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基础医学论文 中医临床基础

2018-11-29 15:40:02来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要

  目的:观察加减硝菔通结方对功能性便秘大鼠结肠黏膜菌群和内毒素水平的影 响,探讨加减硝菔通结方治疗便秘的效果与结肠黏膜菌群和内毒素水平之间的关 系,从而揭示通腑泄下法对黏膜肠道菌群和内毒素水平的影响。

  方法:选用SPF级Wistar雄性大鼠70只,随机将所有大鼠分为空白对照组10 只,桃花低剂量组10只,桃花中剂量组10只,桃花高剂量组10只,槟榔低剂量组10只,槟榔中剂量组10只,槟榔高剂量组10只,除空白组外,其余各组给予不同剂量的桃花或槟榔单味煎剂灌胃,观察桃花和槟榔的通腑泄下作用。

  关键词:加减硝菔通结方 结肠黏膜菌群 内毒素

  上篇理论研究

  一、现代医学对便秘的认识

  便秘在人群中的患病率高达17%[20],但来医院就诊的患者只有一小部分。便秘的影响人群范围广泛,老年多余青壮年,女性多于男性。由于便秘发病率高、病因繁杂,给患者带来很多困扰,严重时会影响工作、学习和生活。

  便秘常表现为:便意少甚至无便意,大便次数明显减少;排便困难;大便黏滞不爽;大便干结、质硬,排便有不净感;同时会伴有腹部疼痛或不适感[21]。症状严重患者还伴有失眠、烦躁、多梦、抑郁、焦虑等精神心理障碍。

  便秘虽然是一种较为普遍的症状,但应高度重视,一旦出现便秘症状或不适,应马上去医院就诊,作相关检查,并积极治疗。

  1.便秘的流行病学研究

  1.1 发病率

  高患病率的便秘必然伴随有高的发病率,但是由于非处方药物可以治疗一部分的便秘患者,患者在自己又便秘症状的初期就自己服用药物,所以难以去统计便秘这种疾病的患病率以及患者最早出现便秘症状的确切时间,往往我们看到的发病率数据会远远低于实际发病率。我们根据相关文献研究提供的数据,对便秘的发病情况可以得出这样的初步结论:便秘发病率较高的人群包括这几个方面:老年人、体弱多病者、怀孕中后期的孕妇、饮食结构不合理者、有肠道疾病的患者或某些有可以引起便秘的全身性疾病的患者、受到严重心里因素影响的人群等。

  在一项以老年人、残疾人士、活动不便者为基础人群调查中,发现其便秘的患病率是普通人群的7倍。有文献报道发达国家便秘的患病率高于发展中国家。这可能与社会环境、生活方式的不同有很大关系。我国人群中便秘的患病率为3.7%,其中高龄人群占大部分。

  1.2发病因素

  便秘从病因上可分为器质性和功能性两类。器质性便秘包括肠管器质性病变、直肠、肛门病变、内分泌或代谢性疾病、系统性疾病、肠管平滑肌或神经源性病变、神经系统疾病、结肠神经肌肉病变、药物性因素等引起的便秘。功能性便秘的发病因素尚不明确,其发生和多种因素有关,包括:饮食结构的改变、心理社会因素的影响、肠易激综合征、药物的不规范使用、腹肌及盆底肌张力不足等。

  2.便秘的发病机制

  便秘按发病机制主要分为三类:慢传输型、出口梗阻型、混合型。

  (1)慢传输型便秘(slow transit constipation, STC):也叫做结肠型便秘,是因为肠道收缩动力不足,使粪便从盲肠到直肠的移动缓慢,大便内的水分大量的被肠粘膜吸收,使大便干燥,难以排出或由于左半结肠的不协调运动而引起。如老年人体质较弱,肠平滑肌肌力差,形成结肠无力性便秘;年轻女性,多发生于青春期前后,特征表现是排便次数减少(每周排便少于1次),少或无便意,粪质干燥坚硬,排便困难;饮食结构不合理,纤维素过少,饮水量过少,缺少肠壁刺激形成便秘;妊娠、产后、多产、肥胖或突然消瘦使排便动力缺乏导致便秘;无相关证据证明为出口梗阻型。糖尿病、硬皮病并发的便秘及由于药物原因导致的便秘多是STC。

  (2)出口梗阻型便秘(outlet obstructive constipation, OOC):也叫做直肠型便秘,是由于肛门直肠周围的组织器官生理性改变或肌肉不协调导致粪便排出困难。OCC可有以下临床表现:无便意、排便费力、排便量少、排便不尽感或有下坠感;肛门直肠指检时发现大量粪便残留,用力排便时肛门外括约肌可呈矛盾性收缩或直肠壁的感觉阈值异常;子宫后倾位、盆地疝可引起直肠功能性便秘。很多OOC患者也合并存在STC。

  (3)混合型便秘:混合型便秘是指同时存在STC和OOC的临床表现。由于STC和OOC常互为因果,所以在临床上多见混合型便秘患者。即使如此,经过仔细询问患者病史和完善相关检査,可以了解在某一位患者身上,究竟是哪种类型更占主导地位。

  3.便秘的诊断

  功能性便秘的诊断一般包括询问病史、体格检查、实验室相关检查、影像学检查及其它特殊检查,原则上先排除器质性病变,再考虑功能性原因。

  (1) 病史 包括便秘的主要症状及持续时间、伴随疾病以及用药情况,特别要注意报警症状,精神状态、心理及社会因素等。通过病史采集,首先初步排除严重的器质性疾病导致便秘的可能。

