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药学类论文 线粒体通透性转化孔在天麻素抗心肌细胞氧化应激损伤保护机制中

2018-12-05 14:55:43来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要:目的 探讨H9c2心肌细胞在发生氧化应激损伤时,位于线粒体膜上的线粒体通透性转换孔在天麻素在抗氧化应激损伤的保护机制中所发挥的作用。方法 通过用H2O2(650 μmol/L)处理心肌细胞,以建立氧化应激损伤的模型,观察天麻素(10 μmol/L预处理)的保护作用,以及线粒体通透性转化孔抑制剂(10 μg/ml的环孢素A)预处理4h后对H9c2心肌细胞线粒体通透性转换孔的影响,MTT法初步检测其存活率后,流式细胞仪采用Annexin V-FITC/PI双染法观察细胞早期凋亡率,大鼠三磷酸腺苷(ATP)试剂盒(ELISA)检测ATP的含量,活性氧检测试剂盒检测活性氧(ROS)含量,激光扫描共聚焦显微镜观察线粒体膜电位,Western blot法检测线粒体释放色素C的情况,Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3的酶活力。结果 天麻素可以降低氧化应激引起的线粒体相对膜电位下降程度(3.08±0.14 vs 1.74±0.09),差异有统计学意义(P=0.004),而加入环孢素A后线粒体的相对膜电位为1.98±0.18,显著低于天麻素预处理组,差异有统计学意义(P=0.014)。天麻素可以降低由于氧化应激导致的ROS含量的增加,降低相关凋亡因子的含量以及抑制相关因子的活性(P<0.05),而以上作用均可被环孢素A阻断(P<0.05)。天麻素处理可以有效减少细胞凋亡,凋亡率为(1.97±0.82)%,低于氧化应激损伤模型组(6.45±1.11)%,差异有统计学意义(P<0.001),而环孢素A可以阻断天麻素的保护作用(5.77±0.75)%,差异有统计学意义(P<0.001)。结论 天麻素可以通过抑制心肌细胞发生氧化应激损伤时线粒体通透性转换孔的开放,最终通过减少凋亡来发挥一定的抗氧化应激损伤的作用。

  关键词:氧化应激损伤;线粒体通透性转化孔;天麻素;环孢素A

  线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)是线粒体内膜与外膜之间的非特异性高导电性的通道,为一种多蛋白的复合体结构,现在普遍认为其主要成分为线粒体内膜上的腺苷酸转运蛋白(adenine nucleotide translocator,ANT),线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC),线粒体基质中的亲环素D(cyclophilin D,Cyp D)。mPTP主要通过调节线粒体膜的通透性,维持内外离子的相对恒定,对形成稳定的电势差和维持膜电位的稳定有重要作用。并且有研究认为Cyp D是其行使功能的主要部分。而环孢素A(Cyclosporin A,CsA)作为一种免疫抑制剂应用于临床,在一定程度上可以减轻器官移植后的免疫排斥反应,另有研究表明高剂量的CsA其可以与Cyp D结合进而抑制Cyp D功能,最终阻碍mPTP正常功能的行使。天麻素(gastrodin,gas)是兰科植物天麻的干燥茎块中含量最高的单体成分,具有一定的抑制凋亡,调节心肌血供,保护心脏的功能,已有研究表明天麻素在H9c2心肌细胞氧化损伤模型中发挥一定的保护作用,但天麻素是否是通过抑制mPTP的开放来发挥对心脏的保护作用尚不明确。

  1 材料与方法

  1.1 材料与试剂

  实验对象:大鼠胚胎心脏组织来源的H9c2心肌细胞株购自于美国的ATCC公司。

  主要试剂:天麻素(纯度>99%)购自北京百威灵科技有限公司,环孢素A购自美国圣克鲁斯生物技术公司,H2O2购自美国Sigma公司,细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司,JC-1荧光探针、β-actin单克隆抗体,Caspase-3活性检测试剂盒、活性氧(ROS)检测试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所,Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购自联科生物公司,大鼠三磷酸腺苷检测试剂盒购自酶联生物公司。

