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致心律失常型右室心肌病心肌组织中脑钠肽(BNP)的表达规律的医学论文

2018-12-11 10:11:12来源:组稿人论文网作者:婷婷

  前言

  致心律失常型右室心肌病(Arrhythmogetic right ventricular cardiomyopathy,ARVC)是一种常染色体显性遗传的原发性心肌病。临床上主要表现为心律失常、昏厥以及心力衰竭,也是心源性猝死的一个主要原因。1995年,ARVC与扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病及未分类型心肌病被世界卫生组织(WHO)列为心肌病范畴,是青壮年尤其是年轻运动员猝死的主要原因之一。据统计,ARVC的发病率约为1/2000-1/5000。ARVC的特征性病理学改变为右心室心肌被纤维组织或脂肪组织所替代,其病变好发于右心室的“发育不良三角”(右心室流入道、心尖部、右心室流出道),一般起始于右心室的外膜下或中间心肌层,逐渐累积心内膜,甚至累积左心室,进而导致严重的恶性心律失常或心力衰竭而威胁患者生命。

  在法医学实际鉴定中,经常会遇见疑似ARVC的案件,然而有些案件死者心脏的病变并不是很典型,这就给死亡原因的鉴定带来了很大困难。近些年来,ARVC分子遗传学方面的研究取得了较大的进展,普遍认为ARVC是一种桥粒蛋白编码基因突变所导致的遗传性疾病,通过对ARVC病人的基因检测发现,40%-50%患者存在一个或多个基因突变,其中血小板亲和蛋白-2(PKP2)最为常见,还有桥粒斑蛋白(DSP)、桥粒胶蛋白-2(DSC2)、桥粒芯糖蛋白-2(DSG2)、斑珠蛋白(JUP)等,然而死后基因检测并不是法医病理学死因鉴定的常规方法。

  研究证明,脑钠肽(B-type natriuretic peptide,BNP)在法医学上可以反映死者生前心功能状态。临床研究也报道,ARVC的患者血清中BNP水平升高,且BNP的水平可以反映右心室心功能障碍程度及致心律失常的基础。因此,BNP的分子病理学检测对于探究心源性猝死患者、尤其是缺乏典型形态学改变心源性猝死患者的死前心功能状态具有重要意义。本实验通过免疫组织化学染色、HE染色、免疫胶体金法以及分子病理学方法来探究ARVC死者心肌组中的BNP表达情况,以期为ARVC的法医病理学诊断提供依据。

  实验材料与方法

  一、实验材料

  (一)主要试剂及来源

  兔抗人BNP多克隆抗体(AB125269,Abcam,UK),SP-9001免疫组化染色试剂盒(ZYMED,America),浓缩型DAB试剂盒(ZLI9018,中杉金桥,北京),RIPA裂解液(P0013B,碧云天,上海),预染蛋白Marker(26616,Thermo,USA),多克隆山羊抗兔IgG(ZB-2301,中杉金桥,北京),ECL发光剂(sc-2048,Santa Cruz,America),RNAiso Plus(D9108A,Takara Biotechnology,Japan),PrimeScript™RT reagent Kit(Takara,DRR037,Japan),SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(Takara,RR820A,Japan),NT-proBNP胶体金检测试剂盒(南京基蛋,中国)。

  (二)实验仪器

  8通道powerlab 8/30高速记录仪(ML-870,AD Instrument,Australia),微量注射泵(ALC-IP900,奥尔科特生物科技有限公司,上海),石蜡切片机(Leica),光学显微镜(Olympus,Japan),紫外可见光分光光度计(NanoPhotometer,IMPLEN,Germany),台式高速离心机,电泳仪(BIO-RAD,America),转印仪(BIO-RAD,America),计算机显微图像分析系统(Motic Image Advanced 3.2),PCR仪(Takara,TP600),ABI PRISM®7500 Real-time PCR System(Applied Biosystems,USA),FIA-8000免疫定量分析仪(南京基蛋,中国),SPSS17.0 for windows统计分析系统及XLSTAT 2014(Addinsoft,Paris,France)等。

