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最新药学论文 高效溶解雨生红球藻厚壁孢子的菌株筛选及作用途径初探

2018-12-04 09:49:33来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要

  虾青素,自然界效应最强的抗氧化剂之一,主要有三种来源:从水产品废弃物、红发夫酵母以及雨生红球藻中提取。雨生红球藻,素有“天然虾青素浓缩库”称号,一直是提取天然虾青素的研究热点。雨生红球藻生活史复杂,具有多种形态,包含游动细胞、不动细胞、孢子以及厚壁孢子。其中厚壁孢子中虾青素含量较高,但由于其细胞壁较厚,因此常需破壁处理。

  目前常用的破壁方法主要有三种:物理破壁、化学破壁以及酶法破壁。这三种方法各有利弊,但均不适宜于工业大规模生产,因此如何简单高效破除雨生红球藻厚壁孢子壁,快速提取虾青素成为一直困扰研究人员的问题。

  本实验室通过对雨生红球藻的长期培养和观察中发现,红A1、A2以及US3三种雨生红球藻细胞壁表面常附着细菌,并伴随溶藻现象的发生。因此,以上述三种藻种为实验对象,进行相关细菌的分离筛选操作,共得到4株细菌,分别命名为:A1、A21、A22、US3,再经过初筛、复筛等操作,选取溶藻效率较高的细菌(A21和US3两株细菌)进行下一步实验。

  对A21和US3两株细菌进行相关菌种鉴定实验,A21和US3细菌革兰氏染色实验均表现为红色,此结果表明两株细菌均为革兰氏阴性菌(G-);再通过PCR扩增、基因测序、与库中标准序列比对等操作,鉴定A21细菌为嗜麦芽寡养单胞菌属,US3细菌为根瘤菌属。

  将A21和US3两株细菌的活菌菌体、发酵上清液、破碎细胞分别与雨生红球藻厚壁孢子共培养,观察并计算溶藻率后,发现两株细菌的作用方式均为活菌菌体,且在扫描电镜下能清楚地观察到细菌主要通过与雨生红球藻细胞壁相互作用来达到溶解藻细胞的效果。

  同时,也发现影响细菌溶藻效率的几个因素:①温度:较高的温度(28-30℃)相较于低温(15-20℃)更利于细菌溶藻;②雨生红球藻的前处理方式:不同的前处理方式也会对细菌的溶藻效率产生一定的影响,无菌水洗涤及无菌水重悬的前处理方式更适于雨生红球藻的溶藻;③红球藻细胞状态状态:细菌对于不同状态下的雨生红球藻的溶藻效率也会有明显差异,简而言之即:不动细胞>厚壁孢子>游动细胞;④雨生红球藻藻种:细菌对不同藻种的雨生红球藻的溶解情况也会有明显的差异,其中以US3藻种效果较好。

  关键词:雨生红球藻;虾青素;生物破壁;溶藻菌鉴定;细菌作用方式;

  第1章绪论

  1.1虾青素简介

  1.1.1虾青素的生化性质

  虾青素(astaxanthin,3,3'-二羟基-4,4'-二酮基-胡萝卜素),酮式类胡萝卜素的一种,分子式为C40H52O4,相对分子量为596.86,晶体为褐红色[2],熔点在216℃左右,不溶于水,易溶于氯仿、乙酸乙酯、苯等有机溶剂,室温下虾青素在各溶剂中的溶解度如表1.1[1]所示。

  表1.1室温下虾青素在各溶剂中溶解度

 

  虾青素具有良好的抗氧化作用,这与其分子结构基础密不可分。在其分子结构中含有9个共轭双键[11],构成较长的不饱和烯链;且在共轭双键末端的不饱和酮会与结构中的羟基构成羟基酮结构,因而使其具有活泼的电子效应,能够提供电子或吸引电子。此结构基础决定了虾青素的良好的生物学活性,以及化学不稳定性。

  图1.1虾青素的分子结构

  1.1.2虾青素的生物安全性

  天然虾青素目前研究表明较为安全,尚未发现明显的毒副作用。Spiller和Dewell等采用随机对照双盲法对健康人群口服8周(6mg/d)虾青素进行了安全性评估,发现在第4周和第8周受试者的血压以及各项生化指标之间差异无统计学意义。1987年,美国食品药品管理局(FDA)批准虾青素作为饲料添加剂用于在畜牧业及渔业中;1999年,FDA批准食品加工行业可将虾青素作为膳食补充剂使用。目前,由于虾青素生物安全性高,越来越多的国家把虾青素作为添加剂用于食品、饲料等多个行业。

  1.1.3虾青素的生物学活性

  因其独特的化学结构,虾青素具有多种优异的生物学性质,因此在实际的生产生活中具有广泛的应用。

  抗氧化是虾青素首要的功能,相关研究[12]表明,虾青素的抗氧化能力是维生素E的550倍,茶多酚的200倍,β-胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素和角黄素等类胡萝卜素的10倍,是目前世界上公认为最强的天然抗氧化剂之一。在文中1.1.1部分已经阐述过虾青素具有抗氧化作用的分子结构基础;同时其抗氧化的作用机理还与调控信号通路、改善线粒体功能等息息相关。Tripathi D等的研究表明虾青素通过调节Nrf2通路中基因的表达来维持体内的氧化还原平衡态;Wolf等发现虾青素能够在氧化应激条件下维持较高的线粒体膜电位和呼吸刺激,进而改善线粒体功能和氧化还原状态。

