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口腔科医学类论文 复方氯己定对口腔种植体周围炎病原菌生物膜的影响

2018-12-06 15:52:33来源:组稿人论文网作者:婷婷

  [摘要]目的 研究复方氯己定对种植体周围炎病原菌牙龈卟啉单胞菌生物膜的影响。方法 在钛片上建立菌斑生物膜,通过扫描电镜观测生长状况以及加入复方氯己定后的生长状况;采用结晶紫法研究复方氯己定对牙龈卟啉单胞菌菌斑生物膜的影响,阴性对照组加入BHI液体培养基180μl+浓度为1×107CFU/ml菌悬液20 μl;实验组为含实验药液20μl+ BHI液体培养基160μl+浓度为1×107CFU/ml菌悬液20 μl,专性厌氧培养48h后用结晶紫染色,酶标仪测OD值,SPSS13.0进行统计学分析 。结果 扫描电镜观察,加入复方氯己定的实验组未能形成良好的生物膜;结晶紫法测得复方氯己定对菌斑生物膜有抑制作用,具有统计学意义(P﹤0.05)。结论 作为口腔常见含漱液之一的复方氯己定对牙龈卟啉单胞菌菌菌斑生物膜的形成有一定程度的抑制作用。

  关键词 复方氯己定;牙龈卟啉单胞菌;生物膜

  种植体松动脱落的主要是由种植体周围炎引起的。复方氯己定溶液是目前口腔中最常用的含漱液,系广谱杀菌剂。在种植术前及术后作为常规用药。它的主要成分之一是葡萄糖氯己定,对多种口腔常见致病菌均有杀菌作用,临床上可以用于智齿冠周炎、牙龈炎、黏膜病等的辅助治疗;另一种主要成分是甲硝唑,有抗厌氧菌的作用。有专家认为,种植体周围炎与牙周病的病原菌微生物组成显著相似。牙周病的主要病原菌之一为牙龈卟啉单胞菌,系格兰氏阴性专性厌氧球杆菌,并且在种植体周围炎中有较高的检出率。因此我们认为,种植体周围炎的主要病原菌是牙龈卟啉单胞菌。

  1 材料和方法

  1.1 主要仪器和设备

  商业用纯钛材料TA2级 (陕西有色金属加工厂);复方氯己定含漱液 (深圳南粤药业);电子显微镜(Nikon);电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂);厌氧培养箱(Don whitley scientific);旋涡混合器(上海医科大学仪器厂);立体压力蒸汽灭菌器(上海博迅医疗设备厂);超低温冰箱(Thermo USA);低温离心机(Thermo USA);酶标仪(Thermo USA);0.22μm滤器(MILLIPORE);扫描电镜(Zeiss Germany)。

  1.2 实验菌株

  牙龈卟啉单胞菌ATCC33277 (中国医科大学口腔医学院提供)

  1.3 实验菌株的培养

  实验菌株选择牙龈卟啉单胞菌Porphyromonoas gingivals模式菌株ATCC33277,复苏接种在BHI培养基血琼脂平板上,专性厌氧气培养48小时。革兰氏染色后光学显微镜下观察菌落形态,证实无污染后传代备用。

  无菌接种环挑取经鉴定的纯培养单个细菌菌落置于5mlBHI液体培养基的试管中进行48小时增菌,麦式比浊法比浊,用BHI液体培养基稀释菌液调整浓度备用。

  1.4 方法

  1.4.1 钛片的制备

  商业用纯钛材料,TA2级,切割成规格为10mm×1mm钛片。表面逐级打磨、抛光至镜面。分析纯的无水乙醇及去离子水依次超声清洗30分钟后,干燥后环氧乙烷消毒备用。

  1.4.2 人非刺激性唾液的收集

  唾液来源于口腔健康状况良好、无口腔疾病、6个月未使用过抗生素及漱口液的志愿者。上午9:00-11:00定时收集其非刺激性唾液,4℃下4500 rpm离心30 min,取上清液,0.22μm滤器除菌, 4℃备用。

  1.4.3 光滑纯钛表面牙龈卟啉单胞菌生物膜的建立及加入复方氯己定后生物膜的形态学观察

  将消毒备用的钛片在37℃下唾液浸泡24小时,待表面形成获得性膜,PBS冲洗,转移至24孔板中,A组为对照组:每孔加入4×106CFU/ml菌液500μl,再加入液体培养基1500μl,使其每孔中菌液最终浓度调整为1×106CFU/ml,于80%N2、20%CO2,37℃专性厌氧培养48小时。吸出孔内培养基,PBS缓冲液轻轻冲洗后放入2.5%戊二醛溶液中固定24小时,之后依次梯度酒精脱水,二氧化碳临界点干燥,喷金后,Zeiss Supra 55 扫描电镜下观察细菌菌斑生物膜形成情况。B组为实验组:每孔加入菌液500μl,加入液体培养基1300μl,加入复方方氯己定溶液200μl,于80%N2、20%CO2,37℃专性厌氧培养48小时。吸出孔内培养基,PBS缓冲液轻轻冲洗后放入2.5%戊二醛溶液中固定24小时,之后依次梯度酒精脱水,二氧化碳临界点干燥,喷金后,Zeiss Supra 55 扫描电镜下观察细菌菌斑生物膜形成情况。

  1.4.4 结晶紫法测得对复方方氯己定细菌生物膜的抑制效果

  实验分组:

  空白对照组:不含菌和复方氯己定溶液的BHI液体培养基,每组4个平行

  阴性对照组:是指未加药液的BHI液体培养基和菌液混合液,每组4个平行

  实验组:含实验药液的BHI菌悬液培养基,每个药物浓度4个平行

  所有实验重复三次。

  步骤:

