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最新基础医学类论文 受体操纵性钙通道在柔红霉素心肌损伤中的作用

2018-12-14 13:36:58来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要

  目的:本实验分别从动物、细胞模型研究受体操纵性通道在柔红霉素诱导心肌损伤中的作用及其病理生理学意义。

  方法:【动物模型】 SD 大鼠,体重110~130g,雄性,20只随机分两组每组10只,正常对照组(Control)、模型组(DNR)。Control组,腹腔注射生理盐水(NS,5ml/kg/w,持续4w);DNR 组腹腔注射柔红霉素(2.5 mg/kg/w, 持续4 w)。各组大鼠在最后1次给药后1周,行左心室插管,测LVDP、mLVP、HR、LVP-dp/dtmax 、LVSP、LVP+dp/dtmax等左心室血流动力学指标,取左心室心肌部分组织做HE染色观察心肌组织学结构;用Real-time PCR 、Western Blot检测心肌TRPCs表达。

  【细胞模型】体外分离培养乳鼠(出生1-3d)心肌细胞,雌雄不限,20只,实验分组:正常对照组、柔红霉素组(1μM DNR处理 24h)取细胞培养上清液测 LDH 和 CK 含量,用免疫荧光,Real-time PCR 检测及Western Blot等方法检测各组细胞增殖及TRPCs表达。进一步分组DNR+OAG组(100μM OAG,ROCC受体激动剂预先处理2h,再1μM DNR处理 24h)、DNR+CPA组(10μM CPA,SOCC受体激动剂预先处理2h,再1μM DNR处理 24h)、DNR+SKF组(5μM SKF96365,ROCC受体阻断剂预先处理2h,再1μM DNR处理 24h),用MTT检测各组细胞增殖情况。

  结果:【动物模型】 大鼠持续4 周腹腔注射柔红霉素使大鼠出现心肌损伤表现,表现明显的活动性减弱、嗜睡、精神状态差、体重增加缓慢、腹泻、且有死亡,可检测心肌损伤酶增加,左心室收缩、舒张功能减弱,心肌实质细胞减少,结构损伤性变化,与正常组比较柔红霉素组LDH、CK 升高(p<0.05)。大鼠左心室插管,与正常组对比,柔红霉素组大鼠mLVDP 增加(P<0.05),心率减缓(P<0.05)、LVP-dp/dtmax 降低(P<0.05)、LVP+dp/dtmax 降低(P<0.05),mLVSP 和 mLVP 无明显差别(P>0.05)大鼠心肌组织HE染色结果表明,正常组大鼠心肌纤维排列规整,核染均匀,无炎性细胞浸润;柔红霉素组心肌细胞核大、畸形、深染、心肌纤维紊乱,胞质呈溶解状态,炎性细胞增多。Real-time PCR 检测结果表明,与正常组比较柔红霉素组TRPC3、6的mRNA表达明显升高(P<0.05),TRPC1、4、5、7 mRNA表达无明显差异(P>0.05)。柔红霉素组大鼠心肌Western Blot检测结果表明,与正常组比较柔红霉素组TRPC6蛋白表达上调(P<0.05),TRPC3、7蛋白表达无明显差异(P>0.05)。