  1.2 仪器与设备

  日本Olympus公司的FV1000激光扫描共聚焦显微镜,美国BD公司的FACScalibur流式细胞仪,美国Bio Tek公司的MX荧光酶标仪。

  1.3 方法

  1.3.1 实验分组及处理方法 本研究共有六个分组,分别为:①control组:正常的H9c2心肌细胞,常规培养,不予任何处理;②H2O2组:650 μmol/L的H2O2处理20 min;③gas+H2O2组:先用10 μmol/L的天麻素预处理20 min后,再用650 μmol/L的H2O2处理20 min;④gas组:天麻素处理20 min;⑤CsA组:10 μg/ml的环孢素A处理4 h;⑥CsA+gas+H2O2组:首先10 μg/ml的环孢素A预处理4 h,再用10 μmol/L的天麻素预处理20 min,最后650 μmol/L的H2O2处理20 min。

  1.3.2 细胞相对存活率检测 选择对数生长期内细胞,将其消化、离心、重悬后进行细胞计数,96孔板每孔加入100 μl,约1000个细胞,长到70%左右后按照各组要求处理,处理后把液体全部吸出,PBS轻轻冲洗后吸出残余PBS,每个孔迅速加入100 μl的空白DMEM培养基孔和10 μl的MTT溶液(5 mg/ml),细胞培养箱内继续孵育4 h后,每孔加入150 μl的二甲基亚砜(DMSO),继续在细胞培养箱中孵育约15 min,直至显微镜下观察不到蓝色结晶物后,检测570 nm处的光密度值。计算细胞的相对存活率(实验组光密度值/control组光密度值)。

  1.3.3 细胞早期凋亡率检测 H9c2心肌细胞贴壁面积达75%左右时按照各组处理,之后按照说明书进行处理,并流式细胞仪检测。

  1.3.4 ATP含量检测 H9c2心肌细胞贴壁面积达80%左右时按照各组要求处理,按照说明书破碎细胞,提取蛋白检测进行检测,并制备标准曲线。

  1.2.5 检测ROS含量 H9c2心肌细胞先装载DCFH-DA探针后按照各组要求处理,并按照说明书检测各组荧光强度。

  1.3.6 检测线粒体膜电位 H9c2心肌细胞重悬之后传入共聚焦小皿,待贴壁的H9c2心肌细胞长满小皿的50%时按照各组要求处理,之后弃去原培养基,PBS冲洗两次之后,加入含有JC-1(1 μg/ml)荧光探针的完全DMEM培养基,在细胞培养箱内孵育15 min后置于激光扫描共聚焦显微镜上40倍物镜观察,以高线粒体膜电位时红色荧光强度与低电位差时的绿色荧光强度的比值表示线粒体相对膜电位,调节激发光波长为488 nm和543 nm。

  1.3.7 检测Cyt C的表达情况 各组处理之后用预冷的PBS冲洗后,用吸水纸吸取残余PBS,加入适量体积的裂解液与PMSF的混合液(100:1)4℃裂解细胞30 min,收集蛋白提取液,进行超声破碎使细胞充分裂解后,4℃、12000 r/min高速离心15 min后小心吸取上层清液,BCA法定量后根据蛋白浓度加入合适浓度及体积的蛋白加样缓冲液,调节蛋白浓度为2.5 μg/μl后在100℃条件下蛋白变性5 min。待冷却至室温后进行120V电泳、90V转膜, 10%脱脂奶粉在室温封闭1 h,1:1000稀释Cyt C和β-actin抗体,4℃冰箱中孵育10 h后取出条带,Tris-HCl缓冲盐溶液洗膜3次,每次5 min,之后室温条件下孵育二抗2 h后,再次用Tris-HCl缓冲盐溶液冲洗3次,每次5 min,最后用Genshare超敏化学发光底物检测试剂盒进行显色,AI600化学发光成像仪采集图片,最终用Image J进行灰度扫描及定量分析。

  1.3.8 Caspase-3活性检测 按照说明书提取蛋白提取液,Bradford法进行定量,并加入裂解液调节各组蛋白浓度为2 mg/ml后根据说明书进行检测,并计算相应的酶活力单位。

  1.4 统计学分析

  所有数据均采用SPSS 22.0进行统计分析。数据以表示,各组数据之间采用完全随机设计的单因素方差分析进行比较,两组间比较用LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