  虾青素能够提高机体的免疫力和机体的应激力。有关研究[5]中,以老龄小鼠为实验对象,补充适量天然虾青素后能明显观察到,小鼠体内的IgM和IgG含量增加,此结果表明在抗原入侵初期,天然虾青素能增强特异性体液免疫反应;Park[6]等研究表明,虾青素能够减轻年轻健康女性受试者机体中和炎症相关的DNA氧化损伤,实现提高免疫力的作用;有研究中用抗氧化剂虾青素和维生素C共同治疗的中性粒细胞,其结果表现出NO增加,并伴随着超氧阴离子和过氧化氢产生的减少,以及吞噬能力的改善,进而提高机体免疫力。

  因其诱人的感官呈色性和优良生物活性,虾青素在渔业及畜牧业方面的应用也一直是人们关注的重点。Storebakken等研究中,以虹鳟为实验对象,用含57mg/kg虾青素的饲料喂养,明显观察到生长速度的提高;同时,用含有虾青素的饲料喂养大西洋鲑鱼苗,鱼苗正常生长,而使用不添加虾青素的饲料喂养,鱼苗存活率低于50%;Merchie等研究表明,在饲料中添加虾青素可帮助养殖对象提高免疫力,增强抗病力,提高养殖对象的存活率;同时,鉴于虾青素本身的代谢特征,较易与蛋白质结合形成虾青素蛋白,赋予水产品较为鲜艳的颜色,提高水产品的市场竞争力。

  此外,虾青素还具有抗衰老、保护视力、抗肿瘤,保护中枢神经系统,预防心脑血管疾病等一系列重要的生理学效应,在此就不详述了。

  目前虾青素的市场价格为每千克2500美元,全球每年有2亿美元以上的市场容量,因此着眼于虾青素的研发不仅能够造福于人类的生命健康事业,同时也能够为社会提供极大的经济效益。

  1.1.4虾青素的生产

  目前,虾青素的生产主要分为化学合成和自然提取两种方法。

  人工合成虾青素是在其他类胡萝卜素的基础上氧化得到或利用胡萝卜素单体直接合成。化学合成虾青素需多步反应完成,工艺复杂,提取效率低,为5-10%左右;且难控制副产物的产生,安全性能较低,难以工业上大规模生产。同时,人工合成的虾青素多数为顺式结构,与天然虾青素在结构、性能等多个方面存在明显差异,其安全性、稳定性、抗氧化性均明显低于天然虾青素。目前,诸多国家对人工合成虾青素的应用进行限制。因此,通过生物资源提取天然虾青素已成为目前虾青素来源研究的重点。

  图1.2虾青素的3种结构

  目前,生物提取虾青素主要有三种来源:水产品加工废弃物、红发夫酵母以及雨生红球藻[8]。

  表1.2虾青素的三种生物来源相比较 

  综上所述,雨生红球藻中的虾青素结构为3S-3’S,抗氧化活性高;且其虾青素含量明显高于水产品废弃物、红发夫酵母两种生物来源。同时其80%以上的虾青素均为酯化形式存在,生物学活性高,这是这是通过化学合成和利用酵母菌提取等手段获得的虾青素所不具备的优势。因此,雨生红球藻有望成为继螺旋藻、盐藻之后的另一种高经济价值的微藻。

  1.2雨生红球藻简介

  1.2.1概述

  雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种单细胞微藻,隶属绿藻门、团藻目、红球藻科、红球藻属。雨生红球藻在应激条件下,细胞游动性逐渐降低的同时,细胞内部开始积累大量虾青素,而使红球藻细胞整体呈红色。同时,因其广泛分布于淡水水体中,又名湖泊红球藻。

  图1.3不同阶段雨生红球藻形态示意图

  虽然雨生红球藻是单细胞生物,但形态多样、生活史复杂。目前主要根据藻细胞形态、颜色、类胡萝卜素与叶绿素的比值和蛋白质含量等变量,将雨生红球藻细胞主要分为4种形态:游动细胞、动孢子、静孢子、厚壁孢子。

  1.2.2雨生红球藻的虾青素积累

  雨生红球藻的生活史较为复杂,但以营养细胞(游动细胞)和厚壁孢子两种形态为主:

  在弱光、氮磷丰富的环境中,雨生红球藻生长迅速,主要以绿色游动细胞为主,该阶段红球藻细胞体积较小,游动性较好,以叶绿素为主要色素,但虾青素含量较低[16];

  在应激条件(如受到高光照、高温和营养盐饥饿等不良因子影响)下,游动细胞鞭毛渐渐消失,逐渐转入不动细胞阶段,同时细胞中开始积累虾青素;当环境变得更恶劣时,藻细胞为保护自身,体内虾青素含量急剧增加,直至完全变红,并伴随着细胞壁的增厚,即细胞外壁薄薄的膜消失,原生质体外包裹着厚厚的孢子壁,这就是我们常见的厚壁孢子。

  雨生红球藻厚壁孢子,自然界天然虾青素“浓缩品”,在提取虾青素的过程中首先需要破除厚壁孢子壁,才能提取虾青素,因此寻找到高效快速的破壁方法,对于红球藻中虾青素大规模开发利用具有重要的意义。

  1.2.3雨生红球藻的破壁方法

  目前常用的破壁方法主要有物理破壁法、化学破壁法和酶法破壁。

  物理破壁法种类繁多,效果相较于化学破壁、酶法破壁两种方法好,详细叙述见表1.3;化学破壁法主要包含酸碱加热、有机提取等破壁手段,此法操作复杂,耗时较长,而且破壁过程中使用多种化学试剂,成本较高,安全性较差,产品易被污染。酶法破壁法主要是指利用各种酶类(纤维素酶、果胶酶等)破坏细胞壁中的β-1,4糖苷键,导致细胞壁破裂;酶法破壁的专一性差,提取效率低,并且后续产品分离困难,进而影响最终产品的品质,不利于工业上大规模提取虾青素。

