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药学类原创论文集锦 Caveolin-1丝氨酸调节小凹的形成

2018-11-21 14:08:36来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要:目的 研究caveolin-1丝氨酸的磷酸化是否会影响细胞膜上小凹的形成。方法 取大鼠的VSMC细胞在体外进行培养,然后将其作为研究对象,将实验分成三组进行,1、对照组2、caveolin-1/S88A T-Rex组(将caveolin-1第88位丝氨酸突变成丙氨酸,模拟caveolin-1的去磷酸化),3、caveolin-1/S88E T-Rex组(将caveolin-1第88位丝氨酸突变成谷氨酸,模拟持续丝氨酸磷酸化)。然后通过免疫荧光观察Caveolin-1在细胞内的定位,采用电子显微镜观察小凹的形成情况。

  关键词:Caveolin-1、Caveolae、内皮细胞、丝氨酸磷酸化

  前言:caveolae 是 在1953 年时由美国生物学家 Palade首次发现, 当时命名为 plasmale-mmal vesicles9(质膜囊泡)。而在2年后,日本学家Yamada再次观察到并报道了类似结果,并将这种囊泡命名为 caveolae intra-cellulares。Caveolae(小凹)又叫细胞窖、细胞质膜微囊,是细胞质膜上独立的特异性的区域。直径大概在 50~100nm之间, 电子显微镜观察到小凹是烧瓶状或者希腊字母Ω状的一种质膜内陷结构, 在细胞质膜上呈现为管状或者平铺状态,或者是形成分离的各个小囊泡, 并且在相互融合后形成一种葡萄状的结构。广泛存在在各种不同类型的细胞中且产生着各种不同的影响。如小凹细胞在脂肪细胞、内皮细胞、纤维母细胞、血管平滑肌细胞和肺上皮细胞中都大量存在者且都参与其各种生命活动,并对其功能及其相关的疾病产生着重大影响。

  小凹的形成有赖于caveolin-1在细胞膜上的定位。caveolin-1的多聚化体形式可以诱导细胞膜持续弯折内陷造成小凹的结构。因此,caveolin-1的多聚体形式是其定位于胞膜并形成小凹的必要条件。

  研究表明caveolin-1的脚手架结构是它形成多聚化体的基础,我们注意到在该区域(脚手架结构域)存在一个可调节位点,即第88位丝氨酸。caveolin-1的第88位丝氨酸正处于脚手架结构域,我们推测其磷酸化后可能破坏脚手架结构的α-螺旋,从而影响caveolin-1多聚体的形成及其在胞膜上的定位。本文就对caveolin-1丝氨酸的磷酸化是否影响细胞膜上小凹的形成做一个研究调查。

  乳腺癌是一种在妇女疾病中比较常见的一大恶性肿瘤,并且严重的威胁着我们的生命安全以及生活质量,也对患者的对生活的幸福感以及心理健康有着巨大的负面作用,十分不利。有研究统计表明在2010年时全球乳腺癌的新发患者大概是164万,且在欧美的发病率尤为偏高,数据显示乳腺癌有着明显的地区与人群的发病区别,这是乳腺癌发病的一个特点,而且对比近30年来乳腺癌的发病人数,发现乳腺癌的发病率越来越高,增长趋势明显,且年增长率超过3 %,并且发病人群有着越来越年轻化的趋势,已在女性疾病的恶性肿瘤中排名第一。且乳腺癌的发病机制有着不同因素、不同途径和不同步骤的特点,也存在着未知性,有着不同国家和不同人群的区别,因此我们也无法以单一的方式来准确的预测乳腺癌,因此我们需要在乳腺癌的发病早期,及早的确定诊断以及展开治疗,而手术是其治疗的主要手段,而手术则需要将癌变的乳腺切除掉,但手术后会留下疤痕,十分明显且不容易修复,并且手术后的治疗也极容易出现各种不同程度的不良反应,以及心理情绪方面的负面效应,影响着患者配合治疗的积极性以及康复进度。因此在肿瘤的预防,诊断,治疗以及术后等方面我们都需要严格注意。

  1、Caveolae与Caveolin

  到目前为止,人们发现在Caveolae 上不止有一种小凹蛋白,所以研究者们为了更好的区分它们,就将先被发现的caveolin取名为caveolin-1, 后发现的依次被称作caveolin-2、caveolin-3。并且发现最先被发现的Caveolin-1 (小凹蛋白-1 )是小凹表面的标记蛋白,是一类含磷蛋白,也是小凹的主要组成蛋白,具有178 个氨基酸残基,33个氨基酸疏水区,分布最广,主要是在分化程度较高的细胞中存在,且在各类型细胞组织中表达水平各有高低。