  (2) 实验室检查 粪常规及粪隐血试验,必要时行生化及代谢方面检查。

  (3) 辅助检查 直肠镜或乙状结肠镜/结肠镜检查或X线钡剂灌肠造影检查。

  (4) 肛门直肠指检

  (5) 特殊检查 结肠功能传输试验,粪便造影,结肠、肛管、直肠测压,盆底肌电图检查,气囊排出试验,肛门超声内镜检查,肛门括约肌电图,动态磁共振排粪造影检查等。

  4.便秘的治疗

  一般治疗

  便秘患者需根据便秘程度、病因和类型,采用综合治疗方法,包括一般治疗、药物治疗、生物反馈治疗和手术治疗,使患者恢复正常生理排便。重视生活治疗,提高对患者对便秘的认识,教育其采取合理的饮食习惯和饮食结构,如以粗粮为主食,增加富有膳食纤维的水果蔬菜,增加饮水量,以加强对结肠的刺激,促进肠内有益细菌的增值,养成良好的排便习惯,避免排便用力,同时应适当增加活动,加强锻炼。治疗时应及时清除远端直肠内积粪;心态良好,这些对治疗效果有着积极而重要作用。

  药物治疗

  (1)容积性泻剂主要包括可溶性纤维素(果胶、车前草、燕麦麸等),不可溶性纤维(植物纤维、木质素等)。使用时一定要严格按使用剂量服用,否则会引起腹胀、腹痛,同时此类药物不适合作为暂时性便秘的迅速通便治疗。

  (2)润滑性泻剂如开塞露、石蜡油、矿物油。可软化大便,是粪便容易排出。

  (3)渗透性泻剂常用药物如乳果糖、山梨醇、聚乙二醇4000等。这些药物可以在肠腔内形成高渗浓度,刺激大便排出。

  (4)盐类泻剂如硫酸镁、镁乳,这类易产生药副作用,临床应谨慎使用。

  (5)刺激性泻剂包括含蒽醌类的植物性泻药、酚酞、蓖麻油、双酯酚汀等,作用最强。长期应用可损害肠平滑肌和肠肌间神经丛,停药后便秘症状加重。

  (6)促动力剂普卢卡比利、莫沙必利、伊托必利等。

  器械辅助

  清洁灌肠、结肠水疗。

  其他治疗

  包括生物反馈疗法、认知疗法、手术治疗。便秘作为一种人群高发病,真正需要手术治疗的是极少数便秘患者。对严重顽固性便秘经保守治疗均无效的患者,若为结肠传STC,病情严重影响生活者可考虑手术治疗。

  中医学对便秘的认识

  1.病因病机探讨

  便秘发病的病因有饮食不节、情志失调、外邪犯胃、禀赋不足等。基本病机是大肠传导失常,同时与肺、脾、肝、胃、肾等脏腑的功能失调相关。路志正认为便秘病位虽然在肠道,但根在脾胃,脾胃功能失常,影响肠道的运输,糟粕内停,形成便秘。周学文认为治疗应注重调理五脏,以脾胃为中心进行治疗,将调畅气机贯穿始终。

  1.1邪实壅滞

  饮食不节,过食辛热肥甘厚味,导致胃肠积热,热邪内蕴,蒸迫津液,大便干结;或恣食生冷,致阴寒内停,阻滞胃肠,胃肠运化失常,导致便秘。感受外邪可使阴寒内盛,阻滞胃肠,失于传导,糟粕不行而成冷秘。若热病之后,肠胃热盛,耗伤津液,大肠失润,也可导致大便干燥,排出困难。情志失调,忧愁思虑,使气机郁结,不能畅达,导致通降失常,传导失职,糟粕内停,不得下行,而致大便秘结。便秘会使人情致失调,烦躁易怒,失眠不寐、焦躁不安,负面情绪也会加重便秘的症状。

  1.2气血阴阳亏虚

  素体虚弱、病后、产后及年老体虚之人,气血双亏,气虚则大肠传导无力,血虚津枯则肠道失润;甚则阴阳俱虚,阳虚则肠道失于温煦,阴寒内结,寒则气滞不行,导致大便难以运行,大便艰涩;阴亏则肠道失养,导致大便干结,排便困难。

  2.治疗探讨

  通腑泻下法是便秘的主要治疗原则,但应注意不可一味单纯运用泻下药,应根据患者的症状表现及病因辨证论治,采取相应的治法,配伍相应的药物。如《景岳全书·秘结》曰:“阳结者邪有余,宜攻宜泻者也;阴结者正不足,宜补宜滋者也。知斯二者即知秘结之纲领矣。

  2.1通导泻热温散

  气滞便秘主要表现为大便干结,或不甚干结,欲便不得出,或便而不爽,肠鸣矢气,腹中胀痛,以及明显的气滞症状。治疗以顺气导滞为大法。孙彬栩等运用理气降逆颗粒来治疗阿片类药物引起的气滞腑实型便秘,对46例临床患者的临床疗效进行统计分析,说明理气降逆颗粒剂可有效缓解癌痛患者应用阿片类药物引起的气滞腑实型便秘,并能显著改善患者的临床症状,提高其生活质量。

  2.2益气温阳滋阴养血

  气虚便秘主要表现为大便并不干硬,虽有便意,但排便无力,同时伴有气虚见证。治疗以益气润肠为主。白邈对2011年6月2012年1月东直门医院门诊40名门诊气虚便秘患者进行了临床观察,中医的益气通腑法在治疗气虚型慢传输便秘方面疗效确切、症状改善明显、复发率低、无后遗症等特点,总有效率95%,值得总结和临床推广。

  血虚便秘主要表现为大便干结,同时伴有血虚见证。治疗以养血润肠为主。胡敏临床观察了20例八珍润肠丸加减配合针灸治疗血虚便秘的患者,治愈19例,好转1例,无效1例,总有效率为95%。八珍润肠丸加减配合针灸治疗产后血虚型便秘有较好的疗效。