  【细胞模型】镜下观察:原代培养乳鼠心肌细胞,心肌细胞可交织成网,可见心肌细胞以统一的节律成片搏动,生长状态良好可用于制备模型。与正常组比较,柔红霉素1μM 共培养24h生存率为 75.08±1.26%(P<0.05),故损伤组的柔红霉素浓度定为1μM ,建立细胞损伤模型。同时观察形态学改变发现:1μM DNR 处理24 h,细胞失去正常梭形或星形形态,胞核固缩,胞浆空泡化。与正常组比较,柔红霉素组心肌细胞培养液中CK 和 LDH 含量升高(P<0.01)。Real-time PCR 检测结果表明,与正常组比较,柔红霉素组心肌细胞TRPC3、6 、7mRNA表达量增加(P<0.05),TRPC1、4、5 mRNA表达无明显差异(P>0.05)。DNR 组乳鼠心肌细胞Western Blot检测结果表明,与正常组组比较DNR组TRPC6蛋白表达上调(P<0.05),TRPC3、7蛋白表达无明显差异(P>0.05)。与正常组比较单独使用OAG、CPA、SKF96365对正常乳鼠心肌细胞生存率无明显影响(P>0.05)。与正常组组比较DNR组乳鼠细胞生存率降低(P<0.05),与DNR组比较DNR+SKF组细胞生存率增加(P<0.05),与DNR组比较DNR+OAG组细胞生存率降低(P<0.05),与DNR组比较DNR+CPA组细胞生存率无明显差异(P>0.05)。免疫荧光镜下观察可见TRPC6多克隆抗体为绿色荧光,而 DAPI 染色的细胞核呈蓝色荧光。与Control组比较,DNR组乳鼠心肌细胞TRPC6免疫荧光剂在损伤心肌细胞中沉积呈阳性,Control组乳鼠心肌细胞免疫荧光剂在正常细胞中沉积较少呈现弱阳性。与DNR组比较,OAG激动ROCC,则DNR处理乳鼠心肌细胞TRPC6表达量增加了21.72%(P<0.05);SKF96365抑制TRPCs后,DNR处理乳鼠心肌细胞TRPC6表达量降低了38.42%(P<0.05);CPA激动SOCC,DNR处理乳鼠心肌细胞TRPC6表达量没有明显改变(P>0.05)。

  结论:1.SD 大鼠腹腔注射柔红霉素能够制备心肌损伤动物模型,乳鼠心肌细胞与柔红霉素共培养24h可制备柔红霉素损伤细胞模型,诱导心肌细胞损伤,左心室发生重构。2.柔红霉素组大鼠及乳鼠心肌细胞上 TRPC3、TRPC7 mRNA表达增加,TRPC6 mRNA的表达量上调,增强TRPC6/ROCC所介导的功能,这可能是柔红霉素心肌损伤过程中的重要环节。

  本研究为TRPC6未来作为防治疗蒽环类药物心脏毒提供重要依据,为开发新的临床防治策略提供新的思考。

  关键词 : 柔红霉素, 经典瞬时受体电位, 受体操纵性钙通道,心肌细胞, 钙离子

  引言

  蒽环类药物包括柔红霉素(Daunorubicin,DNR)、表柔比星、吡柔比星、多柔比星等,临床上在常见的血液系统肿瘤:如白血病、淋巴瘤,实体肿瘤:如肺癌、乳腺癌等肿瘤化疗过程中使用。但此类药物化疗的过程中,产生最大的毒副作用是心脏毒性。可表现为心律失常、左心功能不全、心包炎等等,目前尚无有效的防治方法,所以限制此类药物在临床上的广泛应用,从而导致化疗无法正常的进行。

  图 1. 柔红霉素结构

  目前,对于柔红霉素产生的心脏毒性机制并未十分清楚,已知发病机制的治疗措施均未能减轻DNR心肌损伤或减少其发病率。因此,急待在发病机制方面取得新的进展与突破,为柔红霉素心肌损伤的预防工作与治疗决策提供新的思路。