  2、内皮细胞 caveolin-1与小凹的生物学功能以及对疾病的的影响

  随着现代科学的发展,在分子生物学领域的研究也在进行着飞速的发展,研究发现小凹及其蛋白家族会参与许多细胞的生命活动,比如细胞内吞与胞内运输(endocytosis)、胆固醇的运输与调节以及信号传导,并在许多疾病中有着重大影响,如心血管疾病、恶性肿瘤、动脉粥样硬化,病毒感染,糖尿病以及缺血性脑卒中。

  2.1参与胞吞和胞内运输作用

  实验表明,小凹细胞在进行细胞胞吞作用的时候,Caveolin-1是其关键分子,Caveolae拥有囊泡运输功能所必需的分子机器,可以通过某些内化物质分子运输到所需位点,因此小凹在细胞的运输中有着及其重要的生理功能。,而caveolae则是具有选择性的胞吞功能,只将有着同族受体的配体运输进入细胞。

  2.2参与胆固醇运输

  小凹蛋白-1和胆固醇之间有着十分强的亲和力, 所以,小凹中的胆固醇比其他生物膜上的含量高得多。小凹蛋白进行胆固醇的运输速度也远快于其他的运输胆固醇的机制,至少是4倍的差别,因此细胞内新产生的胆固醇就可以通过Caveolin-1来做到快速的从内质网运向细胞膜。所以小凹蛋白参与胆固醇的运输并发挥着快速以及重要的作用,而在细胞中调节胆固醇浓度时也起到了十分重要的作用。研究发现,收缩表型的血管平滑肌细胞中存在着大量的caveolae,这些细胞在胞外的高胆固醇的环境下不仅不会聚积脂质,而且还可以通过细胞质膜上的caveolae将产生的过量胆固醇释放到胞外。

  此外,有研究表明,成人纤维细胞中小凹蛋白以可溶性形式在胞浆中聚集,而胞浆内游离的小凹蛋白与热休克蛋白(免疫亲和素)组成伴侣复合物,而细胞就是通过这个复合物参与胆固醇的定向运输,将新产生的胆固醇至运输到小凹上。

  2.3小凹与信号传导

  Caveolae的发现在近代受到不少人的重视 。研究发现Caveolae中存在着许多的的膜结合蛋白,信号传导途径主要是G蛋白介导的信号转导、酪氨酸激酶的信号转导、蛋白激酶 C(PKC)信号。 Caveolae参与信号传导的方式是为各信号分子的联系提供一个场所,因此各个信号分子的传输和周转都可以在这个平台上顺利进行,这就奠定了小凹在各信号传导中的中心地位。

  2.3.1 G蛋白介导的信号转导

  Caveolin-1的脚手架区(CSD)可以结合并且能够影响信号分子的传导,caveolae膜中大部分发现有G蛋白, 且含量比其他质膜区都高。小凹蛋白如果和G蛋白的α亚单位结合, 那么α亚单位就会被激活,从而导致G蛋白不能与caveolin相结合,所以 Caveolin只能和非活性形式的 G 蛋白(GDP-联结形式)结合,特异性序列结合并调节信号的转导,抑制GDP与GTP 的转换,使得G蛋白向小凹聚集。

  GPCR (G 蛋白耦联受体)主要位于caveolae上,比如缓激肽、内皮素、 M2胆碱能受体、β-肾上腺素能受体和乙酰胆碱等。 G 蛋白耦联受体在caveolae上的定位可以通过配体的依赖性或者非依赖性的途径来完成。在G蛋白信号级联反应中,激动剂可以诱导G 蛋白耦联受体 移动位置到caveolae膜上,这可能是启动该反应中的关键一步。而内皮素在caveolae 上的定位则是通过配体非依赖性的途径来完成的。