  2 结果

  2.1 mPTP的开放对细胞相对存活率的影响

  计算各组相对存活率,经方差分析后,差异有统计学意义(F=22.87,P<0.001)。与control组相比,H2O2组(0.60±0.05)的细胞相对存活率下降,差异有统计学意义(P<0.001); gas+H2O2组(0.81±0.11)其相对存活率显著高于H2O2组,差异有统计学意义(P<0.001);而CsA+gas+H2O2组(0.67±0.08)细胞相对存活率与gas+H2O2组相比显著下降,差异有统计学意义(P=0.011)(见图1)。

  图1 细胞相对存活率

  *P < 0.05;**P < 0.001

  2.2 mPTP的开放对细胞早期凋亡率的影响

  流式细胞仪检测得细胞早期凋亡率(见图2A),经方差分析后差异有统计学意义(F=16.25,P<0.001)。其中control组凋亡率为2.07%±0.07%,H2O2组为6.45%±1.11%,与control组相比,H2O2组早期凋亡率升高,差异有统计学意义(P<0.001);而gas+H2O2组早期凋亡率为1.97%±0.82%,低于H2O2组,差异有统计学意义(P<0.001);CsA+gas+H2O2组早期凋亡率为5.77%±0.75%,高于gas+H2O2组,差异有统计学意义(P<0.001)(见图2B)。

  A

  图 2 细胞早期凋亡

  A:细胞早期凋亡散点图;

  B:细胞早期凋亡比例(%)。

  *P < 0.05;**P < 0.001

  2.3 mPTP的开放对细胞产能的影响

  经过大鼠三磷酸腺苷试剂盒(ELISA)的检测,通过绘制标准曲线并计算各组的ATP含量,经方差分析,差异有统计学意义(F=88.33,P<0.001)。control组ATP含量约为(6605±287)nmol/L,H2O2组ATP含量约为(4887±188)nmol/L,低于control组,差异有统计学意义(P<0.001);而gas+H2O2组的ATP含量约为(6195±190)nmol/L,高于H2O2组,差异有统计学意义(P<0.001);CsA+gas+H2O2组ATP含量为(4869±146)nmol/L,与gas+H2O2组相比ATP含量显著降低,差异有统计学意义(P<0.001)(见图3)。

  图 3 细胞内ATP含量

  *P < 0.05;**P < 0.001

  2.4 mPTP的开放对胞内ROS含量的影响

  经试剂盒检测得到胞内ROS相对含量,以DCF的荧光强度表示胞内ROS相对含量,经过方差分析后,差异有统计学意义(F=34.72,P<0.001)。H2O2组DCF荧光强度(6019±620)高于control组(3234±240),两者差异有统计学意义(P<0.001); gas+H2O2组荧光强度(4144±344)低于H2O2组,差异有统计学意义(P<0.001);CsA+gas+H2O2组DCF荧光强度(5900±304),与gas+H2O2组相比明显升高,差异有统计学意义(P<0.001)(见图4)。

  图4 ROS相对含量(DCF荧光强度)

  *P < 0.05;**P < 0.001

  2.5 mPTP开放对线粒体相对膜电位的影响

  细胞导入JC-1荧光探针后用激光扫描共聚焦显微镜观察各组荧光(见图5A),各组线粒体相对膜电位比值经方差分析后,差异有统计学意义(F=36.56,P<0.001)。其中control(0 min)组与control(20 min)荧光强度比值分别为(5.56±0.22)vs(4.96±0.10),两者相比无统计学差异(P=0.151),说明短时间内荧光毒性及荧光淬灭对实验影响可以忽略;H2O2组相对比值为1.74±0.09,低于control组(20 min),差异有统计学意义(P<0.001);gas+H2O2组JC-1荧光比值(3.08±0.14)高于H2O2组,差异有统计学意义(P=0.004);CsA+gas+H2O2组的线粒体相对膜电位(1.98±0.18)低于gas+H2O2组,差异有统计学意义(P=0.014)(见A

  图5B)。

  gas+ H2O2+ CsA

  CsA

  gas

  gas+ H2O2

  H2O2

  control(20 min)

  control(0 min)

  图5 激光扫描共聚焦显微镜观察线粒体膜电位

  A:线粒体膜电位变化;

  B:JC-1荧光强度(红/绿)