  三、研究的理论依据

  1.内毒素与便秘

  内毒素(endotoxin)是革兰阴性(G-)细菌的细胞外壁溶解后释放出的脂多糖(LPS)。在便秘的发展进程中,肠道菌群失调导致的肠源性内毒素血症是其中的一个关键环节。目前的研究热点如何有效控制肠源性内毒素血症,这也是医学界普遍关注的问题。便秘患者的肠道微生态会有一些特定的改变,部分革兰阴性细菌大量增殖,而这些大量的革兰阴性细菌会溶解并释放出内毒素,发生肠源性内毒素血症。在正常情况下肠道中的内毒素只有少量会被肠道吸收,经门静脉进入肝脏后迅速被枯否细胞清除,但是便秘肠道吸收内毒素的作用就会相对减弱,再加上肠道菌群失调、肠黏膜屏障损伤不能积极有效地清除肠源性内毒素进入门静脉,内毒素水平升高,形成肠源性内毒素血症,加重便秘的发生。

  2.肠道菌群与便秘

  有研究发现有超过800种的微生物群种寄宿在肠道内,肠道菌群作为一个复杂的微生态环境而存在于人体内,且肠道菌群参与体糖、脂、蛋等的合成与代谢,保持肠道微生态的平衡,分解营养物质,提供能量,提高人体免疫力。在这些庞大数量的菌群中,部分菌群是隐藏的病原体,在某些因素作用下菌群结构、数量等发生变化,从而诱发机体的疾病。2013年,在“Science”杂志发表的十大科学进展,其中就包括了肠道菌群与人体健康关系的研究。肠道菌群已经成为近年来关注的焦点,其与人体代谢疾病、免疫类疾病、胃肠道类疾病甚至精神类疾病与肠道菌群关系密切,对人体健康有着至关重要的影响。人体肠道是一个充满活力的微生物生态系统,它的结构和功能是现在医学和生命科学研究的主要内容。新一代基因测序技术的发展以及强大的生物学信息分析工具的开发,为研究人体肠道菌群的组成和结构提供了新的方向和思路。

  3.基于硝菔通结方的加减变化

  在前期的研究中,我们通过前期大量临床观察发现清代名医张锡纯所创名方硝菔通结汤在治疗便秘方面的显著效果。在此基础上我们加入肉苁蓉、当归、白术,组成了硝菔通结方,并对该方的作用机制进行了大量实验研究,肯定了其温肾益精养血,软坚润下通便的功效。由于芒硝的贮藏要求严格,为防止风化,需要密闭保存,所以对本方制成成药后的保存带来了不便。为了能够将本方更普遍的应用于临床,使更多便秘患者得到安全有效的治疗,决定在原方基础上减少芒硝的用量,同时增加具有泻下作用的桃花和(或)槟榔。桃花性平,味微苦,无毒,具有消食顺气,润肠通便,祛风镇静,活血化瘀等功效。药理学研究表明,桃花中含有山萘酚、香豆精、三叶豆苷、各种维生素及微量元素等促进大便通畅,减少毒素吸收等。槟榔,苦、辛、温,归胃、大肠经。具有杀虫消积,行气,利水,截疟的功效。本品辛散苦泄,入胃肠经,善行胃肠之气,消积导滞,兼能缓泻通便。槟榔中的主要有效成分槟榔碱,具有增加肠蠕动的药理作用。

  4.本研究的设计思路(见图1)

  下篇 实验研究

  实验一 桃花、槟榔单味药物的实验

  1.实验动物

  SPF级雄性SD大鼠70只,体重19515g,购自西安交通大学医学部实验动物中心,合格证号:61001700000643,许可证考:SCXK(陕)2012-003。实验时饲养于陕西中医药大学科研实验中心动物房,室温18℃—26℃,相对湿度68%—80%,自然光照,适应性饲养一周。

  2.主要的药物与仪器

  = 1 \# "#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx" 1中药饮片(桃花、槟榔) 【生产批号】:20150701,【生产企业】: 陕西兴盛德药业有限责任公司

  = 2 \# "#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx" 2水合氯醛 上海山浦化工有限公司

  = 3 \# "#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx" 3无水乙醇 成都神龙化工有限公司

  = 4 \# "#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx" 4二甲苯 天津市富宇精细化工有限公司

  = 5 \# "#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx" 5甲醇 天津市富宇精细化工有限公司

  = 6 \# "#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx" 6生理盐水 山东鲁抗辰欣药业有限公司

  7动物饲养笼 苏州净化

  8大鼠代谢笼 苏杭实验动物设备

  9超低温冰箱 美国热电702型

  10称重电子天平 赛多利斯

  3.实验方法

  3.1动物分组

  适应性饲养一周后,随机将所有大鼠分为采用随机数字法将大鼠随机分为空白对照组10只、桃花低剂量组10只、桃花中剂量组10只,桃花高剂量组10只,槟榔低剂量组10只、槟榔中剂量组10只、槟榔高剂量组10只。

  3.2药物配制及给药方法

  空白对照组大鼠均给予生理盐水灌胃,灌胃标准根据大鼠体重1ml/100g/次,每日一次;桃花组给予单味桃花煎剂灌胃,槟榔组给予单味槟榔煎剂灌胃,标准根据大鼠体重1ml/100g/次,每日一次。桃花(6g)、槟榔(10g)剂量根据中药大辞典中的药物剂量换算成200g体重大鼠剂量。桃花低剂量组(0.125g)、桃花中剂量组(0.25g)、桃花高剂量组(0.5g)、槟榔低剂量组(0.21g)、槟榔中剂量组(0.42g)、槟榔高剂量组(0.84g)。灌胃2周后观察大鼠的一般情况及粪便性状,并对其进行评分。