  表1.3雨生红球藻的物理破壁法

 

  关于红球藻厚壁孢子破壁常用的三种方法,各有利弊,但均在大规模的工业生产中有着明显的不足,因此,如果想要通过培养并诱导雨生红球藻细胞来生产虾青素,那么温和有效的破除厚壁孢子细胞壁是目前首要需要解决的问题。

  1.3溶藻细菌的分离

  1.3.1溶藻菌简介

  微生物控藻、杀藻已经日益成为研究水华、生物入侵等问题的热点。目前,研究人员已发现多种具有溶藻活性的微生物。近年来随着研究的深入,溶藻病毒被发现,其能够进入藻细胞体内进而杀死藻细胞;也有多篇文章报道了具有溶藻效果的放线菌,如Yoko Yamamato[18]从样品中共分离到40株具有溶藻活性的放线菌,其中S-9菌株效果最强,能够迅速杀死蓝藻细胞;同时,部分真菌也具有较好的溶藻效应,它主要通过分泌胞外物来杀死藻细胞;细菌作为微生物界的主要成员自然不可忽视。随着科研人员的进一步探索,多种具有溶藻效应的细菌日益成为研究的热点。

  溶藻细菌是指能够抑制藻细胞生长或能够通过某种作用方式杀死藻细胞的一类细菌。1924年,第一株溶藻细菌被发现[19],研究人员发现一株黏细菌,其能够寄生在刚毛藻上使其死亡,从此溶藻菌进入大众的视野,逐渐成为生物防治等领域的研究热点。

  目前,已发现的溶藻细菌多数属于不同的种属,具有不同的溶藻特性。如Lee等[20]从海水中分离出一株细菌能够杀死骨条藻,经鉴定为假交替单胞菌;Dakhama等[21]发现一株铜绿假单胞菌通过释放低分子量物质,能够强烈的抑制绿藻及蓝藻的生长;这些报道都证明了溶藻菌在藻类生长以及繁殖过程中的具有重要的影响,也为分离红球藻细胞溶藻菌提供了有力的理论基础和菌种资源。

  1.3.2溶藻菌的分离鉴定

  1.3.2.1溶藻菌的分离

  溶藻菌广泛分布于自然界中,可以通过多种方法进行初步分离,目前主要可以分为两种方式,即液体感染分离和固体感染分离,其中以液体感染分离更为常用。

  液体感染法通常包含以下几个步骤:①采集:选取具有潜在溶藻菌的水样,并进行相关预处理工作;②共培养:将采集的水样与目标藻细胞置于适宜条件下共培养;③分离:从共培养中溶藻反应阳性的体系中进行优势细菌的分离,诸如稀释平板涂布法、平板划线法等;④筛选:溶藻细菌的进一步筛选,可分为初筛、复筛等过程[23]。液体感染法适用范围广,适用于大多数溶藻细菌的分离,但筛选步骤多,周期长且工作量较大[9],不利于高通量、大规模筛选工作的进行。

  固体感染方法主要是利用相关固体培养基(如LB培养基、牛肉膏蛋白胨培养基等)进行空斑筛选。目前,此法在溶藻菌的分离研究中适用范围较窄,在实验研究中并不常用。

  1.3.2.2溶藻菌的鉴定

  菌种鉴定,微生物学操作中不可缺少的一部分,帮助确定菌种归属,对于菌种研究具有极其重要的作用。此前,菌种鉴定,步骤多且过程复杂;但随着分子生物学的进步,细菌鉴定发展迅速,已变得十分简便,尤其是多聚酶链式反应(PCR)、核糖体(rRNA)基因检测分析等技术的商品化应用,给菌种鉴定提供了新的可能。

  原核生物的核糖体RNA主要有3种类型:5S、16S和23S rRNA,分别含有的碱基数也是逐渐递增的。60年代末,有学者开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类,研究中发现,16S rRNA相较于另外两种rRNA具有更好的操作性,其优点主要包含以下几点:①16SrRNA为所有原核细胞共有,方便进行物种间的比较;②16SrRNA序列中既包含有保守序列又含有可变序列,因此它的序列变化与进化距离相适应;③16SrRNA序列大小合适,方便进行相关操作。因此,16SrRNA基因检测分析逐渐成为菌种鉴定的分类依据。

  目前,16SrRNA基因测序主要是扩增16SrRNA,与特定质粒克隆或直接使用PCR产物直接测序。将所得序列与已知序列比对,如发现两株细菌的16SrRNA同源性大于99%,则可初步判断为同一菌种。此法,适用范围广、操作简便、耗时短,日益成为菌种鉴定以及研究微生物系统发育等重要操作之一。

  1.3.3溶藻细菌的作用机理

  溶藻菌能够杀死藻细胞,但细菌如何达到此效果的一直是困扰研究人员的问题。随着研究的深入,溶藻细菌对藻细胞的作用方式也日渐清晰,目前可以主要分为以下5种:直接接触溶藻、释放相关物质、细菌与藻细胞竞争营养物、在水面形成菌胶膜以及进入藻细胞内杀死细胞。

  直接接触溶藻

  部分细菌直接接触藻细胞表面,分泌相关酶或其他物质,来溶解藻细胞细胞壁,进而达到逐渐杀死整个藻细胞的目的,如Ymamoto[24]分离得到一株细菌能够直接抑杀鱼腥藻;