  *P < 0.05;**P < 0.001

  2.6 mPTP的开放对Cyt C释放的影响

  A

  Western blot法检测Cyt C的表达(见图6A),结果经过分析后,差异有统计学意义(F=7.19,P=0.003)。以control组表达为标准,H2O2组表达为(1.73±0.23),差异有统计学意义(P=0.001);gas+H2O2组表达为(1.15±0.40)低于H2O2组,差异有统计学意义(P=0.005);CsA+gas+H2O2组的表达(1.61±0.08)与gas+H2O2组相比显著升高,差异有统计学意义(P=0.016)(见图6B)。

  12kDa

  43kDa

  Cyt C

  β-actin

  图6 Western Blot法检测蛋白含量

  A:Cyt C的表达

  B:Cyt C相对表达量

  *P < 0.05;**P < 0.001

  2.7 mPTP的开放对Caspase-3活性的影响

  经过Caspase-3活性检测试剂盒检测,并计算相应的酶活力单位,经过分析各组差异有统计学意义(F=15.77,P<0.001)。H2O2组Caspase-3活性(19.13±4.32)高于control组(3.68±1.47),差异有统计学意义(P<0.001);gas+H2O2组的Caspase-3活性(4.69±1.53)低于H2O2组,差异有统计学意义(P<0.001);CsA+gas+H2O2组Caspase-3的活性(18.51±5.11)高于gas+H2O2组,差异有统计学意义(P<0.001)(见图7)。

  图7 Caspase-3的活性(酶活力单位)

  *P < 0.05;**P < 0.001

  3 讨论

  心肌细胞经过短暂的缺血缺氧后,若给予其快速恢复血供,虽然能改善心肌细胞的血液供应,但是对心肌细胞的损伤不仅没有得到相应的缓解,反而使心肌细胞的损伤程度加深加重,严重时甚至可能出现心肌细胞的凋亡,称其为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)。而氧化应激反应则是引起MIRI的重要原因,主要是因为发生氧化应激时氧化自由基的生成功能和抗氧化功能之间失去平衡。已有研究表明线粒体参与了氧化应激以及细胞凋亡等多种生命活动,线粒体损伤诱导的细胞凋亡是心肌细胞氧化应激损伤的重要机制之一,线粒体对维持心肌细胞功能的正常具有非常重要的意义。mPTP作为线粒体膜上的重要通道,在发生MIRI时发挥着重要的作用。mPTP的病理性开放是MIRI中不可避免关键因素,mPTP长时间开放可以使线粒体膜通透性改变,下调线粒体膜电位,打破多种离子平衡,可以抑制线粒体呼吸传递链,甚至进一步启动凋亡程序。而线粒体损伤会导致Cyt C释放到胞浆中,在三磷酸脱氧腺苷存在的条件下与凋亡因子1发生作用并形成多聚体,之后与Caspase-9作用形成凋亡小体,而激活型的Caspase-9还可以激活Caspase-3,活化的Caspase-3作用于胞内多种重要结构和功能蛋白,最终导致细胞凋亡。本研究结果显示, H2O2(650 μmol/L)处理可以显著增加细胞内ROS的含量,降低细胞内ATP含量,导致细胞氧化与抗氧化功能失衡,使mPTP病理性开放引起线粒体损伤,并引起Cyt C释放增加以及激活Caspase-3等凋亡因子。

  天麻素为中药天麻的主要成分,有一定的心脏保护作用,研究发现其可以通过PI3K/Akt途径使GSK-3β失活,并认为其可能是通过抑制mPTP的开放,进而发挥相应的保护作用[9]。而本研究的结果也证实了天麻素在心肌细胞发生氧化应激时能够降低细胞内ROS的含量,增加细胞内ATP,阻止mPTP病理性开放,减少Cyt C释放以及抑制Caspase-3活性,有效的减少细胞凋亡,发挥一定的保护作用。

  环孢素A作为mPTP重要成分Cyp D的特异性结合物,可以与Cyp D结合,进而导致mPTP病理性开放,引发线粒体损伤甚至启动细胞凋亡程序。本研究的结果显示,环孢素A可以阻断在心肌细胞发生氧化应激时天麻素降低细胞内ROS的含量,阻止mPTP病理性开放,减少Cyt C释放以及抑制Caspase-3活性,有效减少细胞凋亡的一系列保护作用,说明天麻素的抗氧化应激损伤心肌保护作用是通过mPTP实现的。

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