  Ca2+作为第二信在诸多心脏生理与病理生理过程中发挥着重要作用。钙稳态失衡与钙处理障碍是DNR心肌损伤的重要机制,但是造成钙稳态失衡和钙处理障碍的原因远未阐明REF _Ref7248 \w \h 。心肌细胞钙稳态的调控十分复杂。心肌细胞膜上介导钙内流的钙离子通道主要有:L-型电压依赖性Ca2+通道(L-VDCC)以及由瞬时感受器电位受体( Transient receptor potenial canonical,TRPC)基因家族编码的非选择性阳离子通道介导的受体操纵性Ca2+通道(Receptor operated calcium chnnel,ROCC)和钙池操纵性Ca2+通道(Store operated calcium channel,SOCC)。众所周知,心肌细胞兴奋收缩耦联过程中,L-VDCC发挥着关键作用:经L-VDCC介导内流的Ca2+,与肌浆网RYR2受体结合,触发肌浆网钙池的释放,产生钙瞬变,与肌浆网RYR2受体结合,触发肌浆网钙池的释放,产生钙瞬变,兴奋-收缩耦联机制从而使心肌细胞发生收缩。目前已对DNR损伤心肌中L-VDCC的表达与功能的改变进行了大量研究。但相关研究显示:应用硝苯地平、维拉帕米等药物阻断L-VDCC,但无法阻止DNR损伤过程中,浓度持续升高的胞内Ca2+,同时还会影响心肌收缩、增加DNR在心肌的蓄积,从而增加DNR的心脏毒性;临床实验性治疗也显示:L-VDCC阻滞剂无助于降低DNR心脏毒性的发病率和减轻DNR心肌损伤。

  目前,TRPCs在DNR心肌损伤中作用的相关研究尚属空白,TRPCs在心肌细胞许多的生理和病理生理活动中起着十分重要作用,逐渐成为新的研究热点。规范性瞬时感受器电位基因家族由7个成员组成(TRPC1~7,TRPC2无生理功能基因),编码包括非选择性阳离子通道。TRPC1、4、5、6蛋白在人体心脏中表达,而大鼠和小鼠心肌中TRPC1~7蛋白均有表达。TRPC家庭成员中TRPC1、4、5介导SOCE(Store-operatedcalciumentry),TRPC3、6、7介导ROCE(Receptor-operatedcalciumentry)。在心肌细胞中,SOCE主要是重新充盈细胞内钙池;ROCE则是钙相关信号传入的重要节点,其作用十分重要,但是ROCC的生理功能和调控机制还远未明确。

  近年来,诸多报道指出:ROCC,尤其是TRPC6与心律失常、心肌重构、心脏肥大和心功能衰竭有关。值得注意的是:蒽环类抗生素心肌病的临床表现以及前期预实验建立的大鼠DNR心肌损伤模型中,也出现了充血性心衰、心肌肥大、心律失常。因此,本实验目的在于重拟出柔红霉素发生心肌损伤环境,建立柔红霉素产生的心肌组织与细胞损伤模型,探讨受体操纵性钙通道在柔红霉素诱导的心肌损伤中的作用,通过SD大鼠腹腔注射DNR累积剂量10mg/kg 及乳鼠心肌细胞柔红霉素终浓度为1μM共培养24h 模拟出损伤模型。通过检测大鼠左心室内压、心肌形态学变化,并从免疫荧光、Real-time PCR 及Western Blot检测方法从器官-细胞-分子三个不同水平检测动物、细胞两种柔红霉素心肌损伤模型中ROCC是否上调。研究受体操作性钙通道在DNR诱发心肌损伤过程中的生理和病理生理机制,为将来防治蒽环类药物化疗过程中心肌毒性作用提供新靶点与新思路。

  结果

  1. 动物实验

  1.1 DNR损伤大鼠一般状况

  正常组腹腔注射生理盐水大鼠生长情况良好,体重增加。腹腔注射柔红霉素组在第3次药给药后出现明显活动性减弱、嗜睡、精神状态差、体重增加缓慢;从第4次给后以上症状逐渐加重,出现腹泻,2只死亡。

  1.2 DNR 损伤大鼠左心室血流动力学变化

  大鼠左心室插管,与正常腹腔注射生理盐水组对比,注射柔红霉素组大鼠mLVDP 增加(P<0.05),心率减少(P<0.05)、LVP-dp/dtmax 减少(P<0.05)、LVP+dp/dtmax 减少(P<0.05),mLVSP 和 mLVP 无明显差别(P>0.05)。上述结果提示柔红霉素损伤组心脏的收缩、舒张功能均下降。