  释放相关物质:

  一些细菌杀死藻细胞,主要通过分泌特异性或非特异性的胞外物质,如多肽、氨基酸、酶以及抗生素等,有研究表明[25]一株细硝铵醇单胞菌能够分泌对微囊藻具有强烈杀灭活性的五肽;

  竞争相关营养物质:

  细菌也可以通过培养液中营养成分如C、N、P、K等,与藻细胞产生直接或者间接的联系。细菌与藻细胞抢夺培养基中有限的营养物质,进而抑制藻细胞的生长或者杀死藻细胞,也是一种常见的作用方式;

  形成菌胶膜:

  有报道称亚硝酸菌、腐败菌等大量出现时,可在水面集结形成菌胶膜,阻碍气体交换和光线投射,导致水环境恶化,致使藻细胞死亡;

  进入藻细胞内部:

  个别细菌能够直接进入藻细胞内部杀死藻细胞。有学者在意大利瓦泽湖爆发的水华中,分离到一株类蛙弧菌。其能够攻击铜绿微囊藻细胞壁,进入藻细胞内部,在藻细胞内部周质空间活动,使铜绿微囊藻内部结构逐渐瓦解,同时细胞壁也在不同位点出现破裂,两方面同时作用,最终导致了铜绿微囊藻的死亡。

  1.4实验研究的技术路线

  本研究参考多篇相关文献,根据现有资料及自身材料特点绘制出符合本实验研究目的及预期目标的技术路线图。从图中可看出,实验主要可以分为4部分:溶藻菌的分离筛选、溶藻菌的保种、溶藻菌的鉴定以及溶藻菌作用方式鉴定。其中溶藻菌鉴定又需多步实验确定,主要分为三部分:革兰氏染色鉴定、生长曲线以及常用的16SrRNA基因检测等。综合来看,此技术路线实用简便,不仅为此次实验开展提供指导,也为今后溶藻菌分离提供相关参考。

  图1.4研究技术路线图

  1.5研究目的及意义

  虾青素作为自然界公认的“最强抗氧化剂”,不仅抗氧化效果显著,还具有多种生物学功能,提高机体免疫力、抗癌、治疗心血管疾病等,在人类生命健康领域具有极大地价值。雨生红球藻,天然虾青素“浓缩库”,日益成为虾青素生物提取的研究热点。雨生红球藻厚壁孢子中虾青素含量丰富,且纯度高,但如何高效快速的破壁依旧是困扰着科研人员的问题。

  目前市场上常用的破壁方法主要有物理破壁、化学破壁以及酶法破壁,三种方法各有利弊,虽都能完成破壁任务,但提取效率不高、纯度低、破坏虾青素结构等不可忽视的缺点成为3种破壁方式的通病,也制约着从雨生红球藻中工业化提取虾青素产业的发展。因此,寻求高效快速的破壁方法成为目前科研人员的研究重点。

  本研究着眼于溶藻菌的分离。通过对长期培养的雨生红球藻的观察,发现雨生红球藻中细菌破壁现象的存在,并通过生物学方法分离筛选能够高效溶解雨生红球藻厚壁孢子壁的细菌,进而为简化虾青素的提取提供可能;同时,也为虾青素大规模工业生产提供新的研究思路。

  溶藻菌的分离与鉴定在藻类的研究中不可或缺的一部分。雨生红球藻厚壁孢子的溶藻菌分离,不仅具有极大的市场前景,也完善了溶藻菌的分类系统,拓宽溶藻菌的作用范围,为以后溶藻菌的分离提供基础。

  第2章材料与方法

  2.1实验材料

  2.1.1样品信息

  刘永梅老师实验室长期接种传代的雨生红球藻样品(A1、A2、US3)的细胞壁表面附着细菌,并伴随溶藻现象的发生,因此以这3种雨生红球藻培养液作为样品开展实验;

  2.1.2培养基

  本研究所使用的培养基类型及组成成分见表2.1;

  表2-1本研究中的使用的培养基及成份组成

  

  (*注释:A5溶液:H3BO3 2.86g;MnCl2▪4H2O 1.86g;ZnSO4▪7H2O 0.22g;Na2MoO4▪2H2O 0.39g;CuSO4▪5H20 0.08g;Co(NO3)2▪6H2O 0.05g;)

  2.1.3实验试剂

  本实验中所使用的试剂及生产公司见表2.2;

  表2.2主要生化试剂和来源

  

  2.1.4实验仪器

  本实验中所使用的仪器及设备如下表2.3所示;

  表2.3仪器设备和生产厂家

 

  2.1.5 PCR引物

  本实验研究中所使用的引物如下表2.4所示;

  表2.4研究中用到的引物

 

  2.1.6分析软件

  本实验中所使用的分析软件如下表2.5所示;

  表2.5分析软件

 

  2.2实验方法

  2.2.1溶藻菌的分离

  配置LB固体培养基,倒平板,冷却静置。同时,三种雨生红球藻样品液(A1、A2、US3)用无菌水分别稀释成10-1,10-2,10-3,10-4四个梯度,各梯度的藻培养液吸取0.1ml置于LB固体平板上,均匀涂布后置于37℃恒温培养箱中培养48h后,分别挑取各平板中的单菌落,同时进行多次划线培养,以便获得纯的单克隆菌落。

