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动物医学论文 H9N2亚型禽流感病毒的全基因克隆与序列分析及H9N2亚型禽流感、新

2018-12-21 16:00:53来源:组稿人论文网作者:婷婷

   摘要

  1.H9N2亚型禽流感病毒全基因克隆与序列分析

  本研究提取了禽流感病毒分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017的RNA作为模板,反转录为cDNA。通过RT-PCR方法从该禽流感分离株cDNA扩增该毒株的8个vRNA全长片段,并克隆至载体pMD-18T中。经测序得到分离株的全基因序列,并对其变异性、抗原性、遗传进化关系进行分析。

  2.H9N2亚型禽流感病毒M2蛋白原核表达载体的构建

  本研究提取了禽流感病毒分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017(H9N2) RNA作为模板,反转录为cDNA。通过RT-PCR方法从该禽流感分离株cDNA扩增该毒株的M2基因,并克隆至载体pET-28a中。经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切和测序证实后,再转化至表达菌E.coli.BL21。最终成功构建了M2基因重组原核表达载体并建立了M2蛋白的原核表达系统,为进一步研究M2蛋白的生物学活性奠定了基础。

  3. H9N2亚型禽流感、新城疫经典毒株二联灭活疫苗的试制

  本章节利用第一章节的A/chicken/Shandong/LY1/2017 H9N2亚型禽流感分离株和新城疫经典La Sota株制备了禽流感(H9N2亚型)灭活疫苗、新城疫(La Sota)灭活疫苗、禽流感(H9N2亚型)-新城疫(La Sota)二联灭活疫苗。制备时按照《中华人民共和国兽药典》要求进行毒株EID50检测、HA检测、抗原的灭活检验、疫苗的乳化检验。研究中选取21日龄非免鸡为试验动物,分成4组分别免疫禽流感灭活疫苗、新城疫灭活疫苗、禽流感-新城疫二联灭活疫苗,设立空白对照组。42日龄时进行一次加强免疫。在初免后21天和加强免疫后7天对各组翅静脉采血,分离血清检测各组血清中HI中和抗体水平。二免后10天分离培养各组鸡脾脏淋巴细胞并选用LPS、PHA刺激,采用MTT方法检测各组淋巴细胞增殖能力。同时通过抗原刺激脾脏淋巴细胞后获取细胞上清进行IL-4、IFN-γ细胞因子的检测。结果显示,毒株EID50、HA效价,制成疫苗的无菌检验、乳化检验均符合《兽用生物制品质量标准》(2006-2008)。在HI中和抗体水平检测中,禽流感灭活疫苗和禽流感-新城疫二联灭活疫苗在两次免疫后均能刺激机体产生很高的、无显著差异的AIV中和抗体水平,均高于10log2;新城疫灭活疫苗和禽流感-新城疫二联灭活疫苗在两次免疫后机体NDV HI中和抗体水平为7log2。分离脾脏淋巴细胞培养后,各实验组脾脏分离淋巴细胞增殖能力无显著差异,但均高于空白对照组。IFN-γ细胞因子表达水平各组之间无显著差异,但实验组的IL-4细胞因子表达水平比对照组有轻微提升。综上,试验中研制的禽流感-新城疫二联灭活疫苗能够提供和禽流感灭活疫苗、新城疫灭活疫苗同水平的保护性中和抗体,并能无差异的激活淋巴细胞增殖和轻微提高IL-4为代表的体液免疫水平

  关键词:H9N2;序列分析;原核表达;二联疫苗

  第一篇 文献综述

  1.引言

  禽流感病毒属于正黏病毒科A型流感病毒属,根据其表面糖蛋白的差异可以将其分为18个HA亚型和11个NA亚型(包括从蝙蝠体内分离到的两种新的A型流感病毒亚型)。A型流感病毒的基因组长度在2341~2890bp之间,由8个单股负链RNA(viral RNA,vRNA)片断组成。根据其vRNA各片段电泳迁移率降序排列和编码的主要蛋白命名,分别为vRNA1~vRNA8(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS)。目前为止,已经发现的A型流感病毒编码蛋白包含了10种必需蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、NEP)和7种非必须蛋白(PB1-F2、N40、PA-X、PA-N155、PA-N182、M42、NS3)。

