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药学类论文 儿童肺炎链球菌对青霉素耐药性的研究

2018-11-29 15:00:42来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要

  背景:肺炎链球菌(Stf-eptococcuspneumoniae,S.peumoniae,SP)是人体鼻咽部的正常菌群,是引起呼吸道感染的主要致病菌,也是导致5岁以下儿童生病住院和死亡的重要原因,给家庭和社会均造成了极大的负担。近年来,在抗生素的选择压力下,肺炎链球菌对青霉素和大环内酷类抗生素的耐药率呈现迅速增长的趋势。此外,多重耐药菌株的出现和流行使全球控制SP感染的形势更为严峻。而国际流行耐药(Pneumococcal Molecular Epidemiology Network,PMEN)克隆株的传播是肺炎链球菌耐药率增加和多重耐药菌株流行的主要原因。

  目的:了解2012-2013年苏州地区呼吸道感染住院患儿肺炎链球菌分离株的耐药谱和耐药模式,分析苏州地区儿童肺炎链球菌的耐药现状,以期指导临床合理用药。

  方法:采用Kirby-Bauer纸片扩散试验和E-test法对收集到的2053株肺炎链球菌分离株进行敏感性试验。

  结果:肺炎链球菌对红霉素和克林霉素不敏感率分别高达99.7%和98.2%;对青霉素、阿莫西林、头抱唾肪和头抱曲松等4种p内酞胺类抗生素的不敏感分别为32.7%,36.6%,48.5%和51.1%;对左氧氟沙星、莫西沙星等非常规抗生素的不敏感率很低。肺炎链球菌对p内酞胺类抗生素存在交叉耐药。与<<2岁患儿相比,2-5岁患儿肺炎链球菌对p内酞胺类抗生素的不敏感率更高(OR:1.267,95%CI:1.051-1.526)。肺炎链球菌的多重耐药率高达98.3%,耐药模式主要为红霉素+p内酞胺类抗生素十复方新诺明+克林霉素+四环素。

  结论:苏州地区儿童肺炎链球菌的耐药情况非常严重,且呈多重耐药模式。

  本研究结果对临床治疗肺炎链球菌疾病和抗生素的选择具有参考价值,且提示临床需合理使用抗生素。

  关键词:肺炎链球菌、青霉素耐药性、儿童

  1 前言

  1.1 研究背景

  急性呼吸道感染是婴幼儿时期的常见病、多发病,严重威胁婴幼儿的健康。急性呼吸道感染分为急性上呼吸道感染(Acute Upper Respiratory Infections,AURI)和急性下呼吸道感染(Acute Lower Respiratory Infections,ALRI),前者包括急性鼻咽炎、急性扁桃体炎等,后者主要包括肺炎、支气管炎等。急性呼吸道感染是S岁以下儿童住院与门诊就医的主要原因,给家庭和社会带来了严重的负担。我国报道的因急性呼吸道感染住院的患儿占儿科住院患儿的24.5%-65.2%。据世界卫生组织(WHO)统计,全世界每年约有200万5岁以下儿童死于肺炎,占该人群总死亡率的I9%。自上世纪70年以来,肺炎也一直是我国5岁以下儿童的首位死因。据估计,我国每年5岁以下儿童因肺炎死亡者约35万人,占全世界儿童肺炎死亡的10%。因此,有效的控制儿童呼吸道感染对降低婴幼儿死亡率、减轻疾病负担具有重要意义。

  为了降低婴幼儿急性呼吸道感染的发病率和病死率,明确其致病病原体尤为重要。目前认为主要的病原体包括细菌与病毒,其余还包括支原体、衣原体等。

  细菌病原包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和金黄色葡萄球菌等;病毒病原则主要为流感病毒(InfluenzaA,B)、呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus RSV)和副流感病毒(Parainfluenza1,2and3)。对于婴幼儿急性呼吸道感染的病原学较一致的看法是发展中国家以细菌病原为主,而发达国家以病毒病原为主。不同的细菌和病毒导致的疾病的种类、临床症状、病程和预后都不尽相同,因此选择合适的治疗方法是十分必要的。目前临床上对大多数急性呼吸道感染患儿常以抗生素作为治疗的首选药,虽确信其弊端,但因无相应的病原学检测资料,造成了抗生素的滥用。因此快速而准确的检测出病原体十分重要。