  4.实验结果

  灌胃2周后,与空白对照组相比,桃花组、槟榔组大鼠均出现不同程度的精神状态较差,行动迟缓,体形偏瘦,体重减轻,皮毛色泽晦暗缺乏光泽度,粪便质软,甚至成糊状粪便,与垫料混在一起,难以分离,气味较臭(见图2、图3)。根据Bristol粪便性状分级与评分系统(见表1)可以得出:与空白对照组比较,桃花组和槟榔组随着药物剂量的加大,大鼠的粪便性状评分高愈来愈高,二者成正相关。由此可以证实桃花、槟榔具有泻下的作用。为后续的的加减硝菔通结方的实验研究提供一定的研究基础。

  图1 灌胃一周后桃花不同组的粪便性状

  图2 灌胃一周后桃花不同组的粪便性状

  表1 Bristol粪便性状分级及评分表

  表2 各组大鼠的粪便性状评分

  桃花可消食顺气,活血化瘀。槟榔是一种行气导滞的中药,可以促进胃肠运动。在上述实验中,我们可以明显看到,随着桃花、槟榔剂量的成倍增加,大鼠粪便的性状逐渐改变。在后期的相关实验中,我们将会把桃花和(或)槟榔与其他药物相互配伍,来研究配伍组方后的效果。考虑到方剂中,君、臣、佐、使之间的相互关系,药效上的相互作用,后续实验中药物的配伍与剂量将在此实验的基础上稍微调整,但主要的作用和方向是不会改变的。关于桃花、槟榔对于便秘治疗效果的相关研究还不是很多,在未来的实验研究中,我们可以加强相关方面的实验及临床研究,为便秘的治疗提供新的药物。

  实验二 便秘大鼠模型建立

  1.动物模型的建立

  1.1 实验动物

  120只SPF级SD雄性大鼠,体重19515g,购自于西安交通大学医学部实验动物中心,合格证号:61001700000643,许可证考:SCXK(陕)2012-003。实验时饲养于陕西中医药大学科研实验中心动物房,室温19℃—27℃,相对湿度70%—80%,光照自然,适应性饲养一周。

  1.2主要的药物与试剂

   = 1 \* GB3 \* MERGEFORMAT ①复方地芬诺酯片,【批准文号】:国药准字H32022716,【生产企业】:常州康普药业有限公司。

   = 2 \* GB3 \* MERGEFORMAT ②水合氯醛 上海山浦化工有限公司

   = 3 \* GB3 \* MERGEFORMAT ③RNA保护液 北京全式金生物技术有限公司

   = 4 \* GB3 \* MERGEFORMAT ④无水乙醇 成都神龙化工有限公司

   = 5 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑤二甲苯 天津市富宇精细化工有限公司

   = 6 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑥甲醇 天津市富宇精细化工有限公司

   = 7 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑦生理盐水 山东鲁抗辰欣药业有限公司

   = 8 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑧防脱载玻片 南京海伦生物医学器材制造有限公司

   = 9 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑨盖玻片 南京海伦生物医学器材制造有限公司

   = 10 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑩中性树胶 天津市富宇精细化工有限公司

  1.3主要实验仪器与设备

   = 1 \* GB3 \* MERGEFORMAT ①动物饲养笼 苏州净化

   = 2 \* GB3 \* MERGEFORMAT ②大鼠代谢 笼苏杭实验动物设备

   = 3 \* GB3 \* MERGEFORMAT ③超低温冰箱 美国热电702型

   = 4 \* GB3 \* MERGEFORMAT ④称重电子天平 赛多利斯

   = 5 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑤生物组织自动脱水机 TC-120S+

   = 6 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑥石蜡切片机 德国徕卡RM2235

   = 7 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑦自动恒温烘片仪 TK-213

   = 8 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑧生物组织摊平烤片机 TK-218Ⅱ

   = 9 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑨研究级正置数码显微镜 Zeiss xioImager A1

  1.4实验方法

  1.4.1动物分组

  适应性饲养一周后,随机将所有大鼠分为采用随机数字法将大鼠随机分为以下各组(见表3)。

  表3 动物分组

  1.4.2造模方法

  将复方地芬诺酯片(每片含盐酸低酚诺酯2.5mg,硫酸阿托品0.025mg)先用钢磨打成细粉状,在用蒸馏水配制成浓度为1.5mg/ml的复方地芬诺酯混悬液。根据前期实验动物模型的建立方法,除空白对照组外各组大鼠每日灌服复方地芬诺酯混悬液,灌服浓度为15mg/kg,空白组给予等量生理盐水灌胃,7天为一疗程,每个疗程间暂停1天,8个疗程后,FC模型复制成功。2ml/只/次灌胃,1次/日,总共灌胃56次。造模期间,所有动物均饲予全价颗粒饲料,饮用自来水。

  1.4.3观察指标及方法

  每日9时,对大鼠的饮食、精神状态、皮毛色泽、体重及大小便情况等,进行观察记录。造模过程中,除空白组外其余各组大鼠逐渐出现精神差,喜扎堆,体倦怠,纳少,大便粒型小、干硬。个别动物出现尿道口白色米粒样分泌物,小便点滴而出,尿道外口周围皮毛濡湿,初步推断为尿道不畅。至造模结束,随机解剖空白组大鼠2只,模型组大鼠2只,肉眼观察两组组大鼠结肠组织表面光滑,与周围组织无粘连,易分离。但模型组大鼠腹腔内体液减少,粪块聚集在结肠,呈球形或串珠状,空肠、回肠无明显粪便残留。进一步解剖见模型组结肠黏膜明显充血水肿。

