氨水返蓝,自来水冲洗;

  ⑩梯度酒精脱水:75%酒精浸泡5min×2次,85%酒精浸泡5min×2次,95%酒精浸泡5min×2次,100%酒精浸泡10min×2次,二甲苯液浸泡10min×2次;

  ⑪中性树胶封片,室温下晾干;

  ⑫读片。

  1.4.3结果判定

  细胞浆中出现棕黄色或褐色颗粒者判为阳性。根据阳性细胞的百分率及显色深浅分级:(1)阳性细胞百分率:无细胞显色为0,小于25%细胞显色为1,25%~50%细胞显色为2,>50%细胞显色为3;(2)显色深浅:不显色或显色不清为0,浅黄色为1,棕黄色为2, 深褐色为3。 二项乘积0~1分为 阴性(-),2~3分为弱阳性(+),4~5分为中度阳性(++),>5分为强阳性(+++)。

  1.5统计学分析

  用SPSS19.0统计学软件进行数据分析,TGF-β1与PDGF两种蛋白在异常子宫内膜组织和正常子宫内膜组织中阳性表达率的比较采用卡方检验,并对异位子宫内膜组织中两者蛋白表达进行相关性分析,p<0. 05表示差异有统计学意义。

  结 果

  1. TGF-β1在子宫内膜的腺上皮细胞及间质细胞中均有表达(见图1)。其在异位内膜组中的表达阳性与强阳性(++~+++)例数为23例,表达阴性与弱阳性(-~+)例数为7例;其在正常子宫内膜组中的表达阳性与强阳性(++~+++)例数为12例,表达阴性与弱阳性(-~+)例数为18例(见表一)。两组之间有统计学意义(P<0.05)。

  2. PDGF主要表达在子宫内膜间质细胞中(见图2),其在异位内膜组中的表达阳性与强阳性(++~+++)例数为19例,表达阴性与弱阳性(-~+)例数为11例;其在正常子宫内膜组中的表达阳性与强阳性(++~+++)例数为9例,表达阴性与弱阳性(-~+)例数为21例(见表二)。两组之间有统计学意义(P<0.05)。

  3.异位内膜组织中,TGF-β1与PDGF表达同时为阳性与强阳性(++~+++)例数为14例,表达同时为阴性与弱阳性(-~+)例数为2例,TGF-β1表达阳性与强阳性(++~+++)而PDGF表达为阴性与弱阳性(-~+)例数为9例,PDGF表达阳性与强阳性(++~+++)而TGF-β1表达为阴性与弱阳性(-~+)例数为5例(见表三)。两者表达呈明显正相关性(P<0.05)。

  表 一 两组子宫内膜中TGF-β1的表达情况

  例数(n)TGF-β1表达-++++++异位内膜组3034815正常内膜组30314102

  表 二 两组子宫内膜中PDGF的表达情况

  例数(n)PDGF表达-++++++异位内膜组3047811正常内膜组3071454

  表 三 异位内膜组织中TGF-β1和PDGF表达情况

  TGF-β1表达PDGF表达合计++~+++-~+++~+++14923-~+527合计191160

  A:正常子宫内膜B:异常子宫内膜图1 TGF-β在内膜组织中的表达( 免疫组织化学染色,×400)

  Fig.1 the expression of TGF-β in normal endometrium tissues and ectopic endometrium tissues ,typical representative figures( Immunohistochemtistry stain,×400)

  A:正常子宫内膜B:异常子宫内膜图2 PDGF在内膜组织中的表达( 免疫组织化学染色,×400)

  Fig.2 the expression of PDGF in normal endometrium tissues and ectopic endometrium tissues ,typical representative figures( Immunohistochemtistry stain,×400)