  由于A型流感病毒的基因组由8个分开的vRNA片段构成,宿主细胞被不同流感病毒共同感染即有可能衍生出经历了基因重组的新的子代病毒。这种机制的病毒进化程序在A型流感病毒的遗传变异进程中发挥重要作用,甚至会生成能够引发大流行的新型病毒。1957年的H2N2亚洲流感、1968年香港的H3N2流感、2009年的H1N1流感、2013年我国的人感染H7N9,都是由基因重组病毒引发。

  2.禽流感的流行情况

  2.1 H5亚型禽流感的流行情况

  H5亚型禽流感病毒,尤其是高致病性H5亚型禽流感病毒,不但导致家禽严重发病, 而且其中部分毒株还可以感染人并导致严重的临床症状或死亡。对H5亚型禽流感的防控涉及政治、经济、全球化合作等多个方面。

  19世纪70年代,Pereira报道了在苏格兰的全球第一起H5N1高致病性禽流感疫情。随后的几十年内,在南非、加拿大、美国、英国、墨西哥等地分别暴发了多起令养禽业损失惨重的H5亚型禽流感疫情,涉及H5N3、H5N9、H5N2、H5N8、H5N1多个亚型。1996年,在我国的广东省首次暴发H5N1高致病性禽流感,引发此次疫情的Gs/Gd/1/96被认为是当前亚洲流行的H5N1病毒的始祖。值得注意的是,1997年我国香港地区发生了多起人感染H5N1导致死亡的病例。流行病学调查和遗传进化分析显示,引起这次流行的病毒是由Gs/Gd/1/96 H5N1、A/quail/HK/G1/97-like H9N2、A/teal/HK/W312/97-like H6N1三个亚型的毒株重组而来,在香港的活禽市场普遍存在。2001年-2004年,H5亚型流感疫情先后在东南亚地区和我国各地暴发,分离病毒的遗传进化分析显示,H5亚型的流行呈现出一种以起源于Gs/Gd/1/96的重组Z基因型占主导,多种病毒基因型并存的局面。

  H5N1的进化过程伴随着H5N1毒力的逐渐增强和宿主范围的逐渐扩大。陈化兰等对我国南方地区H5亚型的长期的流行病学调查发现,1999-2002年期间从健康鸡群分离到多株H5N1亚型毒株及其变异株,大部分毒株对鸡呈高致病性但对鸭不致病;2004-2009年期间从家禽、野鸟、人体分离到的大部分毒株抗原性差异不大,但对小鼠和鸭都是致死性的。

  2.2 H7亚型禽流感的流行情况

  H7禽流感病毒和H5一样,对家禽生产和人类健康都有极大影响。相较而言, H7亚型禽流感病毒病死率明显要低,但其跨种间传播能力更加强大。2013年2月-2014年12月期间,在我国大陆发生的人感染H7N9疫情总共有453人感染,死亡率接近30%。确诊病例大多有活禽接触史,但病例之间没有明显的流行病学联系,呈散发分布。病毒的进化分析表明引发此次疫情的H7N9为三源重组病毒,其HA、NA、内部基因分别来自H7N3、H10N9、H9N2。2014年2月,在对吉林省人感染H7N9病例的调查研究中从患者家的鸡群中分离到一株由H7N9和H9N2重组而来的H7N2亚型禽流感病毒。数百例人感染H7N9亚型禽流感病毒的事实表明,加强对H7亚型禽流感病毒的监测和防控刻不容缓。

  2.3 H9亚型禽流感的流行情况

  自1966年H9N2亚型禽流感病毒从美国温和感染的火鸡中被Homme等初次发现,之后便在美、英、法等全世界多个国家和地区被发现。我国是在1994年从广东鸡群中初次分离到H9N2亚型禽流感病毒,感染鸡群表现产蛋下降、低死亡率的低致病性特征。随后,H9N2病毒在国内迅速蔓延,在多个养鸡场和水禽群体中被分离到,逐渐成为我国流行的禽流感病毒最主要的亚型,造成重大经济损失。有香港的研究人员在长期的家禽禽流感监测过程中发现,香港地区的H9N2亚型禽流感病毒按照HA的进化关系可以分为A/Quail/HongKong/G1/97、A/Duck/HongKong/Y280/97、A/Duck/HongKong/Y439/97 3个稳定遗传亚群。