  二、实验方法

  (一)案例分组及死因诊断标准

  本实验选取了56例猝死解剖案例为实验标本(死亡时间<30min、死后经过时间<48h或尸体在死后6h内冷冻保存),按照死亡原因进行分组:致心律失常型右室心肌病组(ARVC,8例);急性缺血性心肌病(其中伴有明显心肌坏死为急性心肌梗死组,AMI,14例;不伴有明显心肌坏死为心肌缺血组,IHD,20例);药物过敏反应组(DAR,6例);对照组(高坠或交通事故案例,Control,8例)。所选案例包括45名男性尸体、11名女性尸体,年龄分布在14岁~80岁,案例的死因都是在经过系统解剖、组织病理学检查、毒理学检查及生物化学检查基础之上做出的诊断,包含与死因无关的其他系统疾病或损伤的案例均被剔除实验组。本实验中药物过敏反应案例均有明确临床病历记载静脉注射抗生素致过敏性休克死亡,尸检可见喉头、会厌、肺水肿,嗜酸性粒细胞及肥大细胞浸润。上述心源性猝死案例的主要尸检所见为:急性心肌梗死案例的冠状动脉狭窄>75%、有新鲜的局部心肌损伤(心肌纤维嗜伊红染色增强,典型的缺血性凝固性坏死伴或不伴心肌间质出血,或炎性细胞浸润);心肌缺血组案例冠状动脉狭窄>75%,弥漫性间质充血、水肿,片状心肌嗜伊红染色增强,部分伴有多发出血和收缩带样改变,但无心肌坏死;致心律失常型右室心肌病案例遵循Protonotarios和Basso的诊断标准,可见严重右心室扩张及右室游离壁心肌组织被纤维、脂肪替代,心肌萎缩,且没有冠状动脉病变。各组具体情况见表1。

  表1,人体标本实验分组死因例数男性/

  女性年龄

  (岁)心脏重量

  (g)双肺重量

  (g)极值中位数极值中位数极值中位数ARVC86/224-6042268-580400855-16001333AIHDAMI1412/238-7050291-530425804-17501325IHD2017/330-8054258-559412912-16931431DAR62/440-7245260-425382650-14111055C88/014-5948320-380350633-13501130Total5645/1114-8049258-580395633-17501313C对照组,DAR药物过敏反应组,ARVC致心律失常型右室心肌病组,AIHD急性心肌缺血性心脏病,AMI急性心肌梗死

  (二)石蜡切片的制作

  取左室侧壁、右室侧壁及室间隔心肌,经4%多聚甲醛/PBS固定,水洗、脱水、透明,石蜡包埋,进行常规石蜡切片,贴于经APES处理后的载玻片上。

  (三)HE染色

  1、切片脱蜡,水化;

  2、苏木素染色7分钟;

  3、1%盐酸酒精分化后,自来水返蓝30分钟;

  4、1%伊红染色1分钟,蒸馏水洗;

  梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。

  (四)BNP免疫组织化学染色

  1、实验步骤

  (1)石蜡切片脱蜡至水;

  (2)3%过氧化氢孵育40分钟,以消除内源性过氧化物酶活性;

  (3)滴加封闭用正常山羊血清工作液,孵育2小时;

  (4)滴加1:500兔抗人BNP抗体,4℃过夜;

  (5)滴加生物素二抗工作液,室温孵育1小时;

  (6)滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,室温孵育1小时;

  (7)DAB显色;

  (8)苏木素染核,1%盐酸酒精分化,自来水返蓝;

  (9)切片脱水、透明、中性树胶封片。

  (五)免疫胶体金法检测心包液中NT-proBNP浓度

  1、实验步骤

  (1)解剖时留取1-2ml心包液于-20℃冻存;

  (2)取心包液原液100ul用生理盐水稀释2倍;

  (3)按试剂盒说明书滴加稀释后样品,室温静置15min;

  (4)通过免疫定量分析仪读取NT-proBNP的浓度。

  2、结果判定

  NT-proBNP免疫胶体金检测试剂盒的灵敏度范围为100pg/ml~35000pg/ml,因检测样品稀释2倍,故低于试剂盒检测灵敏度的样品记作最低浓度200pg/ml。临床上NT-proBNP的参考值为<300pg/ml。