  图 3. 大鼠 DNR损伤对心率影响( `x  s ,n=8, * P<0.05 vs Control)

  图 4. 大鼠 DNR损伤对mLVSP影响(`x  s ,n=8,* P<0.05 vs Control)

  图5.大鼠 DNR损伤对mLVP影响( `x  s ,n=8,* P<0.05 vs Control)

  图 6 大鼠 DNR损伤对mLVDP影响(`x  s ,n=8,

  * P<0.05 vs Control,**P<0.01 vs Control)

  图 7. 大鼠 DNR损伤对LVP+dp/dtmax影响(` x  s ,n=8,

  * P<0.05 vs Control,**P<0.01 vs Control)

  图 8大鼠 DNR损伤对LVP-dp/dtmax影响(` x  s ,n=8,

  * P<0.05 vs Control,**P<0.01 vs Control)

  1.3 DNR损伤大鼠血浆 LDH 和 CK 含量变化

  与正常组比较,柔红霉素注射组乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶( CK) 含量增加(P<0.05); LDH 和 CK 含量升高提示心肌损伤,是诊断心肌损伤的常用指标 REF _Ref10465 \w \h [24]。

  表 7 DNR 损伤大鼠血浆 LDH 和 CK 含量影响( `x  s ,* P<0.05 vs Control n=3)

  GroupLDH(U/L)CK(U/L)Control395±73119±45DNR1537±338* 265±49* 

  1.4 DNR 损伤大鼠心肌组织学改变

  大鼠心肌组织HE染色结果表明,正常组大鼠心肌纤维排列规整,核染均匀,无炎性浸润;DNR 组心肌细胞核大、畸形、深染心肌纤维紊乱,细胞间隙增加,胞质呈溶解状态,炎性细胞浸润增多。

  A:正常组 B:柔红霉素组

  图9. DNR 损伤大鼠心肌组织学结构影响(HE×400)

  1.5Real time PCR 检测大鼠心肌组织TRPC1~7mRNA

  Real time PCR 检测结果表明,与Control组比较,DNR组大鼠心肌组织中介导ROCC的 TRPC3、6的mRNA表达明显升高(P<0.05),TRPC3 mRNA 升高32.7 %, TRPC6 mRNA升高65.2 %,TRPC7 mRNA水平无明显差异(P>0.05);介导SOCC的。TRPC1、4、5、7mRNA表达均无明显差异(P>0.05)。

  图10. DNR 损伤大鼠心肌组织 TRPC3、6、7基因

  表达影响(`x  s ,n=6)* P<0.05 vs Control。

  图11. DNR损伤大鼠心肌组织 TRPC1、4、5基因表达

  影响(`x  s ,n=6)* P<0.05 vs Control

  1.6柔红霉素损伤大鼠心肌组织中TRPCs蛋白表达的变化

  进一步利用蛋白免疫印迹法检测大鼠心肌组织中与ROCC相关的TRPC3、6、7蛋白含量的改变。结果如图12,13,14所示: DNR组TRPC6蛋白升高38.7 %(DNR vs. Control,P<0.05),TRPC3、7蛋白表达未见明显差异(P>0.05)。

  图12. DNR 损伤大鼠心肌组织TRPC3蛋白表达

  (` x  s ,n=6) * P<0.05 vs Control

  图13. DNR 损伤大鼠心肌组织 TRPC6蛋白表达

  (` x  s ,n=6)* P<0.05 vs Control

  图14. DNR 损伤大鼠心肌组织 TRPC7蛋白表达

  (`x  s ,n=8)* P<0.05 vs Control

  2 细胞模型

  2.1原代乳鼠心肌细胞培养

  镜下观察:不同培养时间的原代乳鼠心肌细胞的细胞形态。结果如图15所示:培养12 h,出现贴壁,并伸出伪足;培养24 h,可观察到细胞伪足,交织成网,少数细胞开始自发性搏动,节律尚不一致;培养到48h,心肌细胞呈现网状排列,自发性搏动细胞数量进一步增加;培养72h,细胞以统一的频率搏动。取培养72h的乳大鼠心肌细胞用于后续研究。