  2.2.2溶藻菌的初筛

  取20mlLB液体培养基,向其中接种细菌单克隆,置于摇床中(28℃,180r/min)培养48h;吸取1ml红球藻的厚壁孢子培养液置于24孔板中;向其中1孔加入液体LB培养基作为空白对照,其余依次添加筛选所得细菌的液体培养液,光照室温培养4d,每天吸取少量样品置于显微镜下观察,查看红球藻厚壁孢子的溶解情况。

  2.2.3溶藻菌的复筛

  将溶藻阳性反应的细菌-红球藻混合培养液稀释成5个梯度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5),重复2.2.1中操作,直至得到单克隆;挑取再次分离到的单克隆接种于20mlLB液体培养基中,置于摇床中(28℃,180r/min)培养48h;

  100ml红球藻厚壁孢子培养液中加入50ul氨苄青霉素(100ug/ul)和30ul卡那霉素(100ug/ul)继续高光培养6小时;离心去除培养基(3500rpm,8min),使用无菌水清洗多次,直至红球藻厚壁孢子培养液中几乎没有细菌,无菌水重悬;

  吸取处理后的2ml红球藻厚壁孢子培养液置于24孔板中,再分别吸取200ul细菌培养液加入其中,另外吸取200ulLB培养基作为对照,依据3.4中步骤重复操作,并计算溶藻率及虾青素含量。

  2.2.4溶藻结果的判定

  2.2.4.1溶藻率的测定

  加入细菌的1-4d内定时使用浮游生物计数框对相应的红球藻培养液中的红球藻厚壁孢子数量进行计量,依据计算公式计算不同种细菌的溶藻率。

  溶藻率的计算公式:

  ×100%

  2.2.4.2虾青素含量的测算

  吸取1ml共培养4d的混合液置于1.5mlEP管中,离心(3000rpm,10min),弃去上清;沉淀中加入1mlDMSO溶剂萃取,离心(3000rpm,10min),转移上清至另一洁净的EP管内;调零后,使用紫外分光光度计对萃取后的溶液分别进行全波长(300-750nm)扫描,以确定溶液的组份;接着测量提取液在492nm处的吸光度,在依据经验公式计算溶液中的虾青素含量;

  虾青素的计算公式:

  2.2.5菌种的保藏

  吸取1ml菌液置于2ml的冻存管内,离心(4000rpm,5min),弃上清;生理盐水清洗2-3次,细菌沉淀中加入2ml冻存液(生理盐水:冻存缓冲液=1:1)重悬;封口后缓慢降温(①4℃预冻30min;②-20℃中冷冻40-60min;③-80℃冰箱中永久保存)。

  2.2.6菌种鉴定

  2.2.6.1革兰氏染色

  取干净载玻片,火焰灼烧一下以去除油脂;在玻片上滴一滴菌液,并用灼烧后的接种环制成2mm左右的涂膜,自然干燥后迅速通过火焰2-3次以固定细菌;使用革兰氏染色试剂盒中试剂依次染色,用吸水纸吸干后,置于100倍光学显微镜下观察,革兰氏阳性菌显紫色,革兰氏阴性菌显红色;

  2.2.6.2生长曲线

  取5ml培养18h的细菌种子液接种于50mlLB液体培养基中,30℃,180r/min振荡培养,每隔2h取样,用紫外可见分光光度计测菌液在600nm处的OD值;

  2.2.6.3基因组测序

  使用DNA快速提取仪快速高效提取A21和US3细菌基因组DNA,PCR扩增后,凝胶电泳系统初步判断目的基因片段长度,同时将未纯化的PCR产物送至上海生工武汉测序部进行测序。将测序所得序列通过EzTaxon网站进行序列比对,确定种属信息,并通过MAGE软件绘制各菌种的系统发育树;

  表2.1 PCR扩增反应体系

 

  表2.2 PCR扩增反应条件

 

  2.2.7溶藻菌作用方式的确定

  将红球藻厚壁孢子培养液离心(3500rpm,10min),上清液转移至干净容器备用,藻细胞使用无菌水洗涤2到3次,分别使用等量的上清(0.22um无菌滤膜过滤处理)和无菌水重悬备用;

  将筛选所得细菌置于28℃摇床中180r/min培养48h,离心(6000r/min,8min);(1)将细菌上清液使用0.22um的无菌滤膜过滤两次,确保无菌状态(LB平板划线验证),1:5的体积比加入藻处理液中;(2)细菌菌体使用无菌水洗涤2次后,使用纯水悬浮,以1:5的体积比加入藻处理液中;(3)菌体使用无菌水洗涤2次,反复冻融(室温到-80℃)获得破碎细胞液,以1:5的体积比加入藻处理液中;(4)对照组采用无菌水分别以1:5的体积比加入藻处理液中;(6)将不同藻种细胞(US3和NH2)通过无菌水洗涤处理,以1:5的体积比向其中加入细胞活菌菌体;

  将装有处理后的细菌-藻培养液的24孔板在黑暗条件下置于培养箱中30℃恒温培养,每隔48h取样观察并计数,计算溶藻率;

  2.2.8扫描电镜观察溶藻效果

  取适宜条件下培养5d,具有明显溶藻效果的细菌-藻培养液1ml,离心(1000rpm,8min)后收集细胞,加入适量2.5%戊二醛溶液固定,放置过夜;离心(1000rpm,8min)并用无菌水洗涤2到3次;挑取细胞团置于多聚赖氨酸包被的载玻片上,自然干燥后,使用梯度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、100%)进行系列脱水,每个梯度维持6-8min;无水乙醇洗涤后用叔丁醇置换1h;室温稍干燥后置于-80℃预冻1h后置于冻干仪中干燥过夜;喷金后用扫描电镜观察;