  (六)Real-time PCR

  1、RNA提取、定量

  (1)将液氮研磨后的心肌组织样品(约100mg)放入1.5mlEP管中,同时加入Trizol溶液,震荡混匀,室温静置5分钟;

  (2)12000r/min、4℃离心5分钟,将上清液转移入另一个1.5ml的EP管中,弃掉沉淀;

  (3)加入1/5体积的氯仿,用力震荡EP管30秒,充分混匀后室温静置5分钟,12000r/min、4℃离心15分钟;

  (4)将上层无色水相转移至另一个1.5mlEP管中(约500ul),加入等体积的异丙醇,震荡混匀后室温下静置10分钟,12000r/min、4℃离心10分钟;

  (5)小心弃去上清,留取沉淀。加1mlDEPC水配置的75%乙醇溶液,震荡洗涤沉淀后,12000r/min、4℃离心5分钟;

  (6)小心弃去上清,留取沉淀于超净台中自然晾干,再加入30ul的DEPC水溶解RNA;

  (7)取2ulRNA溶液,用紫外可见分光光度计(NanoPhotometer,IMPLEN,Germany)测定OD260/OD280值和RNA浓度,当OD260/280比值在1.8-2.0时认为RNA浓度和纯度合格;

  (8)将样品部分RNA稀释成200ng/μl用于反转录。

  2、反转录反应

  按PrimeScript™RT reagent Kit(Takara,DRR037,Japan)说明,将RNA反转录成cDNA。反转录体系如表2,反转录条件:37℃,15min;85℃,5sec;4℃,5min。

  表2,反转录体系(10ul体系)试剂剂量5×PrimeScript Buffer2μlPrimeScript RT Enzyme Mix I0.5μlOligo dT Primer(50μM)0.5μlRandom 6 mers(100μM)0.5μlTotal RNA2μlRNase Free dH2O4.5μl合计10μl

  3、Real-Time PCR反应

  应用ABI PRISM®7500 Real-time PCR System(Applied Biosystems,USA)进行PCR扩增,以反转录所得到的cDNA为模板使用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(Takara,RR820A,Japan)进行反应。PCR扩增体系见表3,上下游引物序列见表4,扩增条件:第一阶段;95℃,30s;第二阶段(40个循环)95℃,5s,;60℃,34s;第三阶段:95℃15s,60℃30s,95℃15s。

  表3,Real-time PCR扩增体系试剂剂量SYBR®Premix Ex TaqⅡ(2×)10μl上游引物0.8μl下游引物0.8μlROX Reference Dye II(50×)0.4μlcDNA solution2μlRNase Free dH2O6μl合计20μl

  表4,BNP、GAPDH引物序列基因名称种属序列BNP人上游:5’-AAGATGGTGCAAGGGTCTG-3’

  下游:5’-TGTGGAATCAGAAGCAGGTG-3’GAPDH人上游:5’-ACATCGCTCAGACACCATG-3’

  下游:5’-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3’使用NCBI查询人(H)基因号码:BNP(H)NM_002521;GAPDH,(H)NM_002046

  4、结果判定及统计分析

  通过ΔΔCT法以GAPDH为内参来计算cDNA的相对量,来分析mRNA的表达量。

  (七)统计分析

  采用XLSTAT 2014(Addinsoft,Paris,France)统计分析软件,通过Steel-Dwass-Critchlow-Fligner非参数检验方法比较多组之间的差异性,具体两组间比较使用Mann-Whitney U检验,组间比较p<0.05为差异有统计学意义。

  采用SPSS 21.0 for Mac软件Spearman相关性分析方法,进行相关性分析。

  实验结果

  心包液中NT-proBNP浓度

  参照临床上NT-proBNP的参考值,除对照组外其他各组心包液中NT-proBNP浓度均升高。与对照组相比较,ARVC组、IHD组及AMI组均有统计学意义,而DAR组没有统计学意义。(表5)

  表5,心包液中NT-proBNP浓度死因例数心包液中NT-proBNP浓度(pg/ml)极值中位数ARVC/D*8200-55862055AIHDAMI*14200-5526916IHD*21200-53502041DAR6200-3520573C8200-254200Total58200-5586710