  讨 论

  EMs最早在1885年被Von Rokitansky最早描述,之后对该病的研究就一直没有停止过,其发病机制和有效的诊治手段仍是困扰妇产科的难题。目前对EMs发病机制的解释存在多种学说,比较有说服力的包括子宫内膜种植学说、免疫学说、体腔上皮组织化生学说、内分泌学说、血源-淋巴播散学说等。传统的子宫内膜种植学说也称为经血逆流学说,该学说被认可经历了三个验证阶段:经血反流确实存在、子宫内膜细胞能够通过输卵管、内膜细胞在种植部位能够存活,有许多的临床及实验资料都能够支持此学说,该学说能够解释发生在逆流经血能够到达部位如盆腹腔内、生殖器内、手术切口等部位的异位症,但其无法解释经血到达不了的如盆腹腔外、头部、肺及淋巴管等部位的异位症。而且约有70%~90%的妇女有经血返流,但只有少数发生了EMs,这也是子宫内膜种植学说无法解释的。目前认为,子宫内膜随经血返流到盆腔内。之所以能够种植、侵袭并生长,可能与患者的机体免疫功能存在某种缺陷或与盆腹腔局部存在某种免疫缺陷有关,这多表现为免疫监视功能减弱,并且具有免疫杀伤功能的细胞如NK细胞、巨噬细胞等细胞毒作用也减弱,机体免疫功能的缺陷促进异位子宫内膜的种植和侵袭,参与机体免疫活动的细胞释放的多种细胞因子促使异位子宫内膜存活并增殖,此即EMs的免疫学说。但EMs患者出现免疫异常的原因,究竟是子宫内膜携带的异常的免疫信号造成免疫损害,还是机体本身存在的免疫系统缺陷导致内异症的发生,这些问题还需要进一步深入的研究。体腔上皮组织化生学说认为,卵巢及盆腔子宫内膜异位症系由腹膜的间皮细胞在受到持续卵巢激素或经血及慢性炎症的反复刺激后转化而来,化生学说不仅可以解释发生在在卵巢和腹膜上的病变,也能解释在远隔部位如胸腔、四肢和脐部的发生的病变,但此学说目前尚缺乏充分的临床和实验数据来支持。内分泌学说认为,前列腺素的含量增高或比例失调,可导致输卵管的蠕动异常,同时也可影响卵巢卵泡发育,并抑制排卵;前列腺素还可通过促黄体溶解,抑制黄体酮的分泌,导致黄体功能不全,而高浓度的孕酮对有活性的子宫内膜有抑制其生长的作用,降低其浓度,利于异位子宫内膜的生存;另外前列腺素可直接作用于下丘脑和垂体,影响下丘脑促性腺激素的释放,影响卵巢激素的合成,引起内分泌功能的改变,机体内分泌功能的改变可引起子宫肌层和血管收缩,使痛经发生,子宫频繁可加重经血倒流,使有活性的子宫内膜组织进入盆腹腔。

  以上学说中的任何一个都不能单独解释EMs的发生、发展过程。中国协和医科大学的郎景和教授及其团队将研究聚焦于EMs患者的在位子宫内膜,他们认为育龄女性发生经血反流后月经血中的子宫内膜碎片能否在子宫内膜外部位黏附、侵袭并生长,在位子宫内膜的特质是关键因素,换句话说即拥有特殊性质的在位内膜是发生EMs的决定因素。研究者对在位内膜细胞组织形态和超微结构的研究表明,EMs患者的子宫内膜活力较强,血管增生及侵袭性能力均偏强,使内膜的迁徙和种植更加易于发生。异位子宫内膜的生长需要新生血管提供营养,新的血管的建立也是异位子宫内膜能否种植、侵袭并发展成EMs的关键。

  异常血管新生主要出现在肿瘤与血管新生相关的疾病中,其发生、发展是一个多细胞参与并受多种细胞因子调控的复杂过程。近年来有研究者提出了血管新生的平衡学说,即正常生理条件下,血管新生的诱导因子与抑制因子处于动态平衡,一旦此平衡被打破,就会激活血管系统发芽长出新生血管,机体就会出现多种疾病,如肿瘤、多种眼科疾病、帕金森病等。现有研究发现可诱导血管新生的细胞因子常见的有转化生长因子(TGF)家族、血小板衍生生长因子(PDGF)家族、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)家族、纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)家族、Wnt家族、血管生成素(Angiopoietin,Ang)家族、整合素和蛋白酶等。