  第3章实验结果

  3.1溶藻菌分离及初筛结果

  从3瓶预先观察具有溶藻效应的红球藻培养液(编号为:红A1、A2及US3)中进行初步分离操作,共分离所得4株细菌,分别命名为A1、A21、A22及US3;

  图3.1分离筛选所得4株细菌

  初筛是指筛选与藻细胞共培养出现溶藻效应阳性反应的细菌。将所得4株细菌与雨生红球藻共培养,结果显示4株细菌均出现溶藻现象,尤其以A21细菌和US3细菌溶藻现象最明显;因此将这4株细菌重新进行分离纯化,进一步复筛,更精确地确定溶藻效应;

  3.2溶藻菌复筛分离结果

  3.2.1细菌-红球藻作用结果

  将初筛出现阳性反应的细菌-藻细胞培养液进行进一步分离纯化,获得单克隆;单克隆与藻细胞进行共培养后发现,4株细菌依旧出现不同强弱的溶藻效果,其中以US3菌株的溶藻效果最为强烈(效果如图3.2所示);

  图3.2细菌与红球藻共培养4d结果图

  *注:图中绿色为雨生红球藻;白色即为破裂的藻细胞

  3.2.2溶藻率及虾青素含量计算

  将分别接种了4株细菌培养液的红球藻厚壁孢子培养液分别在20、36、60和96h小时进行了细胞计数,并通过溶藻率计算公式进行计算,从计算的结果及所绘制的图形中发现,A21和US3两株细菌的溶藻效率较高,可以高达52%和48.5%,而另外两株则溶藻效果较差,溶藻率分别为34.4%和37.7%;且从图中(图3.3)也能够观察到,细菌的溶藻率随时间的延长而逐渐变大。因此,接下来的实验均已A21、US3这两株细菌作为研究对象来开展。

  表3.1不同细菌溶藻率计算表

 

  图3.3不同细菌溶藻率变化曲线

  通过紫外分光光度计测算吸光度,再根据虾青素的含量计算经验公式,分别计算出四株细菌处理后的虾青素含量,A21和US3两株细菌处理后虾青素提取量增加为0.149g/mL和0.192g/mL,其相较于对照组(0.117g/mL),含量提升较大,虾青素提取率分别增加了27.132%和63.954%,以US3菌种处理后的虾青素提取率提高最为明显。因此,这两种细菌为简化红球藻虾青素提取方式提供了新的可能。

  表3.2吸光度及虾青素含量

 

  3.3细菌的分离鉴定

  3.3.1细菌基本特征

  通过LB固体培养基多次分离纯化A21,US3细菌,仔细观察单克隆菌落特征,结果见表3.3。同时,对两株细菌进行革兰氏染色实验后,两株细菌在光学显微镜下(100×)均显示为红色,即表明两株细菌均为革兰氏阴性菌。

  表3.3细菌菌落特征

 

  3.3.2生长曲线

  将A21和US3细菌置于适宜条件下进行培养,通过测量600nm下的吸光度值来绘制两株细菌的生长曲线。对A21细菌生长曲线(如图3.4所示)的观察发现,A21细菌的延迟期为4h,对数生长期为16h,之后即进入平衡期;同理,对US3细菌生长曲线(如图3.5所示)的观察发现,US3细菌的延迟期为2h,对数生长期为16h,之后即进入平衡期。

  图

  3.4 A21生长曲线图3.5 US3生长曲线

  3.3.3菌种鉴定及系统发育树

  采用16SrRNA基因测序分析进行菌种鉴定,试验中采用细菌通用引物27F、1492R来扩增目的片段,通过凝胶电泳图显示出A21、US3两株细菌目的片段长度均在1500bp左右;

  图3.6 A21和US3未纯化PCR产物凝胶电泳图

  A21和US3两株细菌均分离自雨生红球藻液体培养基中,经武汉生工测序所得16SrRNA基因序列。将所得细菌序列与已发表的基因序列基因进行比对分析发现,A21细菌属于嗜麦芽寡养单胞菌种,US3细菌属于根瘤菌种,并通过MEGA 7.0软件绘制菌株的系统发育树;

  图3.7 A21细菌基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树

  图3.8 US3细菌基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树

  3.4细菌的作用方式检测结果

  3.4.1细菌的作用方式

  细菌的溶藻效应可以通过多种作用方式来完成,比如此前报道的分泌细菌胞外物分解细胞壁、与藻细胞接触来发挥作用、与藻细胞竞争营养物质等;在本次研究中,分别采用了A21细菌的发酵上清液、细菌菌体、破裂细菌菌体以及纯水对照来探索细菌的主要作用途径。通过与雨生红球藻厚壁孢子共培养,可以发现上清液、菌体以及破碎细胞对应的溶藻率分别为10.22%、30.46%以及14.50%,细菌菌体的溶藻率明显高于其他两组对照,因此可以初步判定A21的发挥作用的主体为细菌菌体本身;

  图3.9 A21菌株溶藻效果图3.10 A21菌株各部分溶藻率

  *注:DZ:纯水对照;A21破:A21破碎菌体细胞;A21上:A21菌体培养液上清液;A21 cell:A21菌体本身

  同时,US3细菌也分别采取相同处理,通过显微观察及计数发现其相对应的溶藻率分别为2.47%、29.53%以及-8.31%,同样,US3细菌菌体溶藻率明显高于上清液及破碎细胞,因此初步判定US3的主要作用主体为细菌菌体本身。