  其余各组与空白组对比均有精神状态差,活动减少,喜扎堆,体重减轻,进食减少,被毛脱落,大便干硬,粒型小,符合便秘表现。

  1.5实验结果

  1.5.1 实验动物一般情况

  正常组大鼠精神状态良好,皮毛色泽光亮,体格健壮,饮食正常,大小便正常,喜活动。体重增长正常,无死亡例数。

  与对照组比较,灌胃组大鼠出现精神状态差,倦怠多卧,活动减少,易聚集成堆的现象,被毛光泽度下降,色泽泛黄易脱落,体重增加缓慢,甚至减轻,且纳差食少,腹部不同程度胀大,大便干且少,粪便颗粒细小,小便色黄量少等表现,个别灌胃组大鼠尿道口出现白色浑浊分泌物,肛门不同程度红肿。实验过程中无大鼠死亡。

  1.5.2结肠黏膜的肉眼观察

  解剖大鼠过程中,肉眼观察模型组大鼠结肠组织表面光滑,与周围组织无粘连,易分离。腹腔内体液减少,粪块聚集在结肠,呈球形或串珠状,空肠、回肠无明显粪便残留。

  2.讨论

  文献研究报道,便秘模型的建立方法有以下几种:单纯禁食、单纯禁水、限水法、饮牛奶、复方地芬诺酯灌胃等方法。而复方地芬诺酯便秘模型是一种可重复性强,经济简单的便秘模型,既可以一次性大剂量给药,也可以小剂量多次给药。最重要的是这种方法建立的模型与真实的便秘患者的肠道病理改变有很高的相似度。主要是直接作用于肠平滑肌,抑制肠黏膜感受器,减少黏膜局部的蠕动,同时是肠内容物通过延迟,增强肠内水分的吸收,从而形成便秘。因为造模过程中并不能完全去除饮水和进食对大鼠便秘的影响,所以应全面考虑可能对模型有影响的所有因素。在以后的FC模型的建立中,我们研究的主要问题将是如何让便秘模型和临床更加符合。

  实验三 加减硝菔通结方对便秘大鼠内毒素和肠道黏膜菌群影响的研究

  1、实验材料

  1.1实验动物

  同实验二。

  1.2实验主要试剂

   = 1 \* GB3 \* MERGEFORMAT ①中药饮片,【生产批号】:20150701,【生产企业】:陕西兴盛德药业有限责任公司

   = 2 \* GB3 \* MERGEFORMAT ②组织基因组DNA快速提取试剂盒 北京艾德莱生物科技有限公司

   = 3 \* GB3 \* MERGEFORMAT ③大鼠血清内毒素elisa检测试剂盒 Elisa Biotech

   = 4 \* GB3 \* MERGEFORMAT ④RNA保护液 北京全式金生物技术有限公司

   = 5 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑤40%聚丙烯酰胺 北京全式金生物技术有限公司

   = 6 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑥ Platinum Taq DNA Polymerase invitrogen公司

   = 7 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑦N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis) 北京全式金生物技术有限公司

   = 8 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑧电泳缓冲液 北京全式金生物技术有限公司

   = 9 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑨EB溶液 北京全式金生物技术有限公司

  1.3实验主要仪器及材料

   = 1 \* GB3 \* MERGEFORMAT ①动物饲养笼 苏州净化

   = 2 \* GB3 \* MERGEFORMAT ②大鼠代谢笼 苏杭实验动物设备

   = 3 \* GB3 \* MERGEFORMAT ③超低温冰箱 美国热电702型

   = 4 \* GB3 \* MERGEFORMAT ④称重电子天平 赛多利斯

   = 5 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑤DGGE变形凝胶电泳系统 美国BIO-RAD

   = 6 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑥DNA扩增仪 美国BIO-RAD

   = 7 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑦自动凝胶成像分析系统 美国BIO-RAD

   = 8 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑧PCR仪 美国BIO-RAD

   = 9 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑨电泳仪 北京六一仪器厂

  2.实验方法

  2.1动物分组

  同实验一(见表1),模型组大鼠列为模型2组。

  2.2药物配制及给药方法

  2.2.1加减硝菔通结方的药物剂量及煎煮方法

  加减硝菔通结方以前期实验研究的硝菔通结方为基础,进行药物计量及药味的加减变化,主要对芒硝的计量进行加减,同时加入不同剂量的桃花和(或)槟榔。具体处方如下:(60kg成人一日使用量)

  硝菔通结方:肉苁蓉15g 当归15g 生白术15个芒硝30g 莱菔1000g

  A1B1组:硝菔通结方减芒硝剂量,加桃花21g,六味药,总剂量1086g。

  A1B2组:硝菔通结方减芒硝剂量,桃花42g,六味药,总剂量1107g。

  A1B3组:硝菔通结方减芒硝剂量,槟榔29g,六味药,总剂量1094g。

  A1B4组:硝菔通结方减芒硝剂量,槟榔58g 六味物,总剂量1123g。

  A1B5组:硝菔通结方减芒硝剂量,桃花10.5g 槟榔14.5g 七味药,总剂量1090g。

  A2B1组:硝菔通结方减芒硝剂量,桃花21g 六味药,总剂量1076g。

  A2B2组:硝菔通结方减芒硝剂量,桃花42g 六味药,总剂量1097g。

  A2B3组:硝菔通结方减芒硝剂量,槟榔29g 六味药,总剂量1084g。

  A2B4组:硝菔通结方减芒硝剂量,槟榔58g 六味药,总剂量1113g。

  A2B6组:硝菔通结方减芒硝剂量,桃花21g 槟榔29g 七味药,总剂量1105g。

  按照《医学实验动物学》[45]换算成大鼠一日用量为每100g体重灌药量。计算公式如下:

  (成人每天每克体重用药量÷60×103克)×100×6.25=大鼠每100克体重用药量

  根据200g体重用药量分别计算出每组中各药物的相应计量

  根据每组大鼠数量以及预计灌胃天数计算出每组中各药物的总的计量

  煎煮方法:新鲜莱菔切片水煮,至莱菔熟烂捞出,取莱菔浓汁,纳芒硝,并加入其他药物浸泡半小时后同煎,得药汁。根据200克大鼠胃容积2ml,将每组中药进行煎熬浓缩至需要的量,灭菌后储存于4℃冰箱中备用。