  肺炎链球菌作为急性呼吸道感染主要的条件致病菌,在侵袭性疾病发生之前,其携带状态就己很普遍。不同的城市和社区间的肺炎链球菌的携带率在14%至92%之间。肺炎链球菌引起的疾病有肺炎、支气管炎、支气管肺炎、中耳炎、脑膜炎和败血症等。在引入7价肺炎链球菌疫苗Prevenar之前,美国5岁以下儿童中每年侵袭性肺炎链球菌发病率约为96/10万,在2岁以下儿童中发病率更高。1982-1985年由全国18个省市29个单位组成的协作组与WHO合作进行的一项“引起严重感染的肺炎链球菌荚膜型的监测”的流行病学研究中,共收集10446例细菌性肺炎、脑膜炎和中耳炎病例,其中有482例经培养证实是由肺炎链球菌引起的,其中40%-73%的肺炎链球菌感染发生在婴幼儿和3岁以下的儿童。

  肺炎链球菌感染的死亡率很高,尤其是在发展中国家。在世界范围内,每年由于肺炎链球菌感染引起的死亡人数占总死亡人数的9%,在发展中国家每年可引起100万以上的婴儿死亡。1982-1985的流行病学研究发现,482例由肺炎链球菌引起的感染中,肺炎链球菌性肺炎的病死率为16.4%。1岁以下的婴幼儿的病死率更是高达28.6%。肺炎链球菌的高携带率、高致病率和高病死率导致肺炎链球菌相关疾病对人类的危害非常严重,尤其在免疫力低下的婴幼儿、老年人和免疫缺陷病人中。因此肺炎链球菌已经引起了世界的高度关注。

  肺炎链球菌显微镜下观察时多数为矛头状,直径约0.5-1.5微米,成双排列时,钝端相对,尖端相背。无鞭毛、无芽饱,在机体内形成荚膜,经人工培养后逐渐消失,革兰染色阳性。肺炎链球菌营养要求高,在含血液或血清的培养基上才能生长,兼性厌氧菌,在10%二氧化碳环境中生长良好。在血平板上培养18-24小时后,形成灰白、半透明、扁平、表面光滑、湿润、边缘整齐的菌落,周围有。

  型溶血圈。随着培养时间的延长,有些菌株发生自溶而使其菌落中心凹陷呈脐窝状。本研究即选用哥伦比亚选择性血琼脂、5%二氧化碳培养箱18-24小时培养。

  关于肺炎链球菌的鉴定,首先要根据上述培养后的菌落特征初步判定,然后进一步作奥普托辛敏感试验和/或胆汁溶菌试验。其中胆汁溶菌试验结合奥普托辛敏感试验是较为可靠的鉴别法。本研究即是根据菌落形态,采用革兰染色显微镜下观察、胆汁溶菌试验结合奥普托辛敏感试验来鉴定肺炎链球菌。

  影响肺炎链球菌携带的危险因素可能有年龄、入托、非母乳喂养、反复的呼吸道感染、抗生素的使用情况、父母亲吸烟、同胞的年龄及数量和过于拥挤的生活环境等。本研究对所有的患儿进行了统一的问卷调查,问卷内容包括患儿的基本情况、本次入院情况、入院前抗生素使用、既往病史、家庭状况及母亲怀孕情况及社会学情况(教育、职业等)等,通过统计分析,我们可以建立相应的关于携带肺炎链球菌的影响因素的假设。

  第二次世界大战后,由于青霉素的广泛应用,人们对于肺炎链球菌的关注逐渐减少,然而进入20世纪90年代以来,由于在发展中国家由此种细菌引起的高死亡率、在HIV感染病人中此种细菌的高携带率。以及肺炎链球菌耐药菌株在全世界范围的出现和持续增长,使其再度引起人们的高度关注。

  自1967年Hansman等首先报道了从澳大利亚一个低丙种球蛋白血症支气管扩张症患者痰液中分离出耐青霉素肺炎链球菌后,I977年从南非儿童感染病房中分离到对青霉素耐药的菌株,并对其他多种抗生素同时耐药。目前耐药性肺炎链球菌已经遍布世界各地。Alexander耐药监测结果显示,1992到1997肺炎链球菌对青霉素耐药率逐渐上升。亚洲地区耐药程度更为严重,对青霉素的耐药率均高达40%以上。国内报道肺炎链球菌对青霉素的不敏感率达39.9%,对头抱吠辛耐药率为19.0%。与此同时,肺炎链球菌对大环内酷类(主要是红霉素)、四环素、克林霉素等的耐药率也逐步上升,表现出多重耐药的趋势。肺炎链球菌对常用抗生素的耐药率在不同国家和地区是不同的。本研究对苏州儿童医院呼吸道感染住院患儿痰标本中肺炎链球菌阳性细菌作了9种抗生素(苯哇青霉素、红霉素、克林霉素、四环素、复方新诺明、氧氟沙星、氯霉素、万古霉素、利福平)K-B纸片法药敏试验,5种抗生素(青霉素G、红霉素、阿莫西林、头抱吠辛、头抱曲松)的E-test药敏试验,以了解该地区致病性肺炎链球菌的抗生素耐药现状。