  还有G蛋白信号级联反应中的下游分子也有相当部分的存在在小凹上,例如腺苷酸环化酶、 -ATP 酶、钙离子等。

  综上所述,G蛋白、GPCR、G蛋白信号级联反应的下游分子都聚集在小凹上,并且都对G 蛋白介导的信号转导有利。

  2.3.2 酪氨酸激酶的信号转导

  在细胞中,受体和非受体型的酪氨酸激酶都聚集在caveolae内并且可以和caveolin-1 相互作用,caveolin-1 是其最重要的底物,并且能和Src(非受体型酪氨酸激酶)酪氨酸激酶家族中的c-Src(野生型Src)结合形成稳定的复合物,在共同表达的时候则是通过抑制自身的磷酸化来抑制c-Src的活性。而受体型酪氨酸激酶在激活后则可以使多种信号转导分子聚集在caveolae上。EGF(上皮生长因子受体)、PDGF(血小板源性生长因子受体)与受体结合可以使Caveolin磷酸化,而络氨酸激酶的活性也受到caveolin的调控,自体激活受到抑制,另外,络氨酸激酶受体也包含胰岛素受体,caveolin脚手架区的多肽序列可诱导其激酶活性,增加其底物的磷酸化,

  2.3.3 蛋白激酶 C信号途径

  蛋白激酶C (PKC) 是一种丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶,而研究表明,蛋白激酶C在内皮细胞的小凹上担任着十分重要的功能,蛋白激酶C (PKC)激动剂通过将小凹的形态学改变来阻止小凹摄取叶酸盐等小分子物质(通过胞饮途径),且,PKC也参与控制调节 caveolae 内化。Caveolin-1可以影响 PKC的酶激活性,且小凹蛋白-1和PKC酶活性的部位结合就可以对其酶活性起到负性调节的作用,从而抑制其激酶活性。

  2.4心血管疾病

  小凹蛋白在心血管系统及其相关疾病中担任着重要的调控作用,而在心血管系统中,小凹蛋白的含量比较丰富,在内皮细胞 、心肌细胞 、平滑肌细胞 和巨噬细胞等都大量存在着。Caveolin-1在动动脉和静脉中都可以表达,并且能够通过和EGF(表皮生长因子受体)相互作用来进行细胞内的信号传导,以此来达到调节血管平滑肌细胞增殖的作用。实验证明,caveolin-1参与血管生成的调节,在内皮细胞不断增殖与分化时呈现过表达状态,说明小凹蛋白可能对内皮细胞的增殖起到一种负性调节的作用,并且会促进细胞的分化功能。而相反的是,小凹蛋白-1的水平下调,就能够抑制内皮细胞的分化。

  小凹蛋白-1虽然是表达在内皮细胞和心脏成纤维细胞上 ,但是小凹蛋白-1的缺失同样可能引起心肌疾病或者心肌肥厚。

  动脉粥样硬化是一种常见的病因复杂的血管壁炎症性的疾病。巨噬细胞吞噬血液中滞留的脂蛋白修饰物,而其胆固醇含量变高,使内皮细胞泡沫化,然后就会引发动脉粥样硬化的过程的启动,因此巨噬细胞在其过程的发展中扮演着一个十分重要的角色,而研究表明,小凹蛋白在巨噬细胞和 HDL-C之间进行相互作用时起到调节的作用,且小凹蛋白和小凹也直接参与作用巨噬细胞的凋亡,且在其凋亡过程中Caveolae的水平升高明显。Caveolin-1通过磷酸化、去磷酸和在高尔基体-Caveolae之间穿梭来维持血管内皮细胞膜上胆固醇的平衡以及进行细胞内胆固醇平衡的调节,Caveolae可能通过参与LDL(血管壁低密度脂蛋白)的氧化 、eNOS活性的抑制功能等途径来影响动脉粥样硬化病变过程的。

  2.5 Caveolin-1与肿瘤

  小凹和新生血管的形成有着联系,研究发现,Caveolin-1可能起到抑制肿瘤癌基因的作用,在进行多种肿瘤细胞研究后,发现在人类的乳腺癌、结肠癌和肺癌等各种肿瘤疾病中可以起到抑制细胞的增殖和向恶性肿瘤的转化,使细胞的周期停止,并且可以促进细胞接触性抑制与促进肿瘤细胞凋亡。研究表明, 小凹蛋白对一些肿瘤的发生生和发展以及其肿瘤细胞的转移和多药、耐药性肿瘤有着一定的影响。例如,在对乳腺癌、耐药性肺癌和结肠癌等恶性肿瘤进行研究后发现 Caveolin-1的水平是低于正常良性组织的。Caveolae可以介导靶向药物进行治疗,靶向抗癌一直都是治疗肿瘤的一个比较理想的方法,但可能是因为内皮细胞的屏障作用,导致大分子免疫毒性药物不容易透过肿瘤细胞,使得这种治疗方法在人体上的效果没有预期的那么好。因此在发现这一点后,人们将改变研究方向,然后经过实验发现,Caveolae可以作为靶抗原,并且是一种高效的基因导入的良好途径,且可组织特异性药物释放。而目前人们已经可以得到