  TGF家族成员数目众多,它是一类具有多种生物功能的多肽类细胞因子,于 1983 年由 Assoian 等自人血小板中首次成功提取,分为1型和2型。TGF-β及其受体几乎存在于体内的所有细胞,对细胞生长方面有重要影响,它可以通过参与调节细胞的增殖分化、新生血管生成、诱导细胞凋亡、促进组织纤维化及免疫监视调控等参与多种疾病的发生与发展。在肿瘤疾病方面的研究表明TGF-β通过增加血管的生成、抑制免疫功能、诱导细胞外基质的产生起到促进肿瘤的侵袭和转移的作用。EMs患者的盆腹腔液中含有的炎性细胞及TGF-β、VEGF等细胞因子可促进异位症病灶及其周围新生血管的生成,进而使异位子宫内膜更加易于种植存活并侵袭。在众多促新生血管生成的细胞因子中,VEGF是作用能力最强的一个,研究发现在普通生理浓度下TGF-β可增加腹膜间皮细胞VEGF蛋白的表达,进而利于新生血管的产生,因此有研究者认为TGF-β是通过增加VEGF的表达来实现新生血管形成的增加。还有研究发现,TGF-β可抑制自然杀伤细胞和巨噬细胞等免疫细胞的活性,使异位子宫内膜组织能够躲避机体的免疫监视,使之更容易突破腹腔内局部免疫保护屏障,进而使异位子宫内膜更容易种植及侵袭。Freeman ML 等研究发现,在许多的盆腹腔手术后发生粘连的病例中,粘连器官表面腹膜中 TGF-β1含量明显增多,由此可以认为TGF-β1的高表达与纤维组织增生有重要联系。TGF-β还可通过降低腹腔间皮细胞金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase,MMP)的表达、增强腹腔间皮细胞金属蛋白酶组织抑制物TIMPs的表达而减弱金属蛋白酶原MMPs 的活性,进而使肿瘤细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的降解减少。 TGF-β通过破坏腹膜表层结构的完整性、促进细胞外基质的沉积、纤维蛋白形成和纤维母细胞增生,致使腹膜纤维化或盆腔粘连形成,最终导致不孕症、慢性盆腔痛等并发症的发生。由此可见TGF-β参与了EMs发病“3A”程序的每个环节。本研究发现TGF-β在异位子宫内膜中的表达明显高于对照组,证实TGF-β在EMs的发生发展中起到重要促进作用。

  PDGF是由血小板、组织细胞和某些肿瘤细胞产生的一种多肽类生长因子,是机体内巨噬细胞活化后的特征性分泌产物,可趋化多种间质细胞如内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞等,并促进上述细胞的有丝分裂过程,上述间质细胞也可通过自分泌或旁分泌生成PDGF,促进自身及其附近细胞的增殖与分化[34]。许多临床及实验研究表明,PDGF在新生血管生成的过程中起到了重要作用,可参与多种肿瘤细胞增殖过程中血管形成的过程。近来研究发现PDGF在细胞间信号传导中也发挥重要作用,在一定条件下,PDGF能够与VEGF受体结合,并激活VEGF受体,进而促进血管内皮细胞分裂和迁徙,利于新生血管的生成。有研究发现,PDGF在诱导血管内皮细胞分裂和增加血管通透性的作用方面,表现的要弱于VEGF,但PDGF可以增强VEGF的的上述功能,两者可协同促进新生血管的形成。另外,PDGF可通过诱导血管平滑肌细胞与内皮细胞的迁移,并促进其更新换代和生长增殖,抑制其凋亡发生,促进病变周围新生血管的形成。PDGF还可通过诱导间质细胞的分裂,促使新生血管的间质增加,从而能够为新生的微血管提供良好的支撑结构。另外还有研究发现PDGF可刺激卵泡膜细胞生长,抑制黄体生成素促孕酮和雄烯二酮分泌功能,促进雌二醇的产生,进而有利于异位子宫内膜的生长。本研究发现PDGF在异位子宫内膜中的表达高于对照组,说明子宫内膜异位病灶内生成较多PDGF,有利于病灶处新生血管的形成,进而为病变的进一步发展提供必要的营养支持。