  由于肺炎链球菌对p一内酞胺类药物的耐药逐年增加,再加上大环内}a类药物对非典型病原体也有效,毒副作用小,价格低廉,因此大环内醋类抗生素被广泛应用于肺炎链球菌疾病的治疗。但是自1952年第一个大环内酷类抗生素红霉素应用于临床以来,1967年美国首先发现对红霉素耐药的肺炎链球菌,随后大环内酷类耐药成为一个全球性问题,尤其是中国乃至亚洲许多国家和地区的肺炎链球菌对大环内酷类抗生素耐药情况最为严重,且表现出对四环素、复方磺胺、氯霉素、青霉素等的多重耐药,给临床选择药物带来了很大的困难,引起了医学界的广泛关注。耐大环内酷类肺炎链球菌(Macrolide Resistant Streptococcus Pneumoniae}MRSP)己取代青霉素耐药肺炎链球菌(Penicillin Resistant Streptococcus Pneumoniae}PRSP)成为我国肺炎链球菌感染最为严重的问题,对MRSP耐药状况和耐药机制的准确掌握是有效治疗临床肺炎链球菌感染、控制耐药性播散的前提和基础,因此迫切需要对MRSP进行深入的研究。

  肺炎链球菌对大环内酷类抗生素耐药的机制主要为。erm基因介导的核糖体靶位改变、mef基因介导的主动外排系统和核糖体蛋白突变3种。erm基因编码的核糖体甲基化酶,可使位于肺炎链球菌核糖体的SOS大亚基的23SrRNA的v区的A2058位点的腺嚓吟残基N-6位二甲基化,从而使大环内醋类抗生素与核糖体作用位点的亲和力显著下降而产生耐药。由于林可霉素((lincosamide}L)、链阳性菌素复合物(streptogramin B,:SB)、大环内酷类(macrolide,M)三类抗生素与细菌rRNA的结合位点存在较大的重叠区域且关键位点均为A2058,因此erm基因可以引起林可霉素一大环内酩类一链阳性菌素复合物联合耐药,成为MLSb耐药表型。erm基因介导的MLSb耐药表型分为结构型(constitutive,cMLSb)和诱导型(inducible,iMLSb)两种。结构型表现为对14元环、15元环、16元环大环内酷类、林可霉素和链阳性菌素B均耐药,为高水平耐药(红霉素MIC>64mg几)。而诱导型表现为低水平耐药(红霉素MIC在1^'32mg/L)。me湛因及其编码的外排泵膜相关蛋白构成外排不.可以将进入细胞内的大补内酷夹抗生素泵出细胞外而产生耐鱿,只有I4环、15环、16环内酷类抗生素可以激活外排泵。这种机制介导产生M型耐药,属于低水平耐药(红霉素MIC≥32mg/L)。临床上可以通过增加大环内酷抗生素的剂量来克服耐药。编码核糖体蛋白L4,L22的基因突变也可导致肺炎链球菌对大环内酷类的耐药。L4核糖体蛋白发生改变导致大环内酷类抗生素的结合位点远离该通道而失效。而L22核糖体蛋白通过点突变能扩大多肚通道,通过无效的方式结合大环内酷类抗生素而导致耐药0不同的耐药机制不仅导致不同的耐药表型,而且其分布也存在明显的地区差异。在中国香港、新加坡、泰国、马来西亚,以mefA基因介导的主动外排机制最为常见,而在中国台湾、斯里兰卡、韩国、越南,由。rmB基因介导的核糖体靶位改变和/或mefA基因介导的主动外排机制是主要的耐药机制。中国温州、烟台和上海的研究均显示ermB基因介导的核糖体靶位改变可能是我国肺炎链球菌对大环内酷类抗生素耐药的主要机制。由核糖体突变导致耐药的肺炎链球菌约占临床耐药菌株的2%左右,在加拿大、欧洲、北美等地均发现此类菌株,国内目前只有2例报道。因此本研究采用PCR对临床分离肺炎链球菌进行ermB基因和m啊基因的检测,了解对大环内酷类抗生素耐药的机制,有利于指导临床治疗。