  良好的Caveolae抗体(高纯度、高特异性),该方法的可行性和特异性也在很大的程度上得到了提高。

  2.6病毒感染

  Caveolae是病原体进入细胞的一种重要通道,因为Caveolae全程参与 HIV病毒感染、 T细胞复制,出胞,扩散等过程,而研究发现,Caveolin-1可以和HIV的包膜糖蛋白结合,用动物进行实验,以HIV包膜糖蛋白为病原体进行免疫反应,其产生的抗体可以用来阻断艾滋病的进程,所以小凹蛋白很有可能作为一个重要靶点用来研究制作艾滋病等病毒的疫苗。

  2.7糖尿病

  胰岛素分泌代谢异常可能会形成糖尿病。Caveolin虽然可能抑制激活酶的增长,但是小凹蛋白确不会抑制其胰岛素信号的传导,甚至相对于胰岛素信号来说,小凹蛋白可能还是激活胰岛素信号传导途径的一个关键的因素。在对小鼠去除Caveolin-1 基因和普通不做处理的小鼠进行实验,发现Caveolin-1基因敲除的小鼠显示出更高的空腹血糖和胰岛素水平。虽然Caveolin-1基因的缺乏并不会直接导致糖尿病,但是这却会成为一个易感因素。而糖尿病的发现也可能会出现一些并发症,而Caveolin-1也会在其中产生着一些影响。如糖尿病大血管病变、糖尿病周围神经病变、糖尿病脂质代谢异常、糖尿病性白内障。发生糖尿病血管病变基础的就是血管内皮损伤,所以糖尿病的大血管病变也是糖尿病的患者预后所需要注意的关键因子。研究发现,高血糖应激可能会导致小凹蛋白-1表达降低,会使得脱髓鞘发生病变,且髓鞘蛋白的丢失更加严重。并且会促进有髓轴突退变,影响神经的病变。实验显示,小凹蛋白-1对脂肪代谢具有一定的抑制作用,因此会对糖尿病患者的脂质代谢过程产生影响。糖尿病的发生会对晶状体产生一定的损害,而当晶状体中内环境的代谢失去平衡的时候,就会引发白内障发生。

  2.8缺血性脑卒中

  缺血性脑卒中是比较严重的致残致死性的疾病,在全球的致死性疾病中排名第三。而目前有证据表明小窝及其组分蛋白在缺血性脑卒中发挥着有益作用,在脑缺血的病理生理学中,起着调节血脑屏障通透性、降低神经炎症反应、保护神经、抑制血管生成的重要作用。

  3、实验部分

  3.1主要仪器

  培养箱 美国 Forma 公司(3111)

  超净工作台 苏州安泰空气技术公司

  电子分析天平 美国 Sartorius 公司(FA1004)

  高速低温离心机 德国 Eppendorf 公司产品(5804、5804R)

  荧光分光光度计 上海分析仪器总厂11

  普通光学显微镜 日本 Nikon 公司

  荧光倒置显微镜 日本 Olympus 公司(1×70)CO

  超纯水器 美国 PURELAB Maxima 公司

  超声波细胞破碎仪 宁波新芝科器研究所

  垂直电泳仪及转膜系统 美国 Bio Rad 公司

  3.2主要试剂

  DMEM 培养基 美国 Gibco 公司

  胎牛血清 中国杭州四季青公司

  荧光染料(DiI) 美国 Sigma 公司

  兔抗大鼠 β-actin IgG 中国武汉博士德公司

  胰蛋白酶 美国 Sigma 公司

  兔抗 LOX-1 多克隆抗体 美国 Santa Cruze 公司

  兔抗大鼠 β-actin IgG 中国武汉博士德公司

  3.3实验操作

  细胞培养:在37℃、5%CO2 、 10%胎牛血清、100 U/ml的链霉素和青霉素的完全培养基将细胞培养到 培养基的90%以上,再用氧化低密度脂蛋白( 40μg/ml)进行处理,然后用作实验。将内皮细胞株种植到培养套皿上面,以 2x105/孔的密度培养,在 4 天后,将培养出的紧密细胞单层用来进行实验。将细胞株放在6孔板内的盖玻片上进行种植培养,然后在其融合度到达 70%的时候,就可以用来进行细胞免疫荧光实验。