  2.2.2给药方法

  造模8周后,给予加减硝菔通结方中药灌胃,灌胃标准根据大鼠体重1ml/100g/次,1次/日;正常组和模型组大鼠均给予生理盐水灌胃,灌胃标准根据大鼠体重1ml/100g/次,1次/日;各组大鼠均灌胃28天后处死。

  2.3给药后大鼠一般情况的观察

  正常组小鼠体型肥胖、精神良好、行动活跃、饮食正常、皮毛有光泽。模型组小鼠体型偏瘦,见皮毛发黄且无光泽、体倦怠、活动减少、扎堆,纳少,粪便质地坚硬、干燥、颗粒小。经过加减硝菔通结方治疗的各组小鼠上述改变有所减轻。

  2.4标本采集

  血清标本的采集

  灌胃第28天末次给药后,实验动物禁食不禁水12 h,次日给予10%水合氯醛0.5ml/100g腹腔注射麻醉。麻醉后,迅速剖开大鼠腹腔,用一次性真空负压管(已编码)从腹主动脉采血3—5ml,静置半小时至1小时后,3000转/分离心10 min,分离上清液,根据各检测指标分装后放置于-80℃冰箱保存备用检测。

  结肠组织的采集

  采血后,充分暴露结肠,从肛门上约3cm处向上剪取约5cm结肠组织,挤出粪便,立即用生理盐水清洗血液及残留粪便。分离出结肠黏膜组织,并迅速放入弃掉RNA-hold的1.5ml无RNA酶的EP管,放入液氮迅速冷冻,随后转入-80℃冰箱保存待检测。

  2.5观察指标和方法

  2.5.1大鼠一般情况观察

  正常组大鼠精神状态良好,体格健壮,皮毛色泽光亮,饮食正常,大小便正常,喜活动。体重增长正常,无死亡例数。

  与对照组比较,模型组大鼠出现精神状态差,倦怠多卧,活动减少,易聚集成堆的现象,被毛光泽度下降,色泽泛黄易脱落,体重减轻,且纳少,腹部不同程度胀大,大便干且颗粒细小。

  与模型组比较,各治疗组大鼠一般情况良好,体重增加,大便软且颗粒变大。

  治疗过程中,无死亡例数。

  2.5.2加减硝菔通结方对粪便性状及含水量的影响

  治疗期间,对粪便的性状进行观察(性状评分标准见表1),并每隔一周收集大鼠粪便,收集粪便前一天给每组大鼠换垫料,以保证第二天收集的粪便为24小时内的粪便颗粒,10粒/只,60粒/组,观察大便颗粒的大小,形状及粪便的质地,并进行称重,得到粪便湿重。然后将所收集的粪便进行烘干,重复两次称取粪便重量,直至重量不再变化,即得到粪便的干重。粪便湿重与粪便干重之差除以粪便湿重即为粪便含水量。粪便变软或不成形,粪便含水量增加,即为加减硝菔通结方对FC的有效果。

  2.5.3采用ELISA法检测内毒素的含量

  2.5.3.1实验方法

  向预先包被了内毒素单克隆抗体的酶标孔中加入不同浓度的标准品以及样品,再依次加入等量的辣根过氧化物酶,经过温浴、洗涤,除去未结合的酶,然后再加入底物A、B,产生蓝色;加入终止液终止反应,最后转化成黄色。颜色的深浅与样品中内毒素水平呈正相关。

  2.5.2.2实验步骤

   = 1 \* GB3 \* MERGEFORMAT ①标准品的稀释(标准品记为A,样品记为B)(见表4)

  表4 标准品的稀释

  管号 具体操作

  5号A 120微升的原倍A加入120微升的A稀释液

  4号A 120微升的5号A加入120微升的A稀释液

  3号A 120微升的4号A加入120微升的A稀释液

  2号A 120微升的3号A加入120微升的A稀释液

  1号A 120微升的2号A加入120微升的A稀释液

   = 2 \* GB3 \* MERGEFORMAT ②加样:空白孔:空白对照孔从加显色剂开始,剩余相同;A孔:各孔加入不同浓度的A(20+30)微升;B孔:加入样本(20+30)ul。A空和B孔再加入辣根过氧化物酶(HRP)(40+60)微升,用封板膜封住反应孔,轻轻震荡混匀,置于37℃水浴锅中育化1 hour。

   = 3 \* GB3 \* MERGEFORMAT ③配液:用蒸馏水将浓缩洗涤液稀释20倍后备用。

   = 4 \* GB3 \* MERGEFORMAT ④洗涤:温育好后,将96孔板从水浴锅中小心取出,揭开,甩掉液体,反置于吸水纸上打净,每孔加满洗涤液,计时1min,甩去洗涤液,再打净,反复洗板5次。

   = 5 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑤显色:每孔依次加入显色剂A(20+30)微升,显色剂B(20+30)微升,轻轻震荡混匀,置于37℃水浴锅中避光孵育(11+4)min。

   = 6 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑥终止:每孔滴(20+30)微升终止液,终结反应体系。不超过(11+4) min,检出吸光度。

   = 7 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑦检测:以空白孔归0,测量各孔的吸光度(OD值)于450nm度量处。

  2.5.4 DGGE分析大鼠结肠黏膜组织菌群的变化

  2.5.4.1实验方法

  先用组织DNA提取试剂盒从结肠黏膜组织中提取结肠黏膜的DNA,选择细菌16S rRNA基因V3区通用引物,扩增肠道菌群的总DNA,再进行DGGE,并采用凝胶成像系统拍照和分析图像。