  图 15. 乳鼠心肌细胞生长状况

  2.2 原代乳鼠心肌细胞DNR 损伤模型的建立

  以不同浓度DNR处理乳鼠心肌细胞 24h,考察其对心肌细胞生存率的影响。如图16。所示:DNR降低乳鼠心肌细胞存活率,作用呈现剂量依赖性。其中,1 μM DNR 处理24 h,心肌细胞生存率降至75.08±1.26 %,差别有显著性(P<0.05)。观察形态学改变发现:1μM DNR 处理24 h,细胞失去正常梭形或星形形态,胞核固缩,胞浆空泡化。

  图16 不同浓度柔红霉素对乳鼠心肌细胞存活率影响

  ( `x  s ,n=3)* P<0.05 vs Control

  图17. DNR 1μM 处理乳鼠心肌细胞 24h细胞生长状态

  2.3 DNR 损伤的乳鼠心肌细胞心肌酶检测

  与Control组比较,DNR组 CK 和 LDH 含量分别从48.56±5.43 U/L和51.34±0.24U/L升至59.65±11.43 U/L和88.87±1.24 U/L,差别有显著性 ,(* P<0.01),提示心肌细胞膜受损,心肌酶外漏。

  表 7 DNR 细胞损伤模型 LDH 与 CK 含量检测(`x  s ,n=3)

  分组Control(U/L)DNR(U/L)LDH48.56±5.4359.65±11.43* *CK71.34±3.2488.87±8.24* *

  * P<0.05 vs Control:** P<0.0 1 vs Control

  2.4 DNR损伤乳鼠心肌细胞中TRPCs表达的变化

  2.4.1 DNR损伤乳鼠心肌细胞TRPCs mRNA基因表达影响

  Real-time PCR分析DNR损伤乳鼠心肌细胞中TRPCs mRNA含量的变化。结果如图18、19 所示:1μM 处理乳鼠心肌细胞 24h,与ROCC相关的TRPC3、6、7 mRNA均水平分别升高35.3 %、52.1 % 和29.7 %(P<0.05),而与SOCC相关的TRPC1、4、5含量未见明显改变(P<0.05)

  图18. DNR乳鼠心肌细胞 TRPC3、6、7基因表达影响

  ( `x  s ,n=6)* P<0.05 vs Control

  图19. DNR乳鼠心肌细胞 TRPC1、4、5基因表达影响

  ( `x  s ,n=6)* P<0.05 vs Control

  我们进一步在DNR心肌损伤的时间进程中追踪TRPCsmRNA含量的改变,选取DNR处理6,12,24,36,48 h的时间节点进行监测。如图20、21、22所示:心肌细胞损伤模型TRPC3mRNA从24h开始到36h水平持续升高(P<0.05),TRPC6 mRNA从6h开始到48h水平持续升高(P<0.05),TRPC7 mRNA从12h开始到36h水平持续升高(P<0.05),其他时间点未见显著差异(P>0.05)。

  图20.DNR乳鼠心肌细胞在不同损伤时间TRPC3基因表达影响

  (` x  s ,n=6)* P<0.05 vs Control:* *P<0.01 vs Control

  图21.DNR乳鼠心肌细胞在不同损伤时间TRPC6基因表达影响

  (`x  s ,n=6)* P<0.05 vs Control

  图22.DNR乳鼠心肌细胞在不同损伤时间TRPC7基因表达影响

  (` x  s ,n=6)* P<0.05 vs Control

  2.4.2 DNR 损伤乳鼠心肌细胞TRPCs蛋白表达的改变

  2.4.2.1 DNR 组乳鼠心肌细胞Western Blot检测

  如图 23、24、25所示:DNR 组乳鼠心肌细胞Western Blot检测结果表明,与Control组比较DNR组TRPC6蛋白升高31.3 %(P<0.05),TRPC3、7蛋白表达未见显著性差异(P>0.05)。