  荧光标记检测:在37oc环境下,把细胞和 DiI(40μg/ml)进行标记的 ox-LDL进行培养不同的时间,然后把 DiI 标记的 ox-LDL去掉,改而用普通的培养基进行培养不同的时间。然后用 PBS溶液 洗三遍,再用 多聚甲醛(3.8%)进行15分钟的固定 。最后用荧光显微镜进行观察,然后根据细胞内免疫荧光的强度来确定细胞中的情况。

  荧光倒置显微镜观察:在6 孔板内进行细胞的种植好培养,以105cell/孔的密度在细胞达到培养基的70%的时候,将培养基去掉,然后加入carrageenan、nocodazole、filipin 和溶酶,预先将细胞进行1 小时的处理 ,然后和40μg/ml的DiI-ox-LDL一起培养24个小时,然后采用荧光倒置显微镜观察。

  Caveolin-1 转染:在开始进行Caveolin-1转染的前一个星期,先进行一批细胞培养,然后在其中选出融合度达到 70%的内皮细胞,取出四瓶将其用于实验。然后采用无血清的 DMEM 配制 出三份SiRNA 溶液,分别为60nM、100nM、150nM。然后配制脂质体溶液,其浓度为1%,在常温下培养5分钟,然后 将已经配置好的 SiRNA 溶液直接加入到脂质体溶液中,缓慢摇动将其混合均匀,在常温下进行 25分钟的培养,然后用 PBS溶液和无血清 的DMEM 依次各洗两遍,然后倒掉。再将前面所得的混合液加 入2ml 到各个瓶的细胞中,缓慢摇动将其混合均匀,然后放到温箱中进行6 个小时的培育,再将含 20%血清 的DMEM 加 1ml 到培养瓶中继续培养,18到24 个小时后将培养瓶中换成新鲜的10%的DMEM。在第二天继续前面那次的操作,将培养瓶中的DMEM换一次 ,然后继续培养 ,然后在次日提取其蛋白,检测 小凹蛋白-1的表达水平用来确定小凹蛋白-1转染的最佳条件。然后进行转染,再和ox-LDL 一起培育 24 个小时后提取其核蛋白检测NF-κB的含量,并且测定 LOX-1的表达。

  丝氨酸突变:采用大鼠VSMC和巨噬细胞细胞株作为实验的研究对象,将实验分成以下三组:1、空白组(未做特殊处理),2、caveolin-1/S80A T-Rex组(将caveolin-1第80位丝氨酸突变成丙氨酸,阻止磷酸化caveolin-1形成),3、caveolin-1/S80E T-Rex组(将caveolin-1第80位丝氨酸突变成谷氨酸,模拟持续丝氨酸磷酸化)。用LDL培育细胞24个小时,然后分别将胞膜蛋白和胞浆蛋白收集来进行蛋白印迹,然后进行检测细胞内caveolin-1的定位,并且采用荧光倒置显微镜通过细胞免疫荧光结合来观察细胞内caveolin-1的定位。

  4、结果

  在实验中我们将VSMC中野生型的caveolin-1,S88A突变型的caveolin-1和S88E突变型的caveolin-1都进行了转染。然后分别提取出其中的胞膜蛋白(A)和胞浆蛋白(B),来检测其caveolin-1的蛋白表达水平。实验结果如图,表明S88A突变型的caveolin-1主要在细胞质膜上存在,而S88E突变型的caveolin-1主要是在胞浆中存在。

  图. Caveolin-1 第88位丝氨酸点突变对其细胞内定位的影响

  对照组 S88A突变型 S88E突变型

  图. Caveolin-1 第88位丝氨酸点突变对其细胞内定位的影响

  5、结论

  实验证明丝氨酸的磷酸化会影响Caveolin-1胞在细胞内的定位,而小凹的形成则受到caveolin-1在细胞膜上的定位的影响,因此caveolin-1丝氨酸的磷酸化会对细胞膜上小凹的形成起到调节作用,也对小凹的生物学功能及其相关的疾病有着重大影响。

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