  HE染色和免疫组织化学染色

  ARVC组案例的心肌HE染色可见右室游离壁心肌组织被纤维、脂肪替代,心肌萎缩,且没有冠状动脉病变;AMI组案例可见局部心肌损伤,包括心肌纤维嗜伊红染色增强,典型的缺血性凝固性坏死伴或不伴心肌间质出血,或炎性细胞浸润;IHD组案例可见弥漫性间质充血、水肿,片状心肌嗜伊红染色增强,部分伴有多发出血和收缩带样改变,但无心肌坏死。此外在各个组中还可见一些心肌水肿、间质出血、心肌波浪样改变及嗜伊红染色增强等非特异性改变。各组免疫组织化学染色均可见到BNP的阳性染色,而且心内膜侧心肌表达多于心外膜侧,然而各组间BNP的表达未见明显差异。(图1-5)

  图1,ARVC组HE及IHC染色结果(200倍),该切片死者为一名38岁男性,a和d:左心室;b和e:右心室;c和f:室间隔

  图2,AMI组HE及IHC染色结果(200倍),该切片死者为一名62岁男性,a和d:左心室;b和e:右心室;c和f:室间隔

  图3,IHD组HE及IHC染色结果(200倍),该切片死者为一名53岁男性,a和d:左心室;b和e:右心室;c和f:室间隔

  图4,DAR组HE及IHC染色结果(200倍),该切片死者为一名42岁男性,a和d:左心室;b和e:右心室;c和f:室间隔

  图5,对照组HE及IHC染色结果(200倍)该切片死者为一名48岁男性,死于高坠,a和d:左心室;b和e:右心室;c和f:室间隔

  Real-time PCR检测不同部位心肌组织中BNP mRNA的表达

  BNP和GAPDH的扩增循环数见表6。以GAPDH mRNA作为参照,对各组的BNP mRNA表达情况进行定量分析。ARVC组、IHD组及AMI组中左、右心室BNP mRNA的表达均高于对照组(p<0.05)。DAR组中左、右心室BNP mRNA表达与对照组比较没有差异,但在左心室的表达低于IHD组和AMI组。(图6-8)

  图6,BNP及GAPDH PCR溶解曲线

  图7,BNP及GAPDH PCR扩增曲线

  图8.各组不同部位心肌中BNP mRNA表达情况比较,*p<0.05(与对照组比较),△p<0.05(与DAR组比较)

  表6,BNP及GAPDH mRNA循环数

  样本循环数BNP(中位数)GAPDH(中位数)左心室前壁心肌18.3-38.2(26.9)17.1-29.0(21.9)左心室后壁心肌20.2-36.6(27.9)16.5-31.4(22.4)右心室心肌17.0-38.3(29.8)17.6-32.2(21.4)

  心包液中NT-proBNP及心肌中BNP mRNA与性别、年龄、心脏重量、双肺重量的相关性分析

  通过Spearman秩相关检验心包液中NT-proBNP及心肌中BNP mRNA与性别、年龄、心脏重量、双肺重量的相关性,在所有案例中,心包液中NT-proBNP浓度与性别、年龄、心脏重量、双肺重量没有相关性(p>0.05),但与左心室前壁心肌BNP mRNA、左心室后壁心肌BNP mRNA、右心室心肌BNP mRNA呈现轻度正相关,相关系数分别为:r=0.418(p=0.001)、r=0.410(p=0.020)、r=0.383(p=0.004)。心脏重量与左心室前壁心肌BNP mRNA、左心室后壁心肌BNP mRNA、右心室心肌BNP mRNA呈现轻度正相关,相关系数分别为:r=0.426(p=0.001)、r=0.458(p=0.000)、r=0.310(p=0.02)。ARVC组中各参数见均无相关性。