  肺炎链球菌对大环内酷类抗生素耐药性的主要传播方式有:①水平传播:耐药基因经转化、转导或接合转座子接合转移给敏感菌。耐药基因可来自耐药性肺炎链球菌或其它相同或不同种属细菌,可以在不同国家和地区独立进化而来,因而其遗传背景是不同的。②克隆传播:通过旅游、接触等途径,一些高耐药克隆株在不同国家和地区播散,形成世界范围内的对大环内醋类耐药的传播。因而同一耐药克隆株具有相同的血清型、药敏谱和遗传背景。西班牙克隆株(血清型23F)对氯霉素、四环素耐药,且75%菌株对大环内酷类抗生素耐药,在北美、欧洲、亚洲、拉丁美洲和南非均有发现。目前认为耐药株克隆传播可能是亚洲地区红霉素耐药率迅速增加的主要原因之一。要区分耐药性的克隆传播和水平基因传播,了解耐药克隆的遗传背景,追踪耐药株的起源和进化路径,必须借助于分子生物学方法。目前常用的方法有青霉素结合蛋白基因DNA指纹、BOX-PCR、核糖体分型、脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)、限制性片段末端标记(Restriction Fragment End Labeling,RFEL)、多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing,MLST)等。

  MLST是直接对肺炎链球菌7个看家基因(House-keepinggene)的内部片段的核酸序列进行测序,并利用计算机通过基因库比较序列的每一位点与己知等位基因的差异,将每一组不同的等位基因的排列组合作为一个基因型构成等位基因图谱(Allelespro file),每个独特的基因型就对应了一个序列型(Sequence Typing,STs),并且通过比较ST可以发现菌株的相关性,即密切相关菌株具有相同的ST或仅有极个别基因座不同的ST,而不相关菌株的ST至少有3个或3个以上基因座不同。该方法通过实验方法的标准化,利用互联网和生物信息学技术,实现了在互联网上的比较,克服了传统的分子流行病学方法(如PFGE,BOX-PCR等)实验数据不能进行实验室间比较的缺点,迅速得出结论,为细菌流行病学和分子进化研究提供了有力手段。目前认为该方法是肺炎链球菌分子分型的金标准本研究即采用该方法,对临床分离的MRSP菌株进行分型,了解耐药克隆的遗传背景,追踪耐药株的起源和进化路径。

  1.2 研究目的

  了解住院患儿呼吸道感染的病原学及其影响因素,分析肺炎链球菌的耐药情况以及耐药性的传播模式,为有效降低呼吸道感染,尤其是耐药肺炎链球菌感染导致的发病和死亡提供科学依据。具体研究目的有

  (1)进行以医院为基础的为期一年的岁以下儿童呼吸道感染的监测,获取现场调查资料,采集生物标本,分析儿童呼吸道感染的病原学及其影响因素。

  (2)分析肺炎链球菌携带的危险因素,对监测期间收集的肺炎链球菌菌株进行耐药分析,分析菌株的多重耐药模式,并根据肺炎链球菌对抗生素的敏感性的不同,将抗生素进行聚类分析,方便临床选择合适的药物,

  (3)研究耐大环内酷类抗生素肺炎链球菌的耐药表型和耐药基因型,并分析两者的关系,同时结合流行病学资料,运用了解耐药菌株的传播方式,追踪耐药株的起源和进化路径。

  2呼吸道感染儿童肺炎链巧菌的耐药性研究

  抗生素是临床上治疗肺炎链球菌疾病(Pneumococeal diseases,PD)的首选药物。但近年来,在抗生素的选择压力下,肺炎链球菌((Streptococcus pneumonia,SP)对青霉素和大环内醋类抗生素的耐药率呈现迅速增长的趋势。此外,多重耐药菌株的出现和流行使全球控制SP感染的形势更为严峻。由于SP分离株对抗生素的耐药谱呈现人群和地区性差异,因此本研究对2053例RI住院患儿的SP分离株进行耐药性分析,了解苏州地区2012-2013年临床SP分离株的耐药模式,为该地区临床合理用药提供科学依据。

  2.1对象与方法

  2.1.1研巧对象

  从2012年1月到2013年12月,因呼吸道感染住院的5岁以下儿童,且其痰液细菌培养为肺炎链球菌阳性。

  2.1.2实验仪器和试剂

  (1)细菌比浊仪

  (2)C02培养箱:TEL<811)4181日本东京

  (3)低温冰箱:REVCOULY2186-3V

  (4)接种环、酒精灯、试管、镊子、一次性平板等

  (5)085%NaCI

  (6)药敏培养基

  在烧瓶中加入蒸馏水100m1,称取MH琼脂(英国Oxoid公司产品)3028加入蒸馏水,将PH值调至72-74,高压灭菌(121C,15分钟)后。冷却至500C,无菌操作方式加入5%无菌脱纤维羊血,摇匀,倾注无菌平板,厚度为40士OSmm,随机选择平板做无菌试验,合格者置4℃冰箱备用。