  96孔板中每孔先用滤菌后的人工唾液在底板形成生物膜

  然后加入BHI液体培养基180μl

  (阴性对照组为BHI液体培养基180μl;实验组为含实验药液20μl+ BHI液体培养基160μl)

  +菌悬液20 μl(浓度为1×107CFU/ml)

  (共200μl/孔)

  37℃

  专性厌氧培养48h

  酶标仪测菌悬液A620

  吸出培养上清和浮游菌,并用PBS清洗两次

  用4%甲醛固定,室温下干燥15min

  用0.1%结晶紫(w/v)染色5min

  用三蒸水彻底清洗至空白对照孔无色

  加入200μl 95%乙醇复吸

  微振荡器震动30min,酶标仪测菌悬液A620

  计算公式:抑制率=(1-A620实验组/A620阴性对照组)×100%

  1.5 统计学分析

  采用SPSS13.0软件对结晶紫法复方方氯己定溶液的抑制效果进行统计学分析分析。

  2 结果

  2.1 扫描电镜观察加入复方方氯己定溶液前后钛片上牙龈卟啉单胞菌生物膜生长情况

  图1 A组:未加复方方氯己定,形成较为密集的菌斑生物膜。

  图2 B组:加入复方方氯己定,未能形成良好的生物膜,细菌呈游离状态。

  2.2 结晶紫法测得对复方方氯己定细菌生物膜的抑制效果

  图3 加入不同培养基培养48h后空白对照组、阴性对照组、实验组的牙龈卟啉单胞菌生存状态,可以看到阴性对照组较为混浊,实验组接近于空白对照组,较为澄清。

  图4 结晶紫染色后空白对照组、阴性对照组、实验组的染色状态

  结晶紫是一种碱性紫色染料,用于细胞化学。在不同酸碱度的溶液中,细菌细胞通常带负电荷,而碱性染料在电离时,分子结构下其染色部分为正电荷,因此结晶紫染料的染色部分就容易与细菌结合而使其着色。其染色的程度与细菌的浓度呈正比,随着细菌浓度的增大而加深。图4可以看出在牙龈卟啉单胞菌菌液中加入复方方氯己定溶液后细菌生长受到明显的抑制,细菌的成膜遭到了破坏,因此复方方氯己定溶液可抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成。

  表1 结晶紫染色后各组的OD值 组别 OD(620)值减去空白矫正后的OD 抑制率 (%)空白对照组0.188±0.005阴性对照组 0.351±0.005 0.163±0.010实验组0.206±0.0070.018±0.01288.96

  采用SPSS13.0软件对结晶紫法复方方氯己定溶液的抑制效果采用单因素方差分析,(P﹤0.05),具有统计学意义。说明该实验条件下稀释了10倍后的复方方氯己定溶液可以抑制88.96%的牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成。

  3 讨论

  我们在前期预实验中发现复方氯己定溶液可以对牙龈卟啉单胞菌菌液产生抑制作用。然而在口腔环境中细菌是以菌斑生物膜的形式而非游离状态存在,这两种不同的存在方式决定了细菌在耐药性和致病性上具有显著差异。没有成膜的游离菌耐药性和致病性远远弱于菌斑生物膜所呈现出来的放大效应,因此研究游离状态下细菌的耐药性和致病性对于口外种植体周围炎模型的建立并不存在太大意义。为了模拟还原种植体周围炎生物膜的状态,我们首先在光滑钛片上建立了牙龈卟啉单胞菌菌斑生物膜,通过扫描电镜观察其生长状况,并观察加入复方氯己定溶液后药液对该菌斑生物膜的抑制作用。结果可以初步判定复方氯己定溶液对牙龈卟啉单胞菌菌斑生物膜的形成有抑制作用。目前种植体常见的材料多为纯钛或钛合金,所以我们选择在钛片上建立生物膜。常规种植体颈部为避免菌斑堆积设计为光滑结构,因此我们将钛片打磨、抛光。为了进一步说明复方氯己定的抑制效果,在96孔板中形成牙龈卟啉单胞菌菌斑生物膜,通过结晶紫染色的方法研究复方氯己定溶液对牙龈卟啉单胞菌菌斑生物膜作用效果。结果发现在本研究条件下复方氯己定溶液可以很好的抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成。

  作为双胍类化合物的氯己定是一种广谱抗菌剂,是目前已知的效果最确切的抗菌斑药物,被认为是口腔种植领域中拮抗微生物的药物“金标准”。 氯己定具有相当强的广谱杀菌、抑菌作用。低浓度呈抑菌作用,高浓度呈杀菌作用。也具有抗真菌及抗病毒的作用。复方氯己定溶液对口腔微生物的作用已经被很多研究所证实。但种植体周围炎菌斑生物膜的研究中尚未触及。在临床上,通常使用浓度0.1%~0.2%的凝胶或冲洗液。含漱时吸附在带阴性电荷的齿、斑块和口腔黏膜表面,随后吸附的药物从这些部位弥散,逐渐析出。下一步可进一步研究药物在种植体周围的缓释。以长久发挥持续作用。复方氯己定溶液另一种主要成分甲硝唑可以可用于口腔厌氧菌感染的治疗,而种植体周围炎的病原菌牙龈卟啉单胞菌是专性厌氧菌,因此效果良好。

  4 结论

  本实验条件下验证了复方氯己定含漱液对牙龈卟啉单胞菌菌斑生物膜的形成具有良好的抑制作用,验证了其可以作为口腔种植术的辅助用药,推广使用。

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