  讨论

  ARVC的诊断遵循2010年欧洲心脏病协会心肌病工作组(international task force criteria-TFC)提出的修订标准,其中包括心律失常的类型及程度、心电图、右心室大小或功能以及家族史等。然而在法医学鉴定时,ARVC死者往往缺乏临床病历材料及家族史,也有的案例在尸体解剖时缺乏典型的病理学改变。尽管许多学者已经证明ARVC是一种桥粒蛋白编码基因突变的遗传性疾病,但死后基因检测并不是法医病理学鉴定的常规方法。近年来,随着分子病理学技术的不断发展,尸体解剖和病理组织学检查已经不是死因鉴定的唯一方法,分子病理学中的许多技术手段也可应用于法医病理学鉴定。BNP最初是由日本学者Sudoh从猪脑组织中分离出的,在临床上被广泛用于心力衰竭的诊断。蛋白序列研究表明,脑钠肽前体(proBNP)会裂解成N端和C端两个片段,分别称作N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)以及脑钠肽(BNP),其中后者在心血管系统中发挥重要的生物学功能,但二者在定量方面是等效的。法医学中许多研究已经证明,BNP是一个可以用于反映死者生前心功能状态或心脏压力的非常好的生物化学指标。

  研究表明,冷冻保存的标本会影响BNP的检测结果,而在我们国家许多案例的尸体都被冷冻保存,这可能会影响BNP的检测。而NT-proBNP具有相对较长的半衰期和更好的生物学稳定性,且其在定量方面与BNP等效,因此更适用于法医学死后检测。另外,本实验为了避免尸体冷冻后溶血对检测的影响,我们检测心包液中NT-proBNP的浓度。

  本实验心肌组织免疫组织化学染色结果显示在左、右心室均可检测到BNP的阳性染色,但阳性染色在各死因组间没有明显差异。然而,通过免疫胶体金法检测心包液中NT-proBNP及Real-time PCR法检测不同部位心肌组织中BNP mRNA的表达,结果显示两者在各死因组间有统计学差异。具体如下:

  在ARVC组中,BNP mRNA在左、右心室的表达均高于对照组,而且ARVC组心包液中BNP浓度也高于对照组。ARVC早期主要表现为右心室的病变,随着病程进展逐渐会累积左心室,但室间隔受累比较少见,可能是由于室间隔不是一个心外膜下的结构。本实验分别检测了右心室、左心室前壁、左心室后壁心肌组织中BNP mRNA的表达情况,在病理组织学上我们仅在右心室可见心肌被纤维、脂肪组织替代,而左心室未见到这样的病变,但左、右心室心肌组织中BNP mRNA的表达均升高。这样的结果说明ARVC患者虽然左心室在结构形态上没有发生改变,但左心室压力及左心室功能已经受到影响。此外,NT-proBNP及BNP mRNA与性别、年龄、心脏重量及双肺重量之间没有相关性,这更说明BNP可以作为一个反映ARVC患者死前心功能状态的一个独立指标。

  在AIHD组中,双侧心室BNP mRNA的表达也高于对照组,说明急性缺血性心脏病患者会出现急性心功能衰竭。并且AIHD患者心包液中NT-proBNP浓度也升高,这说明急性缺血性心脏病时,心脏应对外界刺激会在很短时间内合成BNP并分泌到外周组织中。此外,本实验发现AMI组心包液中NT-proBNP浓度低于IHD组,朱宝利等研究发现,反映心肌坏死的生化学指标肌钙蛋白T(cTnT)与心肌组织中BNP的表达呈现负相关,因此AMI组心包液中BNP的相对低表达可能是由于坏死的心肌纤维无法合成和分泌BNP。药物过敏反映致死在法医病理学鉴定工作中也屡见不鲜,部分DAR死者在解剖及病理组织学检查时缺乏典型的形态学改变而难以与心源性猝死相鉴别。本实验结果显示,DAR患者左、右心室心肌组织中BNP mRNA表达与对照组比较没有差别,但在左心室表达较IHD组和AMI组低,而且心包液中NT-proBNP浓度也低于心源性猝死组,这说明DAR患者在死亡过程中没有心室压力的增加及心功能的衰竭。

  结论

  1、致心律失常型右室心肌病患者的心肌组织中BNP mRNA表达增加。

  2、致心律失常型右室心肌病患者的心包液中NT-proBNP浓度增加。

  3、致心律失常型右室心肌病患者的左、右心室心肌所受牵张力增大,左、右心室均出现功能衰竭。

  4、DAR患者在死亡过程中没有心室压力的增加及心功能的衰竭。

  5、BNP的IHC及分子病理学检测可对ARVC的诊断及死亡机制分析起到一定帮助作用。

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