  (7)肺炎锌球菌标准菌株ATCC49619,华山抗生素研究所药敏纸片:利福平Swg/ml。英国Oxoid公司产品E-test纸条青霉素G,浓度为001-256μg/ml;头抱唆肪,浓度为0016-256μg/ml;阿莫西林,浓度为0016-256μg/ml;头抱曲松,浓度为0016-256μg/ml;红霉素,浓度为0016-256μg/ml;克林霉素,浓度为0016-256μg/m1;氯霉素,浓度为0016-256μg/m1;0016-256μg/ml;0016-256μg/ml;复方新诺明,浓度为0016-256μg/ml;四环素莫西沙星,浓度为0016-2565,μg/ml;左氧氟沙星万古霉素,浓度为0016-256μg/ml。

  2.1.3实验方法

  (1)Kirby-Bauer纸片扩散试验

  挑取肺炎链球菌菌落密涂于MH血平板,用无菌镊子取抗生素纸片贴于上面,置于370C02培养箱培养,20-24h后观察结果。结果判定按照2011年临床实验室标准化研究所(Clinicaland Laboratory Standards Institute,CLSI)(见表2-1)。该试验在苏州大学附属儿童医院检验科完成。

  表2-1肺炎链球菌抗生素K-B法敏感试验判读点

  (2)E-test最小抑菌浓度(Minimal Inhibition Concentration,MIC)的测定。

  (1)制备0.5麦氏浓度肺炎链球菌悬液:用接种环挑取肺炎链球菌纯培养物,沿盛有0.85%NaCI溶液的试管壁研磨,麦氏比浊仪比浊,使其浓度为0.5麦氏;

  (2)用无菌棉签蘸取细菌悬液,密涂于MH血平板,平板放置10-15分钟,使水分充分吸收;

  (3)E-test纸条在30分钟前从·20℃冰箱取出,用无菌镊子夹取E-test纸条从低浓度端开始放置于MH血平板上,避免在纸条下产生气泡。370CCO:培养箱培养,20-24h后观察结果;(4)结果读取:抑菌圈和纸条交界处的数值为MIC;(5)判读标准:按照2011年CLSI的标准确定药敏结果(见表2-2)。

  表2-2肺炎链球菌抗生素E-test法敏感试验判读标准

  2.1.3统汁学处理

  应用SPSS16.0进行数据的统计学分析。采用卡方检验、Fisher精确概率法对分类数据的分布进行统计学检验,肺炎链球菌抗生素耐药的影响因素通过非条件Logistic回归模型进行分析,P<0.05可认为差异有统计学意义。

  2.2结果

  2.2.1 RI住院儿童肺炎链球菌的抗生素耐药率

  本研究检测了肺炎链球菌对13种抗生素的敏感性(见表2-3。结果发现,菌株对红霉素、克林霉素、四环素和复方新诺明的不敏感率分别高达99.7%,98.2%.94.1%和92.9%。菌株对青霉素G的不敏感率为32.7%(耐药率仅为4.6%)。肺炎链球菌对阿莫西林、头抱唆肪、头抱曲松等其他p内酞胺类抗生素的不敏感率依次为35.8%,48.3%和50.0%。菌株对其他抗生素,如万古霉素、左氧氟沙星、莫西沙星等的不敏感率则非常低。

  表2-32053例肺炎链球菌菌株的抗生素耐药性分析

  注;a.不敏感率包括耐药(R)率和中介(I)率。

  根据聚类分析结果,可将本研究中的13种抗生素可分为三类:①高度敏感

  类:包括氯霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、万古霉素和利福平;②中度敏感类:

  p内酞胺类抗生素,包括头抱曝肪、头抱曲松、青霉素G和阿莫西林;③高度耐药类:复方新诺明、克林霉素、红霉素和四环素。

  

  图2-1RI住院儿童其肺炎链球菌对抗生素耐药的聚类分析树状图

  注:1:红霉素;2:青霉素G;3:阿莫西林;4:头抱唾肪;5:头抱曲松:6:复方新诺明;7:克林霉素:8:四环素;9:氯霉素;10:利福平;I1:万古霉素:12:左氧氟沙星;13:莫西沙星。