  流行病学调查显示,H9N2亚型AIV还是2013年中国新出现的能够感染人的H7N9亚型流感病毒的供体。Lam T等人通过分离H7N9并分析其遗传进化关系,结果显示其HA基因为AIV欧亚分支,与2010-2011年分离与中国华东地区的鸭源AIV A/duck/Zhejiang/12/2011(H7N3)关系密切[];NA基因与当地活禽市场分离到的H10N9病毒(A/chicken/Jiangsu/RD5/2013)同源性非常高;其内部基因由当前流行的H9N2亚型AIV提供[]。与此同时,2013年发生于江西省、备受关注的人感染新型H10N8病毒案例,经分析发现其内部基因的供体也是H9N2亚型AIV。

  此外,1998年郭元吉等在我国华南地区从流感患者的咽喉部粘液样本中分离到源于当地鸡群中流行H9N2亚型AIV,是历史上H9N2亚型AIV感染人的初次报道。1999年-2003年,香港地区有多个人感染H9N2病例报道,其体内分离到的病毒株与A/Quail/HongKong/G1/97高度同源[]。由此可以推测,H9N2存在突破种间障碍的可能,即无需中间宿主直接感染人,并将人体作为一个病毒的“混合器”和人流感病毒发生基因重组生成能够在人际间高效传播的新病毒亚型。

  3.禽流感的抗原变异

  3.1禽流感病毒抗原变异相关基因结构及功能

  3.1.1血凝素蛋白(HA)

  血凝素蛋白(HA)由流感病毒RNA片段4编码,是一个由三聚体的棒状分子构成的Ⅰ型跨膜蛋白,其羧基端插入病毒囊膜,氨基端突出于病毒粒子表面,形成纤突。HA蛋白三聚体含有一个球状的头部结构和一个长的纤维状的茎部结构,分别由3个HA1分子和3个HA2分子构成。

  HA蛋白具有与宿主细胞表面的糖蛋白或糖脂分子末端的唾液酸受体结合的功能。Skehel J J等人通过晶体结构解析和突变分析的方法,确定了位于HA分子头部的受体结合位点。禽流感病毒和马流感病毒的HA蛋白识别的受体都是唾液酸2,3-半乳糖苷,而人流感病毒的HA蛋白识别的受体不同,为唾液酸2,6-半乳糖苷。这种HA蛋白识别受体的差异直接关系到流感病毒的跨宿主传播能力。此外,在病毒复制的脱壳过程中,HA蛋白能够在酸性环境中诱导膜融合。

  3.1.2神经氨酸酶(NA)

  NA蛋白由流感病毒RNA 片段6编码,由4个的蛋白单体聚合形成四聚体。每个蛋白单体都含有一段保守的氨基端胞质区、一个疏水的跨膜区、一个茎区和一个头部。NA蛋白单体的头部具有由多个带电荷的氨基酸构成的活性位点,不同亚型之间的活性位点存在显著差异。NA蛋白茎区关系到流感病毒的复制、致病性、受体结合活性。NA蛋白也具有抗原性,但NA蛋白抗体只能在一定程度上抑制病毒复制,不能中和病毒感染。

  3.1.3 M2基质蛋白

  M2蛋白是流感病毒RNA片段7编码的第二种蛋白,是散布在流感病毒囊膜上的一种离子通道结构跨膜蛋白。M2蛋白由氨基端含24个氨基酸的胞外区、中间含19个氨基酸的跨膜区、羧基端含54个氨基酸的胞质尾区构成,以高度保守的同源四聚体形式存在。M2蛋白22~46位氨基酸的区域具有离子通道活性,其中的37位组氨酸类似于一个“滤器”对离子选择性滤过,27位的缬氨酸和41位的色氨酸共同构成了“滤器的门”,其构象如图。M2的“滤器”结构通过转运细胞表面信号在流感病毒的复制中发挥作用,并且金刚烷类抗流感病毒药物就是通过抑制“滤器”的活性而发挥抗病毒作用。