  2.5.4.2实验步骤

  一、结肠黏膜组织DNA的提取

   = 1 \* GB3 \* MERGEFORMAT ①匀浆:从-80℃冰箱取出结肠黏膜组织,每个样本分别称取50mg组织,置于5mlEP管中,加入180ul组织裂解液,进行匀浆。再加入20ul蛋白酶K,涡旋震荡充分混匀。将裂解物置于在55℃水浴中3小时直到组织消化完全,如果没有完全消化,可适当延长水浴时间,水浴期间轻柔地震荡几次帮助裂解。

   = 2 \* GB3 \* MERGEFORMAT ②离心取上清:加入200ul结合液CB和100ul的异丙醇,涡旋震荡充分混匀。13000转/分离心5分钟,将上清加入一个吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中),13000转/分离心60秒,倒掉收集管中废液。

   = 3 \* GB3 \* MERGEFORMAT ③清洗:加入500ul抑制物去除液IR,12000转/分离心30秒,弃废液。加入600ul漂洗液WB(事先已加入无水乙醇),12000转/分离心30秒,弃掉废液。重复上述步骤一次。将吸附柱AC放回空收集管中,13000转/分离心2分钟,甩去漂洗液。

   = 4 \* GB3 \* MERGEFORMAT ④取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间加入100ul洗脱缓冲液EB(事先在65℃水浴中预热),室温放置5min,12000转/分离心1分钟。将得到的溶液再加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12000转/分离心1分钟。

   = 5 \* GB3 \* MERGEFORMAT ⑤弃掉吸附柱,离心管中为提取的DNA。放置在-20℃中待用。

  二、V3区扩增

  反应体系(见表5),按照试剂说明书

  表5 反应体系

  反应条件:

  95℃,5min

  95℃,30s

  55℃,30s 40个循环

  72℃,40s

  72℃,10min

  4℃,forever

  琼脂糖凝胶电泳:2%琼脂糖胶 150V电泳 30min,EB染色20min,凝胶成像仪看结果。

  引物设计:选择细菌16S rRNA基因V3区通用引物,扩增肠道菌群的总DNA,序列为V3-R:5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’,V3-F 5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’;为了使得产物在DGGE电泳中获得更好的分离效果,在上游引物(V3-341F)的5’端添加一个GC夹,序列如下:CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGG[46]

  三、变性梯度凝胶电泳(DGGE)

  (1)40%聚丙烯酰胺(37.5:1)

  丙烯酰胺 389.3g

  N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis) 10.71g

  ddH2O 定容至1L,磁力搅拌溶化

  0.45μm过滤膜避光保存

  表 6 变性聚丙烯凝胶30%~65%的配制方法

  使用前需要加入10%过硫酸铵120 μl和TEMED 60 μl。

  (2)变性梯度凝胶电泳的条件:电泳缓冲液:1×TAE ,在150V电压下,预电泳30 分钟,然后取PCR扩增产物各10 μl,加2 μl loading buffer混匀,小心加入到上样孔中,连接电源,60V电压电泳1 h,再以90电压电泳12 h,过夜,设定温度为60°C。

  (3)电泳结束后,小心转移凝胶至装有有EB溶液(0.5μg/ml)的容器中,染色20min,注意防止凝胶破裂,动作应轻柔。采用凝胶成像系统拍照并分析图像。

  2.6统计学处理

  DGGE数据处理用Quantity One software(version 4.6)打开并分析图片。每个样品中每个DGGE条带相对强度组成一个二维矩阵(泳道),应用Dice coefficient计算样品的相似度。使用非加权配对算术平均法(UPGMA) 进行聚类分析构建聚类簇。用Canoco(version 4.5) 软件进行主成分分析(PCA)。菌群多样性以香农多样性指数( Shannon's diversity indexF) 和物种丰富度 (species richness) 表示。

  实验数据统一采用SPSS软件进行分析。

  3.实验结果

  3.1大鼠一般情况

  正常组大鼠体重增长正常,毛色光亮顺滑,饮食、大小便正常,喜动,无死亡。模型2组大鼠出现精神状态差,倦怠多卧,活动减少,易聚集成堆的现象,被毛光泽度下降,色泽泛黄易脱落,体重增加缓慢,甚至减轻,且纳差食少,腹部不同程度胀大,大便干且少小便色黄量少等表现,个边灌胃组大鼠尿道口出现白色浑浊分泌物,肛门不同程度红肿。

  3.2 粪便性状评分及含水量

  从表7可以看出:模型组的粪便性状评分明显低于对照组(P<0.05),说明模型建立成功。与模型组比较,加减硝菔通结方组的粪便性状评分均有不同程度的增加(P<0.05),说明加减硝菔通结方可以软化粪便。从表8中可以看出:模型组的粪便水份含量明显低于对照组(P<0.05),说明模型建立成功。与模型组比较,加减硝菔通结方组的粪便水分含量均有不同程度的增加(P<0.05),说明加减硝菔通结方可以增加粪便含水量。综上所述,加减硝菔通结方对FC是有治疗效果的。

  表7 各组大鼠的粪便性状评分

  表8 各组大鼠粪便重量级含水量()

  3.3内毒素指标(见表9,图4)

  与空白组比,模型2组内毒素水平明显升高(P<0.01),据有统计学意义,说明造模成功;与模型2组比较,经过加减硝菔通结方治疗4周后,加减硝菔通结方各组的血清内毒素水平均有不同程度的降低(P<0.05,P<0.01,P<0.001),其中A1B5组(去芒硝,加1倍桃花、1倍槟榔)和A2B2组(去芒硝,加2倍桃花)的内毒素水平下降最显著,这可能与芒硝、桃花、槟榔的剂量有一定关系,也不能排除其他因素,由于本实验动物例数较少,对各治疗组的实验结果不能完全肯定,期待后期改进不足之处,明确药物剂量与疗效的关系。

  表9 大鼠内毒素水平(单位:ng/ul)