  图23. DNR 损伤乳鼠心肌细TRPC3蛋白表达影响

  ( `x  s ,n=6)* P<0.05 vs Control

  图24.DNR 损伤乳鼠心肌细TRPC6蛋白表达影响

  (`x  s ,n=6)* P<0.05 vs Control

  图25.DNR 损伤乳鼠心肌细TRPC7蛋白表达影响

  (`x  s ,n=8)* P<0.05 vs Control

  2.4.2.2 TPRC6免疫荧光

  Western Blot检测结果显示,DNR损伤乳鼠心肌细胞中TRPCs家族成员中,参与ROCC的TRPC3、6、7中在起主导作用的TRPC6蛋白含量增加最为显著。进一步利用免疫荧光技术对乳鼠心肌细胞中TRPC6的表达进行功能定位。如图26所示:兔抗大鼠TRPC6多克隆抗体与 FITC 标记山羊抗兔 Ig G 抗体染色后,于正置荧光显微镜下观察可见TRPC6多克隆抗体为绿色荧光,而 DAPI 染色的细胞核呈蓝色荧光。与Control组比较,DNR组乳鼠心肌细胞TRPC6免疫荧光剂在损伤心肌细胞中沉积呈阳性,Control组乳鼠心肌细胞免疫荧光剂在正常细胞中沉积较少呈现弱阳性。

  Control

  DNR

  DAPI

  DAPI

  Merge

  TRPC6

  图26.DNR损伤的乳鼠心肌细胞TRPC6免疫荧光

  2.5 ROCC及SOCC对DNR诱导乳鼠心肌细胞损伤的影响

  前面的研究中,我们在DNR损伤的体内和体外模型中均发现与ROCC相关的TRPCs的表达有不同程度的增加。我们以100μM OAG、10μM CPA分别激动ROCC和SOCC,5μM SKF96365抑制TRPCs,评估ROCC、SOCC对DNR处理乳鼠心肌细胞生存率的影响。如图27所示:单独使用OAG、CPA、SKF96365对乳鼠心肌细胞生存率无明显影响(P>0.05)。

  图27.受体激动剂与阻断剂处理正常乳鼠心肌细胞 24h

  (`x  s ,n=3)* P<0.05 vs Control

  进一步研究,分别以OAG、CPA、SKF 2h预处理激动或抑制ROCC、SOCC后,再以DNR处理乳鼠心肌细胞观察细胞生存率的改变。如图28所示:与DNR组比较,SKF96365抑制TRPCs后,DNR处理乳鼠心肌细胞生存率明显升高(DNR生存率69.81% vs. D+SKF生存率97.47 %,DNR vs.D+SKF, P<0.01);CPA激动SOCC,DNR处理乳鼠心肌细胞生存率没有明显改变(P>0.05);OAG激动ROCC,则DNR处理乳鼠心肌细胞生存率降低(DNR生存率69.81 % vs.D+ OAG生存率57.40 %,DNR vs.D+OAG, P<0.01)。如图29所示:与DNR组比较,OAG激动ROCC,则DNR处理乳鼠心肌细胞TRPC6表达量增加了21.72%(P<0.05);SKF96365抑制TRPCs后,DNR处理乳鼠心肌细胞TRPC6表达量降低了38.42%(P<0.05);CPA激动SOCC,DNR处理乳鼠心肌细胞TRPC6表达量没有明显改变(P>0.05)。

  图28.激动剂、阻断剂与DNR 1μM共同处理乳鼠心肌细胞 24h(`x  s ,n=3)* P<0.05 vs Control,#P<0.05 vs DNR;##P<0.01vs DNR