  作为影响肿瘤发生、发展的重要因素,针对各细胞因子之间平衡调节和抑制各种促肿瘤生长因子表达的肿瘤治疗手段已经有了较为深入的研究。

  祖国医药有悠久的治癌历史,历代本草专著记述了许多关于治疗恶疮毒瘤、疮痕的中药方剂。随着分子生物学、免疫学、中药药理学研究的深入,依靠中药提取技术的进步,中药及其有效成分在参与中晚期癌瘤治疗中的作用,越来越被临床所接受,并形成了具有自己特色的的肿瘤治疗模式。中药(或中成药)与合成类抗肿瘤药物相比,在临床应用中具有低毒、有效、价廉、多途径、多靶点等优点,对机体和机体免疫系统损伤更小,在缓解肿瘤发展、延长生存时间、改善生活质量等方面有着显著的优势。目前对中药抗肿瘤机制的研究主要在以下几个方面:①损伤肿瘤细胞核糖核酸,抑制肿瘤细胞增殖;②诱导肿瘤细胞凋亡;③抑制肿瘤细胞周围新生血管生成;④逆转肿瘤细胞的耐药性,提高化疗药物疗效;⑤调节机体免疫细胞活性,促进干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子等免疫因子的生成,增强机体免疫力。广州第一人民医院的何彦丽团队研究发现枸免杞多糖可明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,其机制可能为下调血清中VEGF、TGF-β水平,影响了机体的免疫监视功能。河北医科大学的崔澂团队研究发现,Colon26肿瘤细胞在经青蒿琥酯和苦参素的提取物作用后,分泌TGF-β1、VEGF和IL-4的能力减弱。承德医学院的李娜团队研究发现,灵芝多糖可使LA795肺癌细胞分泌VEGF、TGF-β1、IL-10等免疫抑制分子功能减弱。华中科技大学的项锦毅团队研究发现,重组FN多肽CH50通过抑制IL-10和TGF-β基因的表达,可抑制肿瘤细胞生长,对肿瘤细胞生长微环境中免疫基因表达的调节有重要影响。以上研究结果目前还停留在实验室研究阶段,能否应用到临床,还需要更多地研究结果支持。

  有研究者发现,肿瘤基质的组织间液体压(interstitial fluid pressure,IFP)在PDGF信号通路激活后可显著增高,IFP 增高后,抗肿瘤药物不能被有效地运输到肿瘤细胞周围,局部药物浓度降低,肿瘤组织对药物的摄取也显著减少,进而降低抗肿瘤药物的药效。针对PDGF受体的抑制剂能减少PDGF信号转导,能降低肿瘤组织的IFP,并且能够下调肿瘤的生长增殖信号,减少肿瘤新生血管生成,诱导肿瘤细胞凋亡,具有高选择性和低毒副作用的优点,并可与其他抗肿瘤药物联合应用,以降低肿瘤的耐药性。

  针对PDGF受体的抑制剂从作用机制上可分为两类,一类是ATP竞争性抑制剂,它可竞争性结合PDGF受体激酶的ATP 结合位点,阻断磷酸化过程,进而影响后续的生化反应;另一类是PDGF拮抗剂,这种药物在结构上与PDGF亚型相似,可与PDGF竞争结合PDGF受体的结合位点,阻碍PDGF发挥功能。伊马替尼是 ATP 竞争性抑制剂,其可以通过调控PDGF-B mRNA路径减少组织中PDGF蛋白表达,该药同时能够能降低肿瘤基质组织间液体压,与其它抗肿瘤药物联合应用时可减少肿瘤耐药性,增加抗肿瘤药物的疗效[48]。在慢性骨髓增殖性疾病中,PDGF受体的突变也是嗜酸性粒细胞增多症发生的机制之一,作为PDGF受体的阻断剂,伊马替尼能有效治疗携带PDGF受体基因突变的嗜酸性粒细胞增多症,并且可以达到分子生物学的缓解[49]。其甲磺酸盐已经于2001年上市,并已广泛应用于临床。

  目前针对TGF-β和PDGF 及其受体的结构特点的研究还在逐步深入,两者与肿瘤发生、发展之间的密切关系也对肿瘤治疗新方法的探索提供了启示,并且临床上已经取得了一定的经验。EMs有着和肿瘤相似的生物学行为, TGF-β和PDGF在EMs的发生、发展过程中也起到重要作用,把针对肿瘤的免疫调节治疗和靶向治疗应用到EMs的治疗,或许是一种新的思路或手段。

  结 论

  TGF-β1在异位子宫内膜组织中的表达明显高于在正常子宫内膜组织的表达,其通过抑制机体免疫功能、促进异位病灶新生血管形成、诱发盆腹腔粘连的发生促进了EMs的发生、发展。