  2.2.2肺炎链球菌对p内酞胺类抗生素和其他抗生素的交叉耐药性

  在本研究中,肺炎链球菌对青霉素G的不敏感率为32.7%(672/2053)。将肺炎链球菌分为青霉素敏感株(Penicillin Susceptible Streptococcu sPneumoniae,PSSP)和青霉素不敏感株(Penicillin Non-Susceptible. Streptococcus Pneumoniae,PNSSP),以分析菌株对青霉素G和其他p内酞胺类抗生素的交叉耐药。结果发现,PNSSP对阿莫西林、头抱曝脂、头抱曲松等其他p内酞胺类抗生素的不敏感率分别为81.6%,87.9%和82.9%,显著高于PSSP的14.9%,29.2%和32.1%}说明p内酞胺类抗生素之间存在交叉耐药(见表2-4)。此外,PSSP和PNSSP对其他抗生素的多重耐药模式也不同(才=348.02}P<0.001)。

  同样,将肺炎链球菌菌株分为p内酞胺类抗生素敏感株((3-lactams Susceptible Streptococcus Pneumoniae,(3SSP)与p内酞胺类抗生素不敏感株(p-lactams Non-Susceptible Streptococcus Pneumoniae, pNSSP,以分析菌株对p内酞胺类抗生素敏感性不同对其他抗生素的耐药情况。结果发现,与pNSSP相比,pSSP对复方新诺明、四环素的不敏感率更高,且两者差异有统计学意义(表2-5)。

  表2-4肺炎链球菌β内酰胺类抗生素的交叉耐药性情况

  表2-5β内酰胺类抗生素(βSSP)与不敏感族(βNSSP)对其他抗生素耐药性情况

  2.2.3肺炎链球菌对抗生素耐药的影响因素

  由于本研究中肺炎链球菌对红霉素、克林霉素、复方新诺明和四环素高度耐药,对万古霉素、氯霉素、左氧氟沙星、莫西沙星和利福平高度敏感,因此本研究只分析肺炎链球菌对p内酞胺类抗生素耐药的影响因素。如表2-6所示,Logistic单因素和多因素回归模型分析均提示年龄是p内酞胺类抗生素耐药的影响因素,即与<2岁患儿相比,2-5岁患儿分离的肺炎链球菌菌株对p内酞胺类抗生素的耐药率更高(多因素结果OR: 1.267, 95%CI:1.051-1.526 )。

  表2-6 肺炎链球菌对β内酰胺类抗生素的耐药性的影响因素分析

  2.2.4 肺炎链球菌的耐药谱和多重耐药情况

  本研究共包括9种抗生素:大环内酷类(红霉素);p内酞胺类(青霉素G.阿莫西林、头抱唆肪、头抱曲松);磺胺类(复方新诺明);哇诺酮类(左氧氟沙星、莫西沙星);糖肤类(万古霉素);林可酞胺类(克林霉素);四环素类(四环素);酞胺醇类(氯霉素);利福霉素类(利福平)。在从RI住院儿童分离的2053例肺炎链球菌菌株中,仅有1株(0.05%)菌株对13种抗生素均表现敏感,33株菌株(1.61%)对一类或两类抗生素耐药(表2-7)。多重耐药是指细菌对三种及以上作用机制不同的抗菌药物产生的耐药性。在本研究中,2019株(98.3%)菌株至少对三类抗生素耐药,即表现为多重耐药(表2-7)0 2012年分离的肺炎链球菌的多重耐药率显著高于2013年(99.3%vs. 97.5%,犷=9.99 } P=0.002 )但是不同年龄、性别、疾病种类和不同季节入院的儿童其肺炎链球菌的多重耐药率无显著差异(P>0.05 ) a所有多重耐药菌株共表现出25种耐药模式,其中红霉素十p内酞胺类抗生素+复方新诺明+克林霉素+四环素和红霉素+复方新诺明+克林霉素十四环素为最主要的两种耐药模式,分别占所有肺炎链球菌菌株的48.9%和31.6%。

  表2-7 2053例肺炎链球菌菌株的耐药模式

  注:a.ERY:红霉素;p:p内酞胺类抗生素;CMZ:复方新诺明;CLI:克林霉素;TCY:四环素:LEV:左氧氟沙星;CHL:氯霉素;VAN:万古霉素;RFP:利福平;b.耐药包括中介(I)和耐药(R)o