  图29.激动剂与阻断剂与DNR 1μM共同处理TRPC6蛋白表达(`x  s ,n=3* )P<0.05 vs Control,#P<0.05 vs DNR

  讨论

  本研究利用大鼠柔红霉素心肌损伤模型和原代乳鼠心肌细胞柔红霉素心肌损伤模型,通过Real-time PCR 、Western Blot等方法监测DNR损伤心肌中TRPCs表达,并进一步探讨了TRPCs介导的ROCC和SOCC对DNR损伤乳鼠心肌细胞生存率的影响。研究发现柔红霉素损伤心肌中ROCC相关的TRPC3、6、7 mRNA水平有不同程度的升高,TRPC6蛋白表达增加。阻断TRPCs能提高DNR处理的乳鼠心肌细胞生存率;激动ROCC受体心肌细胞生存率进一步降低;激动SOCC,心肌细胞生存率没有明显变化。以上结果提示,TRPC3、6、7介导的ROCC可能在DNR心肌损伤中起重要作用,更深层次机制还有待在后续研究中进一步充实。

  1 DNR心肌损伤模型

  柔红霉素、多柔比星为临床常见蒽环类肿瘤化疗药物,常用于白血病、淋巴瘤,肺癌、乳腺癌。但此类药物化疗的过程中,产生最大的毒副作用是心脏毒性。可表现为心律失常、左心功能不全、心包炎等等,目前尚无有效的防治方法,所以限制此类药物在临床上的广泛应用,从而导致化疗无法正常的进行。

  大鼠心肌DNR 损伤模型建立与评价

  本课题参照 DNR 临床用药剂量,采用大鼠腹腔注射 DNR(2.5 mg/kg/w, 4 w),累积剂量 10mg/kg,构建大鼠柔红霉素心肌损伤模型,腹腔注射柔红霉素组在第3次药给药后出现明显活动性减弱、嗜睡、精神状态差、体重增加缓慢;从第4次给后以上症状逐渐加重,出现腹泻,2只死亡。血流动力学监测显示,DNR损伤组大鼠心脏收缩和舒张功能受损。血清心肌酶升高,心肌组织呈现炎性浸润,胞质溶解等,上述改变符合蒽环类药物心肌损伤的临床表现。

  1.2原代心肌细胞DNR 损伤模型的建立与评价

  本研究采用原代培养的乳大鼠心肌细胞建立柔红霉素心肌损伤的体外模型。原代培养的心肌细胞可在一定程度上保持心肌结构及功能上的某些特点,如自发性节律搏动等,且心肌细胞的培养具有简便、定量、重复性好以及不受神经体液等因素影响的特点[34-38]。本研究结合前期预实验结果和不同浓度柔红霉素对 乳鼠心肌细胞存活率的影响,采用 1μM DNR 处理 乳鼠心肌细胞 24h,建立 DNR 损伤大鼠心肌细胞体外模型。测定心肌细胞存活率、心肌细胞培养上清 CK 和 LDH 含量,评价 DNR 对心肌细胞的损伤程度。