  PDGF在异位子宫内膜组织中的表达明显高于在正常子宫内膜组织的表达,其通过诱导新生血管的形成、促进雌二醇的产生等参与EMs的发生、发展。

  TGF-β1与PDGF在EMs患者异位子宫内膜组织中表达呈正相关性,具体机制还需进一步研究才能明确。

  利用理化及生物等手段抑制TGF-β1及PDGF的表达或许可为EMs的治疗提供新的思路和手段。

  免疫因素在子宫内膜异位症发病机制中的作用综述

  综述, 审校

  具有生长功能的子宫内膜组织(腺体和间质)出现在子宫内膜以外的部分时,称为子宫内膜异位症(Endometriosis, EMs)。子宫内膜异位症是生育年龄妇女的多发病,主要引起疼痛及不孕不育,近些年发病率有明显上升趋势。该病的症状与体征及疾病的严重性不成比例,病变形态多样,具有浸润性,可形成广泛、严重的粘连,其发生、发展具有雌激素依赖性,易于复发。

  该病于1860年被Von Recklinehausen首次描述,其发病机制至今仍未完全明了,Sampson1921年提出的经血逆流种植学说一直是该病发病的主导理论,但有些现象却无法用该理论解释。北京协和医院的郎景和继承并发展了Sampson经血逆流种植学说,提出了“在位内膜决定论”,认为子宫内膜在宫腔外需经黏附、侵袭、血管形成等过程,得以种植、生长、发生病变,而在位内膜的特质可能起决定作用。异位内膜完成上述过程中,机体全身及局部免疫状态和功能可能起到一定作用。研究表明,相当一部分子宫内膜异位症患者都伴有免疫系统改变,且其改变情况与疾病的严重程度有一定的关系。

  淋巴细胞

  有研究发现,当评估患有子宫内膜异位症女性免疫功能时,机体非特异性免疫功能无明显变化,其T细胞介导的特异性免疫反应——细胞毒性作用被抑制,T细胞的功能被患者体内某些因子所影响。同时子宫内膜异位症患者体内NK细胞活性降低,这种改变可能由血清中或子宫内膜间质内存在的某些细胞因子介导。上述免疫功能的改变与月经周期体内雌、孕激素及前列腺素E2水平无明显相关。一些作者认为T细胞介导的细胞毒性减弱是由于细胞毒淋巴细胞经由Fas-FasL途径被激活,真实原因尚不完全明确。 有人提出HLA-G抗原(人白细胞抗原-G,参与母体与胎儿组织相容性)可抑制NK细胞及细胞毒性T细胞功能,但目前无充分的实验室证据。晚期子宫内膜异位症患者的NK细胞上被检测到较高浓度的杀伤细胞抑制性受体,这或许可以解释NK细胞的活性为什么降低。由此有些作者提出NK细胞的活性降低可能是子宫内膜异位症发生的一个重要原因,而该疾病的发展可能会进一步降低NK细胞的活性。

  子宫内膜异位症患者体内T淋巴细胞和细胞外基质之间的相互作用是明确的。有人通过研究来评估纤连蛋白和胶原IV 对T淋巴细胞增殖和细胞凋亡的影响,结果提示当应用抗CD3抗体和胶原IV培养时,处于S期的T淋巴细胞百分比普遍提高,这提示T细胞较活跃,结果还提示没有细胞凋亡和较强的T细胞增殖。这种作用对研究子宫内膜异位症的发病机制有一定的帮助。

  在猴子和人类子宫内膜异位症模型中,淋巴细胞增殖反应和T细胞毒性作用都是减弱的,IL-2可以改善上述不足,类似于细胞毒性T淋巴细胞,CD +辅助细胞在腹水中的活动性也是降低的,可能原因为其中IL-10浓度的升高。

  已有足够的证据证明Treg淋巴细胞(调节性T淋巴细胞)在调控免疫反应方面有重要作用。有人发现子宫内膜异位症患者体内Treg淋巴细胞数量会在月经期前有所增多,但因为缺少进一步的研究,导致此种现象的原因仍处于假设阶段。比如有人认为该细胞通过限制免疫反应,进而增加机体对异位组织的容受性,当然,这仍需要足够的证据来证明。 另外有人把研究的重点放在了MUC1(mucin,附膜蛋白)上,MUC1正常情况下出现在在位子宫内膜腺体,但其在卵巢子宫内膜异位灶处高表达。MUC1存在于正常子宫内膜是众所周知的,但我们对其在异位病灶的存在知之甚少。有研究者通过应用MUC1转基因喀斯特老鼠(其体内可诱导子宫内膜异位症的发生)构建了一个简单的模型,通过这个模型可以观察MUC1对子宫内膜异位症的影响。研究发现,随着疾病的发展,上述老鼠产生了高滴度的抗-MUC1抗体。此外,研究者还发现发现鼠体内Foxp3+CD4+辅助性T细胞明显增多,通过这些结果,研究者认为Th2 / Treg淋巴细胞占优势在子宫内膜异位症的发展过程中扮演重要角色,有研究者发现子宫内膜异位症患者在位内膜MUC1表达的减少与内异症疾病分期有密切相关性,可能是导致不孕的原因之一。所有这些,使得Treg淋巴细胞成为了进一步研究的热点,有研究者甚至认为MUC1可以作为很好疫苗。 巨噬细胞