  2.3讨论

  本研究收集了2053例RI住院患儿的肺炎链球菌分离株,采用K-B纸片扩散法和E-test法检测肺炎链球菌对9类13种抗生素的耐药性,结果显示菌株对抗生素的耐药可分为以下三种情况:(1)高度耐药:红霉素、克林霉素、四环素和复方新诺明。菌株对上述四种抗生素的不敏感率分别高达99.7%,98.2%,94.1%和92.9%;(2)中度敏感类:p内酞胺类抗生素,即青霉素G、阿莫西林、头抱嚓肪和头抱曲松,菌株对上述四种抗生素的不敏感率分别为32.7%,36.6%,48.5%和X1.1%;(3)高度敏感类:左氧氟沙星、莫西沙星、氯霉素、万古霉素和利福平,菌株对上述五种抗生素的不敏感率为0.0%-7.0%。以上结果提示,红霉素等4种抗生素己不适用于临床治疗肺炎链球菌疾病。而肺炎链球菌对左氧氟沙星等5种抗生素表现出高度敏感,推测该情况可能源于这5种抗生素并非临床治疗肺炎链球菌感染的常用药物,因此菌株所承受的抗生素压力较小,发生耐药的几率变小。

  肺炎链球菌对大环内酷类抗生素的耐药率在发达国家(欧美)和发展中国家之间存在较大的差距。对于欧美发达国家,肺炎链球菌对红霉素的耐药率较低,且近年来呈现下降趋势。Mayanskiy等报道2009-2013年俄罗斯莫斯科儿童医院分离的非侵袭性肺炎链球菌菌株对红霉素的耐药率为26%。Demczuk报道加拿大侵袭性菌株对克拉霉素的耐药率为23.0%。Siira等报道2007-2011年芬兰侵袭性菌株对红霉素的不敏感率为26.6%,各年为23.2%-28.9%不等。

  SENTRY耐药检测项目调查美国1998-2011年肺炎链球菌的耐药趋势,发现菌株对红霉素的耐药率从1998年的82.2%下降到2011年的55.2%。Henderson等发现英格兰和威尔士分离的侵袭株对红霉素的耐药率从2006年的26%迅速降至2009年的3%。然而在亚洲地区和其他发展中国家,肺炎链球菌对红霉素的耐药率却非常高。亚洲耐药病菌监测网(Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens,ANSRP)分析发现,亚洲地区11个国家的红霉素耐药率总体为72.7%,其中6个国家的红霉素耐药率在70%以上,依次为中国(96.4%),台湾(84.9%)、越南(80.7%)、斯里兰卡(79.9%)、韩国(77.7%)和香港(75.5%)。近年来,中国大陆地区的肺炎链球菌分离株对红霉素的耐药情况一直较为严重,而且耐药率呈现上升趋势。Yu分析发现2000-2005年北京市呼吸道感染儿童的红霉素的耐药率从87.5%增长至2005年94.0%。Liu调查上海、武汉、南京等8个城市的肺炎链球菌耐药情况,发现红霉素的耐药率达95.1%,而侵袭株的耐药率更高,达%.6%且MIC50>256μg/ml。而在苏州地区,2006-2007年3岁以下儿童肺炎链球菌分离株对红霉素的耐药率为100.0%结合本研究的红霉素耐药结果(99.7%),可说明苏州地区的肺炎链球菌分离株基本为耐大环内H类菌株。

  肺炎链球菌曾对青霉素普遍敏感,但是自20世纪90年代开始,耐青霉素肺炎链球菌开始在全球范围内流行和传播。PROTEKT研究分析了1999-2003年全球39个国家的肺炎链球菌分离株的耐药情况,发现4年青霉素不敏感率为31.6%-37.9%,但各国的差异较大,其中香港、韩国和台湾等亚洲国家的青霉素耐药率最高,为58.0%-65.7%。2008年CLSI公布了新的青霉素的MIC判读标准,提高了青霉素耐药的MIC限制:2008年以前青霉素敏感、中介和耐药的MIC标准分别为<0.064μg/ml,0.12-1μ.g/ml和12μg/ml,2008年开始青霉素敏感、中介和耐药的MIC标准分别修改为<2.0μg/ml,4.0μg/ml和>_8.0μg/ml。即使在新的CLSI标准下,肺炎链球菌对青霉素以及其他日内酸胺类抗生素的耐药性在全球范围内仍然呈现增长趋势。AWARE研究显示,美国2009-2011年肺炎链球菌对青霉素的不敏感率从21.9%增长到24.3%。Demczuk报道2007-2011年芬兰的青霉素不敏感率从14.4%增长到23.2%a2006-2007年苏州地区儿童肺炎链球菌对青霉素的不敏感率为60.5%,但是按照2011年CLSI标准,其青霉素不敏感率仅为4.0%。本研究的耐药性分析显示,在相同的CLSI标准下,2012-2013年苏州地区5岁以下儿童的分离株对青霉素、阿莫西林和头抱曲松的不敏感率均明显高于2006-2007年的相应数据提示近年来苏州地区的儿童分离株对p内酞胺类抗生素的不敏感率在不断增长。而且,在本研究中,菌株对几种p内酞胺类抗生素不敏感率也要高于国内其他类似研究的数据。本研究菌株对本研究发现,年龄是影响p内酞胺类抗生素耐药的主要因素,即肺炎链球菌对p内酞胺类抗生素耐药的不敏感率均随着患儿年龄的增长而增加,推测这种情况可能是由于年长儿童抗生素使用剂量较大所致。