  图3.11 US3菌体溶藻效果图3.12 US3菌株各部分溶藻率

  *注:DZ:纯水对照;US3破:US3破碎菌体细胞;US3上:US3菌体培养液上清液;US3 cell:US3菌体本身

  3.4.2扫描电镜检测

  本研究在已明确细菌菌体为主要作用主体之后,进一步采用扫描电镜去确定细菌的作用方式。在扫描电镜下,A21和US3细菌处理组相较于未处理藻细胞,能够明显观察到溶藻效应(如图3.13);其中能明显观察到A21和US3两种细菌均能够粘附与雨生红球藻细胞壁表面,使细胞壁破裂进而最终杀死藻细胞(如图3.14);同时,扫描电镜下也观察到US3细菌处理组中藻细胞表面吸附的细菌数明显多于A21组,此现象可能是造成US3溶藻效应强于A21细菌的潜在原因,有待进一步去探索。

  图3.13不同处理藻细胞破裂情况

  图3.14雨生红球藻细胞壁破裂情况

  第4章讨论

  4.1溶藻菌菌种鉴定

  4.1.1根瘤菌简介

  根瘤菌(Rhizobia)是一类在环境中广泛分布的革兰氏阴性杆状菌,除可与豆科植物共生,发挥结瘤固氮作用外,还可脱离宿主在土壤中营腐生,同时也可非共生宿主植株中作为内生菌存在。目前,根瘤菌的分类已有1984年的2属4种拓展至如今的14属70多种。

  根瘤菌与微藻的相互作用也逐渐被科研人员发现。唐霞发现根瘤菌与颤藻构成的复合体系能够显著降低原油,此过程中表现出互惠互利的局面,细菌代谢原油促进藻细胞的生长的同时,藻细胞也促进细菌对原油的代谢作用;陈静等发现一株根瘤菌N1能够促进扁藻生长;有研究[30]表明,根瘤菌与莱茵衣藻共培养,二者会出现阶段性互惠现象,促进莱茵衣藻的生长。

  本研究中根瘤菌作为内生菌存在于雨生红球藻之中,具有破壁的作用,在此前并未出现相关报道。本研究中发现,根瘤菌US3能够显著破坏细胞壁,使雨生红球藻细胞壁逐渐破裂,直至使红球藻细胞壁完全溶解,为提取其中虾青素提供便利。

  4.1.2嗜麦芽寡养单胞菌简介

  嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomnas maltophilia)是一类非发酵型需氧革兰氏阴性杆状菌,具有运动能力,最适生长温度为28℃,广泛分布于水、土壤、植物根系、人和动物的体表和消化道内。

  嗜麦芽寡养单胞菌广泛存在于土壤及植物根系中,一直以来认为其没有植物致病性,直到2002年有学者报道称[32]这种细菌是印度水稻“白纹病”的致病菌,才明确其潜在的植物致病性。研究表明[34]嗜麦芽寡养单胞菌具有极强的降解作用,在降解有机农药、污水治理、综合利用固体废弃物等多方面具有广泛作用。

  嗜麦芽寡养单胞菌与藻类等植物的相互作用的报道并不多见,中国学者赵俊斌等[33]从蓝藻爆发的上海市淀山湖表层水体中分离得到一株嗜麦芽寡养单胞菌DHU-28,能够显著降解微囊藻毒素,明显改善水体水华危害;多篇研究报告表明,嗜麦芽寡养单胞菌的相关活性主要与胞外蛋白酶相关,研究人员从嗜麦芽寡养单胞菌CCF0024中分离得到一种单一碱性蛋白酶,具有细胞(Vero细胞)毒性;其可能的作用机制为该蛋白酶能够增加细胞膜系统的通透性,进而使细菌在细胞内扩散,直至最终杀死细胞。本文研究中,该细菌主要通过与雨生红球藻厚壁孢子壁相互作用来发挥溶藻效应,可能嗜麦芽寡养单胞菌释放的蛋白酶作用于红球藻细胞壁,瓦解细胞壁部分结构,以便细菌进入藻细胞内部,进而导致藻细胞最终破裂,以便进一步提取虾青素。

  4.2溶藻菌作用方式的讨论

  溶藻菌溶解藻细胞存在多种作用方式,前面绪论部分已详细叙述,此处不再重复阐明。使用扫描电镜观察雨生红球藻与细菌的状态,可明显观察到,A21和US3两株细菌均主要作用于红球藻表面细胞壁。从两者相互作用中能观察到,两株细菌表现为能够穿透细胞壁,接着进入雨生红球藻内部发挥相关作用,进而使红球藻细胞完全破裂,释放内容物-虾青素。有研究报道过与此相似的作用方式,Maria G C从水华水体中分离得到细菌,细菌能够直接进入铜绿微囊藻内部,将其溶解直至藻细胞完全死亡。推测其作用机制为:细菌可以分泌一种可溶解粘肽层的外毒素与铜绿微囊藻细胞壁表面的特定部位相互作用,随后细菌的纤维蛋白质复合体继续向外延伸,形成一种类似于“桥”的结构,使细菌粘合到细胞壁表面;通过这种“桥”结构,细菌可以较为简便地直接进入藻细胞内部,在细胞的周质空间活动,致使细胞结构逐渐瓦解,细胞壁表面多处出现破裂,细菌最终完全死亡。藻细胞裂解后,细菌快速繁殖以继续感染健康的细胞,如此反复。此种作用方式并不多见。研究至此,US3和A21两株细菌具体的作用方式目前依旧是谜,有待进一步研究发现。