  许多证据表明,伴随子宫内膜异位症的发生发展,机体内的巨噬细胞也产生了相应的变化。它们是人体腹腔内初级的防御细胞,其主要功能之一是消除细胞碎片。巨噬细胞的吞噬作用至少部分通过基质金属蛋白酶的激活和CD36受体的表达来调节,研究发现,在子宫内膜异位症患者体内,以上两种物质的表达是减少的。导致这种减少的因子是前列腺素E2。另一个重要的因子是ICAM-1(intercellular cell adhesion molecule-1,细胞间黏附分子-1),它来自于子宫内膜碎片。在溶解状态,ICAM-1降低淋巴细胞表达的LFA1(淋巴细胞功能相关分子1)的效用,进而阻碍其对NK细胞的表达。

  在子宫内膜异位患者腹腔内,巨噬细胞及其产生的细胞因子数量明显增多。然而这些增多并非是因为巨噬细胞活化,并且有很多报道说明其功能是被抑制的。进一步的研究发现巨噬细胞的ICAM-1低表达及NK细胞的KIR(killer cell inhibitroty receptor,杀伤细胞抑制受体)高表达可能是机体对移植组织产生免疫耐受的重要原因。子宫内膜间质可限制可溶性ICAM-1的产生。在一些关于鼠类子宫内膜异位损伤病理生理机制的研究中,巨噬细胞起到重要作用。其中表达的Tie-2(血管生成素-2受体)巨噬细胞参与血管生成及肿瘤生长。在一个鼠类模型中,于上述巨噬细胞周围发现有新生异位血管生成。当这些细胞减少时,内皮细胞无法有效地形成新生毛细血管,因此可以认为,增加此类细胞数量或活化其功能,是治疗子宫内膜异位症的一种可能有效手段。同样的,实验显示患有自发子宫内膜异位症的猴子基本都有细胞免疫缺陷,这说明子宫内膜细胞只能种植于细胞免疫功能被改变的宿主。如果这个假设是成立的,那么我们应该能有观察到患有子宫内膜异位症的女性发生过敏性疾病和自身免疫性疾病的概率将增高,然而,目前却没有有价值的发现。另一方面,罹患卵巢癌的风险偏高已经被证实。

  自身免疫

  一些研究表明子宫内膜异位与自身免疫性疾病存在一定的联系。早先的一些研究尤其能说明这一点。这些假设部分是基于子宫内膜异位症患者与系统性红斑狼疮患者都有较高的肌肉痛和关节痛发生率。大量证据表明,EMs妇女多克隆B细胞激活且自身抗体产生增加。这些自身抗体包括像狼疮抗体、抗磷脂抗体、抗组蛋白抗体及抗多聚核苷酸抗体。其中一些自身抗体是器官特异性的,如抗子宫内膜和卵巢的自身抗体。子宫内膜异位症是一种自身免疫性疾病的观点被许多人接受,尽管那些增高的抗体可能来自被异位子宫内膜组织激活的巨噬细胞的炎性反应。

  另一种可能性是子宫内膜异位症患者体内发现有较高水平的自身抗体。一些研究甚至发现患者体内有较高水平的抗子宫内膜抗体。大多数的这些自身抗体只是针对子宫内膜,因此它可能是该疾病的结果而非其原因。一项详尽的研究发现,大多数自身抗体都是直接针对碳水化合物抗原表位,主要利用基质金属蛋白酶功能异常或先天性糖蛋白糖基化缺陷,这便引出了一些关于自身抗体参与子宫内膜异位症的假。 另外有人认为免疫监视的减弱是子宫内膜异位症发展的重要原因。这种观点认为,异位子宫内膜逃避了免疫监。其中一个重要机制为可溶性ICAM-1的增多,它可以调节NK细胞和T淋巴细胞的细胞毒性作用。