  图1:流感病毒M2蛋白的质子通道结构

  Fig 1. Proton channel structure of influenza virus M2 protein

  a.侧面视角;b顶部视角

  3.2抗原漂移和抗原转变

  流感病毒主要通过两种方式来改变其自身抗原性从而逃避宿主免疫系统的攻击,由点突变引发的抗原漂移能够造成流感的季节性流行,而由基因重组引发的抗原转变则可能导致新的流感大流行。

  3.2.1抗原漂移(antigenic drift)

  A型流感病毒的血凝素(HA)在病毒复制过程中发生突变时,突变不断累积可以导致抗原性的变异。大多数突变的结果是中性的,不会影响HA的抗原性。然而,有些突变会引起HA蛋白抗原性产生显著变化从而影响与特异性抗体的结合,病毒不会被先前季节性流行毒株的抗体中和,从而广泛、迅速的流行。HA蛋白(按H3 HA蛋白序列)具有A、B、C、D、E 5个抗原决定簇。HA蛋白的抗原漂移和上述5个抗原决定簇的氨基酸发生置换关系密切。其中,非中性突变表现最活跃的位点是A和B位点,所以这两个位点的抗原性很强。A位点中对该位点抗原性起作用最显著的是133、144~145位,因此这部分区域的变异性更强,发生氨基酸置换的频率更高、种类更多。B位点中,非中性突变频率最高的区域是155、156、159、189、193、197位,且186~199位可能对B位点的抗原性起显著作用。C、D、E位点的抗原性主要分别由275~278位区域、172~174区域、78~83位区域决定,这3个位点的变异性一般,从而其抗原性表现也一般。

  禽流感病毒的抗原漂移不断发生能够导致疫苗失效,引发新的季节性流行。H9N2亚型禽流感病毒在世界各地的不同的流行毒株之间的抗原性存在显著差异。从我国的鸡群中分离的H9N2病毒经历了抗原漂移演变成为了不同的分支(Sun等,2012)。这种抗原性漂移可能导致免疫失败,并可能解释目前在我国H9N2流感病毒普遍流行的原因。鉴定H9的抗原位点对于监测抗原的变异和开发有效的疫苗至关重要。尽管H9的晶体结构已被确定,但H9详细的抗原性表位尚未阐明。并且,对H9抗原位点氨基酸的鉴定表明了H9与其他亚型抗原分布区域的差异。H9 HA蛋白与H3 HA蛋白相比较,H9的HA蛋白不含H3 HA蛋白中对应的A抗原位点(Kaverin等,2004)。Okamatsu等和Wan等鉴定出了与H9N2亚型禽流感病毒的抗原性有关的HA蛋白中的多个氨基酸位置,发现大多数的抗原位点位于HA三聚体远端的头部区域(参见图xx)。

  图2:A/Swine/Hong Kong/9/98株H9N2亚型禽流感病毒三维图谱上与抗原性有关氨基酸的定位

  Fig2.Localization of amino acids related to the antigenicity of H9N2 influenza virus on the three-dimensional map of A/Swine/Hong Kong/9/98. PDB ID is 1JSD. All positions are shown with H9 numbering

  神经氨酸酶(NA)也同样具有抗原性,其诱导产生的抗体也具有一定的免疫保护效果。NA蛋白同样可以由抗原位点的氨基酸突变引起抗原漂移[652]。研究发现,H1N1和H3N2的NA蛋白与HA蛋白相比,抗原漂移一样可由个别关键氨基酸的突变导致,但NA蛋白的抗原漂移更加的缓慢,并且呈现出不连续的特征[676]。

  3.2.2抗原转变(antigenic shift)

  当宿主差异性非常大的两种流感病毒同时感染一个细胞时,来源不同的流感病毒的基因片段有发生基因重组突破种间限制的可能,从而产生新的基因重组病毒。这种基因重组病毒的抗原性产生了根本的改变,并且不能被以往流行的流感病毒抗体中和。1957年曾在香港流行过的H2N2流感病毒和1968年同样在香港流行的H3N2流感病毒,由于抗原转变发生了基因重组,这两种病毒都分别获得了禽流感病毒的HA、NA、PB1基因或HA、PB1基因,并且人群中不具有针对该新型HA、NA的抗体,导致了新型病毒的迅速传播,引发了人流感的大流行。禽流感病毒能够跨越个体、种属的传播特性,致使即便在同一禽类群体中,也可以存在几种亚型的禽流感病毒共同感染,直接导致了禽流感病毒基因重组发生频率比较高。1992年,Brown等人分离到一株HA和M基因来源于马流感病毒、其余基因片段均来源于人流感病毒的H1N7亚型流感病毒。当来源具有差异的流感病毒共同感染某些中间宿主时,在宿主体内发生基因重组生成了新的亚型。例如,猪的呼吸道上皮细胞表面同时具有被人流感病毒和禽流感病毒HA蛋白识别的两种受体,长期以来,猪在流感病毒的抗原转变相关载体研究中具有备受关注。