  图4 内毒素浓度比较

  3.4结肠黏膜菌群结果

  相似性分析在DGGE图中,每个纵向泳道代表一个样品的菌群结构,每个泳道里的一个条带代表一种细菌,条带的强度代表该细菌的相对丰度(实验结果见图3、图4、图5)。将DGGE图片进行数字化处理后,计算菌群结构的相似性,并构建聚类树进行相似性分析。所有的条带分为两大组,第一组包括各空白组;第二组包括所有模型组,第三组到第十二组为各治疗组;其中标尺代表相似程度,线段长度代表相邻的样品的相似性(由此可以看出,各治疗组大鼠结肠黏膜菌群和模型2组大鼠是有有差别的,见图6)。

  图3 DGGE图谱(空白组、模型组、A1B1组、A1B2组)

  图4 DGGE图谱(A1B3组、A1B4组、A1B5组、A2B1组)

  图5 DGGE图谱(A2B2组、A2B3组、A2B4组、A2B6组)

  图6菌群相似性分析结果

  多样性分析与空白组比较,模型2组的香农多样性指数明显降低(P<0.01);各治疗组的香农多样性指数明显高于而模型2组(P<0.01,P<0.05,P<0.001),(见图7)。各治疗组大鼠结肠黏膜菌群多样性明显大于模型2组(P<0.01),这个结果和物种丰富度的变化规律是一致的。与空白组比较,模型2组大鼠结肠黏膜菌群的物种丰富度显著降低(P<0.01),与2组比较,各治疗组的结肠黏膜菌群的物种丰富度升高显著(P<0.01,P<0.05,P<0.001)(见图8)。经过治疗后便秘大鼠结肠黏膜菌群多样性增多。

  图7 注:模型2与空白组相比,###P<0.01 ;各治疗组与模型2组比较*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001。(与空白组比,P<0.01,据有统计学意义,进一步说明造模成功;与模型2组比,据有统计学意,说明各给药组均有效果。)

  图8 注:模型2与空白组相比,###P<0.01 ;各治疗组与模型2组比较*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001。(与空白组比,P<0.01,据有统计学意义,进一步说明造模成功;与模型2组比,据有统计学意义,说明各给药组均有效果。)

  4讨论

  经过加减硝菔通结方治疗后,各治疗组大鼠的便秘症状和一般情况均有显著改善。

  4.1对大鼠血清内毒素水平的影响

  本实验中,FC模型组大鼠的内毒素水平较空白组明显升高,说明内毒素可能参与了便秘的形成。经过加减硝菔通结方治疗4周后,加减硝菔通结方各组的血清内毒素水平均有不同程度的降低,说明加减硝菔通结方对内毒素水平有一定程度影响的,该方可以降低内毒素水平,那么我们可以认为通腑泄下类的方药可以降低内毒素水平,在治疗因为内毒素水平高引起的疾病时,可以考虑运用通腑泄下类方药,这为以后我们治疗由各种原因引起的内毒素血症提供了一个新的方向。

  4.2对大鼠肠道菌群的影响

  DGGE是把尿素和甲酞胺两种变性物质制成一种浓度逐渐升高的变性梯度电泳胶,在这两种变性物质的作用下,在胶体上进行电泳的双股DNA序列会部分变性,形成部分单链。不同核酸序列的DNA样品,其部分变性解离的程度也不相同,因此在电泳胶中的移动速度也不同(双股快,单股慢),所以部分变性的DNA在相同时间内在胶体上跑出的距离长短不同。不同细菌的16SrDNA片段通过DGGE凝胶时,可以在变性物质浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶中部分发生变性,迁移速度明显减慢,从而加以分离。16SrDNA片段的分离产生了一个细菌群体的图谱,每一个DNA片段类型代表一个菌种。DGGE技术的优点是能够将胃肠道菌群含量较少的菌群检测出来。

  5结论

  根据造模过程中对大鼠一般情况和粪便的观察及造模结束后大鼠的症状表现,提示采用复方地芬诺酯混悬液灌胃能成功复制大鼠FC模型。

  加减硝菔通结方组大鼠的血清内毒素水平均显著降低,提示提示加减硝菔通结方可以改善便秘大鼠的血清内毒素水平,其治疗便秘的机制可能与此相关。

  6创新点

  (1)通过加减硝菔通结方对慢性功能性便秘的影响因素——“结肠粘膜菌群及血清中内毒素水平”的治疗作用,进一步揭示加减硝菔通结方治疗功能性便秘的机制,为加减硝菔通结方用于临床治疗慢性功能性变便秘提供实验依据。

  (2)所选的目标方剂硝菔通结方来源于名医名方,不仅标本兼治,疗效可靠,而且无蒽醌类中药成分,具有明显的临床优势。

  7问题与展望

  本实验中,采用复方低分诺酯混悬液灌胃造成的大鼠便秘模型仅仅是西医疾病的模型,而不具备中医“证”的特征,因此只能从一定层面上反应加减硝菔通结方对便秘的治疗作用。在今后临床应用的过程中,要充分考虑动物种属和中医证型的要素,把加减硝菔通结方运用到合适证型的病人,提高临床疗效。

  结 语

  功能性便秘是消化系统常见的功能性胃肠病。随着生活节奏加快,压力增大,饮食结构的改变,FC的发病率逐年上升,而且年轻化的趋势愈加明显。同时功能性便秘也是很多内科疾病发生的常见诱因。长期慢性便秘可以引起焦虑、抑郁、烦躁等不良情绪,甚至诱发心脑血管疾病。严重的功能性便秘影响患者的生活质量,早期预防和合理治疗FC可以减轻便秘带给患者的痛苦,提高生活质量,减少社会负担。因此探讨FC的药物治疗,研究治疗便秘的可能机制,在FC的发生和发展中提供新的认识,为便秘治疗提供新的方向。

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