  2.动物、细胞DNR损伤模型TRPCs表达

  钙稳态失衡和钙处理障碍是DNR心肌损伤的重要机制,但是造成钙稳态失衡和钙处理障碍的原因远未阐明。心肌细胞膜上介导钙内流的钙离子通道主要有:L-型电压依赖性Ca2+通道(L-VDCC)以及由经典瞬时感受器电位受体TRPC)基因家族编码的非选择性阳离子通道介导的受体操纵性Ca2+通道和钙池操纵性Ca2+通道。众所周知,心肌细胞含有丰富的L-VDCC。L-VDCC在心肌兴奋收缩耦联中起重要作用:经L-VDCC介导内流的Ca2+,与肌浆网RYR2受体结合,触发肌浆网钙池的释放,产生钙瞬变,通过兴奋-收缩耦联引起心肌的收缩。目前已对DNR损伤心肌中L-VDCC的表达与功能的改变进行了大量研究。但相关研究显示:应用硝苯地平、维拉帕米等药物阻断L-VDCC,不能中止DNR损伤心肌细胞内Ca2+浓度持续升高,还会影响心肌收缩、增加DNR在心肌的蓄积,从而增加DNR的心脏毒性;临床实验性治疗也显示:L-VDCC阻滞剂无助于降低DNR心脏毒性的发病率和减轻DNR心肌损伤。目前,TRPCs在DNR心肌损伤中作用的相关研究尚属空白。证据显示:TRPCs在心肌的多种生理和病理过程中起重要作用,逐渐成为新的研究热点。规范性瞬时感受器电位基因家族由7个成员组成(TRPC1~7,TRPC2为伪基因)编码非选择性阳离子通道蛋白。人类心脏表达TRPC1,TRPC4,TRPC5和TRPC6蛋白,而大鼠和小鼠心肌中TRPC1~7蛋白均有表达。TRPC家庭成员中TRPC1/4/5介导SOCE,TRPC3/6/7介导ROCE。在心肌细胞中,SOCE主要是重新充盈细胞内钙池;ROCE则是钙相关信号传入的重要节点。相关研究显示,ROCC尤其是TRPC6与心律失常、心肌重构、心脏肥大和心功能衰竭有着密切的关系。

  本研究利用大鼠柔红霉素心肌损伤模型和乳鼠心肌细胞柔红霉素心肌损伤模型,从体内和体外考察柔红霉素心肌损伤时TRPCs表达的改变。在柔红霉素心肌损伤的体内和体外两种模型中,介导SOCC的TRPC1、4、5的表达没有发生变化,而介导ROCC的TRPC3、6、7的表达有不同程度的增加。利用乳鼠心肌细胞柔红霉素心肌损伤模型动态追踪TRPC3、6、7的表达,显示: 柔红霉素心肌损伤时TRPC3、6、7 mRNA水平呈现先增高后降低的趋势,表达高峰出现的柔红霉素处理24至36小时左右。以上结果提示,可能主要是SOCC参与了柔红霉素心肌损伤,而SOCC在柔红霉素心肌损伤中的作用相对有限。此外,ROCC可能在柔红霉素心肌损伤的早期和中期发挥作用。

  我们综合应用ROCC和SOCC的激动剂和抑制剂,通过比较柔红霉素损伤乳鼠心肌细胞生存率,进一步了解ROCC和SOCC对柔红霉素心肌损伤的影响。TRPCs的非选择性抑制剂SKF96365预处理[9],显著升高柔红霉素损伤心肌细胞生存率,TRPC6蛋白表达量降低。ROCC选择性激动剂OAG,使心肌细胞生存率降低,TRPC6蛋白表达量增加,而SOCC选择性激动CPA则对生存率及TRPC6蛋白表达量无影响。综合上述信息,我们可以推断:柔红霉素心肌损伤中,TRPC 3、6、7介导的ROCC降低心肌细胞生存率,促进心肌损伤,因此可能是柔红霉素心肌损伤的一个重要的机制;而TRPC1、4、5介导的SOCC可能与柔红霉素心肌损伤关系不密切。

  结论

  SD 大鼠腹腔注射柔红霉素能够制备心肌损伤动物模型,乳鼠心肌细胞与柔红霉素共培养24h可制备柔红霉素损伤细胞模型,诱导心肌细胞损伤,左心室发生重构。2.柔红霉素组大鼠及乳鼠心肌细胞上 TRPC3、TRPC7 mRNA表达增加。TRPC6 mRNA的表达量上调,增强TRPC6/ROCC所介导的功能,这可能是柔红霉素心肌损伤过程中的重要环节。

  本研究为TRPC6未来作为防治疗蒽环类药物心脏毒提供重要依据,为开发新的临床防治策略提供新的思考。

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