  另人不解的是机体免疫系统为什么会攻击异位子宫内膜组织,因为它们仍可被认为是自身组织。目前知道的是一种异常的抗原抗体反应引起了抗体及补体在子宫内膜处大量蓄积。然而抗子宫内膜抗体的重要性却被人怀疑,Tanaka的研究发现,这些抗体不仅存在于子宫内膜异位症患者体内,它们也可存在于正常健康女性和男性体内。

  炎性反应

  众所周知,炎症与子宫内膜异位症之间有着密切的联系,这些联系是基于炎性标志物CRP和CA-125水平的升高。最初的炎症反应表现为细胞内流的增加。随后的急性炎症反应涉及局部血管、体细胞和免疫细胞。类似的,抗炎药物可以缓解许多子宫内膜异位症相关症状也表明炎性反应参与了该疾病的发展。

  一些动物研究表明抗炎药影响了异位组织的种植生长。但具体机制或直接的证明尚未被描述。

  一个详细的关于子宫内膜异位症不同阶段补体基因表达的研究显示,子宫内膜异位症中的慢性炎症是被体内补体控制的,其方式主要是通过经典途径(35)。目前的医学指南不推荐对腹腔内的炎症情况做评估,但这些信息可以帮助诊断疾病并判断疾病的严重程度。 细胞因子

  在子宫内膜异位症患者体内,一些细胞因子的水平明显增加,如GM-CSF、IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10及TNFα等。另外,许多生长因子也有所增多,如TGF-β、IGF-1、HGF及VEGF等。这些因子大多数都有细胞刺激活性或者促进子宫内膜细胞的有丝分裂。子宫内膜产生各种因子影响免疫系统,如前列腺素和MCP-1(monocyte chemotactic protein 1,单核细胞趋化因子-1)。有研究发现,在月经期前,释放IL-8和MCP-1的白细胞会迅速入侵。子宫内膜组织表达同样的促炎细胞因子/趋化因子,这些因子可以触发炎性反应。然而,子宫内膜异位处的细胞以另外一种方式表达以上因子。子宫内膜异位症患者腹水中上述细胞因子的含量增多明显,可能原因是孕激素受体正常表达的缺乏,子宫内膜组织支持自体淋巴细胞增值的能力低下,这可能也是改变细胞因子分泌的原因。显然,是这些因素导致异位子宫内膜黏附、侵入并增殖。

  在患子宫内膜异位症的女性体内,淋巴细胞内的细胞因子如IL-4和IL-10的表达是上调的。另外,研究发现自异位子宫内膜组织内分离出的淋巴细胞内IL-4的表达也是提高的。IFN-γ则显示相反的趋势。这些结果提示Th1/Th2平衡向Th2发生了倾斜。后续的实验显示,高表达IL-4的人工培养的异位子宫内膜基质细胞中嗜酸细胞活化趋化因子合成是增多的,该因子是Th2淋巴细胞的强力化学引物。基于上述结果,可以认为嗜酸细胞活化趋化因子-IL-4的正反馈作用促进了Th2的反应。

  有研究者利用一个鼠模型来评估IL-12在阻止子宫内膜异位症发展中的可能作用。每天注射5次IL-12使得接种区域及重量减少了77%。在人类模型中,腹腔镜下局部应用IFN-α2b显著减轻了所以症状和体征。应用TNF-α治疗也有类似的效果。令人奇怪的是,TNF-α和TNF-β都是已知的引发异位子宫内膜基质细胞增殖的因子,并参与了该疾病的发生。

  进一步的研究表明IL-1β和COX-2(Cyclooxygenase 2,环氧合酶-2)在来自卵巢子宫内膜异位组织的异位间充质干细胞内有较高的表达。IL-1通过诱导COX-2高表达来控制这些细胞的侵袭能力。

  总结

  子宫内膜异位症目前被认为是内分泌系统及免疫系统失调导致的疾病。内分泌-免疫轴的复杂性决定了该病的复杂性,认识到两大生理机制之间的联系会改变大家既往对该病的认识,并有助于对该病进行进一步的研究。对子宫内膜异位症患者体内众多参与免疫反应的细胞的活动性改变的研究,或许可以为该病的诊断和治疗提供新的思路和方法。

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