  4.3外界环境对细菌溶藻效果的影响

  4.3.1温度对细菌溶藻效果效率的影响

  温度一直是影响细菌、动植物等各种作用效果的重要因素。在本次研究中,温度也成为影响细菌发挥溶藻效果的因素之一。在实验中发现,若将细菌-藻共培养体系置于15-20℃培养,发现细菌并未表现出明显的溶藻效果;而将细菌置于28-30℃体系中共培养,能明显观察到细菌的溶藻现象。其中可能的原因是:①低温条件下,细菌处于“休眠状态”,体内酶等其他物质活性较低,无法正常发挥自身活性;②低温条件下,细菌分泌的相关物质未达最适温度,无法进行细胞壁连接,进而发挥溶藻效应;③在15-20℃条件下,雨生红球藻厚壁孢子较易分身出动孢子及静孢子,不利于溶藻效应的发挥,而28-30℃较高温度条件下,雨生红球藻厚壁孢子保持原有细胞形态,因此,较高温度(28-30℃)更利于细菌进行溶藻。

  4.3.2不同前处理对细菌溶藻效果效率的影响

  雨生红球藻在培养过程中,光合作用等生理过程较为复杂,无法确保其处于完全无菌状态,因此在进行溶藻实验前需对雨生红球藻进行相关前处理以保证试验体系的无菌状态。在前处理后需用液体重新悬浮红球藻,其中主要分为滤过除菌后的原培养基以及无菌水两种。在实验过程发现,两种悬浮液体对细菌溶藻效果具有不同的影响。在实验中,无菌水悬浮的红球藻除少数藻种分身出动孢子外,均表现出良好的溶藻效果,而滤过除菌的原培养基悬浮的红球藻未见明显溶藻现象。由此,我们推测在雨生红球藻培养过程中,会产生一种或多种多糖或其他物质分泌至BG11培养基中,此类物质能够明显抑制细菌的溶藻效果,帮助红球藻的正常生长。目前,现研究阶段尚不能明确此类物质成分及作用机制,有待于进一步探索发现。

  4.3.3雨生红球藻的不同形态对细菌溶藻效果的影响

  正如绪论部分所述,雨生红球藻生活史复杂,具有多种形态。在本次研究中,采用动孢子、静孢子及厚壁孢子3种形态的红球藻细胞作为实验对象,发现动孢子几乎没有什么溶藻效果,而静孢子相较于厚壁孢子具有更好的溶藻的效果(静孢子的溶藻效率可达50%,而厚壁孢子仅有30%),因此三者的溶藻效果顺序为:静孢子>厚壁孢子>动孢子(见图4.1)。其潜在的作用机制可能为:本研究中发现的两株细菌都是主要通过吸附于细胞壁来发挥作用,动孢子处于游动状态,不利于A21和US3细菌吸附细胞壁进而发挥作用,因此细菌对动孢子几乎没有溶藻效果;研究人员发现,随着不动细胞体积的增大,除少数细胞残留原有细胞壁外,多数细胞不在保留原有的细胞壁及周质空间,变为增厚的新壁,因而厚壁孢子壁具有成分更复杂,厚度较厚等特点。因此虽静孢子与厚壁孢子均处于静止状态,

  (*注:图1:游动细胞;图2:静孢子;图3:厚壁孢子)但静孢子的细胞壁成分更为简单,且厚度较薄,因此其溶藻效果会更好。

  图4.1各细胞状态的溶解情况(US3细菌)

  4.3.4雨生红球藻不同藻种对细菌溶藻效果的影响

  雨生红球藻具有形态多样、种类繁多的特点,不同的雨生红球藻藻种因而也具有不同的溶藻特性。在实验中,采用了2种红球藻藻种(NH2、US3)来进行相关操作。在试验中发现,US3藻株出现明显溶藻现象,而NH2藻株的溶藻现象却不尽如人意。两株雨生红球藻均经过相同的处理,并结合细菌主要作用于细胞壁的推论,初步可推断不同的雨生红球藻厚壁孢子壁的成分不尽相同,或厚度不一。在试验中发现,生长迅速的藻株(NH2藻株)的溶藻效果却不尽如人意,因此在今后的实验研究中,可以探索厚壁孢子壁中厚度或成分等相关因素对于细菌溶藻效应的影响,进而选定细菌-藻种组合体,实现溶藻效果及雨生红球藻细胞工业培养的最优组合。

  第5章结论

  本研究从3株雨生红球藻培养液中共分离得到4株细菌,将它们分别命名为A1、A21、A22和US3,经过初筛及复筛,发现A21、US3细菌溶藻效率较好,因此选定这两株细菌为研究对象;

  在复筛时,A21的溶藻效率为52.0%,虾青素提取率提高率为27.132%;US3细菌的溶藻效率为48.5%,虾青素提取率提高率为63.954%,由此可见这两种细菌或为高效提取雨生红球藻中虾青素提供新思路;

  通过各项检测发现,A21细菌单菌落为中等大小、浅黄色圆菌落,16SrRNA基因测序分析结果显示其属于嗜麦芽寡养单胞菌属;US3细菌单菌落为中等大小、乳白色规则圆菌落,16SrRNA基因检测分析结果显示其属于根瘤菌属;

  采用细菌发酵上清液、细菌菌体和破碎细胞作为研究对象,发现A21细菌和US3细菌的作用主体均为细菌菌体,其溶藻率明显高于另两种研究对象;通过扫描电镜下观察发现,A21和US3细菌主要作用于雨生红球藻厚壁孢子的细胞壁,进而使细菌细胞壁破裂;

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