  肺炎链球菌对p内酞胺类抗生素(尤其是青霉素)的耐药机制主要依靠改变细菌壁青霉素结合蛋白(Penicillin-binding proteins,PBPs)的结构,降低了p内酞胺类抗生素对肺炎链球菌的亲合力,使p内酞胺类抗生素对肺炎链球菌的MICs升高,从而导致菌株对抗生素的耐药。肺炎链球菌有6个PBPs,其中PBPIa.PBPIb,PBP2x,PBP2a和PBP2b为高分子量的蛋白质,PBP3为低分子量的蛋白质。一般来说,肺炎链球菌对青霉素的耐药是由PBPIa,PBP2x,PBP2b三种基因介导的,其中PBP2x和PBP2b的亲和力下降导致低水平的青霉素耐药,PBPIa的亲和力下降见于高水平的青霉素耐药。但是单独PBPs基因介导的耐药一般为低水平耐药,而多种PBPs基因联合介导的耐药才为高水平耐药。本研究中青霉素不敏感率为32.7%,但是耐药率仅为4.6%,中介率为28.1%,说明大部分青霉素不敏感株为低度耐药,但是青霉素不敏感率增加的情况以及p内酞胺类抗生素间的交叉耐药问题仍然值得重视。

  多重耐药是指菌株同时对三种及三种以上不同种类的抗生素耐药。虽然多重耐药菌株的出现和流行己成为国际关注问题,但是亚洲地区的多重耐药情况则更为严重。ANSRP研究显示,亚洲地区肺炎链球菌的多重耐药率为59.2%其中中国、越南、韩国、香港和台湾的多重耐药率较高,分别为83.3%.75.5%.63.9%.62.2%和59.7%。然而,我国的耐药监测研究显示,国内的多重耐药率其实更高,达90.0%。本研究结果显示,苏州地区儿童肺炎链球菌非侵袭株的多重耐药率高达98.3%,耐药模式主要为红霉素+内酞胺类抗生素+复方新诺明+克林霉素+四环素。虽然本研究中的多重耐药率低于2006-2007年的100.0%,但是仍明显高于全国平均水平,需引起足够的重视。

  由上述讨论可知,苏州地区儿童肺炎链球菌的耐药情况在近几年均非常严重,推测该现象可能由以下两种原因造成:(1)该地区呼吸道感染患儿的抗生素使用率非常高。有研究报道抗生素使用剂量与菌株耐药性呈正相关。而且相关研究显示,临床千预可加速细菌进化,水平获得耐药基因引起耐药。2006-2007年研究显示苏州地区91.7%的肺炎链球菌阳性患儿(3岁以下)在住院前一周使用过抗生素,且以p内酞胺类抗生素和大环内酷类抗生素居多。虽然本研究未调查住院患儿入院前的抗生素使用史以及入院后的抗生素治疗史,但是课题组一项关于严重急性呼吸道感染(Severe Acute Respiratory Infection,SARI)住院患儿的调查显示,97.7%的SARI病例在住院期间使用抗生素治疗,分别有93.3%和64.4%的患者使用了p内酞胺类抗生素和大环内酷类抗生素,但仅有37.7%的患者检出可能致病细菌(数据未发表),可见在苏州地区呼吸道感染儿童中存在抗生素滥用现象;(2)该地区儿童人群肺炎链球菌结合疫苗(Pneumococcal Conjugative Vaccine,PCV)接种率低。有研究报道PCV有助于降低儿童人群肺炎链球菌的携带率和耐药性。但是课题组调查发现苏州地区儿童人群PCV7接种率仅为10%左右(数据未发表),因此导致耐药菌株在未免疫人群中迅速传播。

  综上所述,苏州地区儿童肺炎链球菌的耐药情况非常严重,呈多重耐药模式,并存在交叉耐药现象,建议须在儿童人群中规范抗生素的使用,减少抗生素滥用情况,并加强PCV疫苗的接种,阻断耐药菌株的传播。

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