  目前,H5、H7和H9三种亚型的禽流感病毒在世界上广泛传播并偶见于人的感染,因此,这三种亚型的禽流感病毒有可能和人的流感病毒发生基因重组。由于人群中对禽流感病毒的免疫力的普遍缺乏,当一种新的基因重组病毒在人群中出现时,可能引发由于流感病毒抗原转变导致的新的人的流感大流行。

  4.禽流感疫苗的研究进展

  4.1重组病毒活载体载体疫苗

  重组病毒活载体疫苗以病毒为载体,把具有免疫保护功能的抗原区域基因节段和载体进行重组,载体病毒在机体内复制、增殖的同时持续表达外源目的蛋白,并诱导机体产生特异性的免疫应答。目前已被广泛研究并应用的载体病毒有:人类腺病毒5型(HAdV-5)、猪伪狂犬病毒(PrV)、禽痘病毒(FPV)、新城疫病毒(NDV)、火鸡疱疹病毒(HVT)、鸭肠炎病毒(DEV)等。其中,使用FPV、HVT和NDV的重组病毒活载体疫苗已多个国家和地区销售。Swayne等人使用B1 ND的弱毒株构建了能够表达H7亚型禽流感病毒HA基因的重组新城疫病毒载体,并能对H7亚型AIV和NDV的攻击产生一定的免疫保护作用。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所采用反向遗传技术手段构建了以新城疫La Sota弱毒疫苗为载体,表达H5N1亚型高致病性AIV分离株HA基因的重组新城疫载体病毒疫苗。在试验中,仅须一次免疫该疫苗便可对实验鸡提供针对H5亚型高致病性禽流感和ND强毒的免疫保护作用。

  当重组病毒活载体流感疫苗中的载体病毒感染宿主细胞时,由载体病毒负责安全地激活机体的体液免疫和细胞免疫。但是,如果宿主体内具有母源抗体或预先进行过针对该载体病毒的免疫接种程序,则疫苗的免疫效率会受到干扰,因此,根据母源抗体水平或接种计划来优化免疫程序非常重要。另外,Ferreira H L等发现,重组NDV病毒流感疫苗和重组FPV疫苗联合使用时,可以持续有效的保护机体免受H5N1亚型AIV的攻击,但其机制尚未阐明。

  4.2 mRNA疫苗

  mRNA是一种新型的核酸疫苗。它能够被被Toll样受体、视黄酸诱导基因蛋白为主的受体识别,在胞液中表达,通过刺激机体免疫系统产生体液免疫应答和细胞免疫应答,达到保护的作用。2012年,德国的Petsch B等利用信使RNA研制了一种新型的突破性抗流感疫苗。这种mRNA疫苗通过诱导机体产生B细胞和T细胞的全面免疫应答,对不同年龄段小鼠均能产生极佳的免疫保护效力,并能以多种蛋白甚至高度保守的病毒核蛋白为靶点诱导免疫应答,具有显著的交叉保护作用。尽管流感病毒的主要抗原血凝素和神经氨酸酶抗原性变异的频率很高,研究人员设计了针对流感病毒H1N1上编码这两种抗原的保守区域中单一作用部位的mRNA,得到高效的流感疫苗。试验证明,与传统疫苗相比,mRNA疫苗具有极强的免疫原性、安全性、灵活性,在雪貂和家猪中都能诱导生成良好的免疫应答。

  4.3广谱疫苗

  禽流感病毒广谱疫苗的概念是对所有禽流感病毒亚型产生保护效力的疫苗。考虑到禽流感病毒的流行病学和遗传多样性,目前使用的疫苗普遍只能对特定的禽流感毒株具有保护效力,一旦有新的禽流感病毒毒株或亚型出现,原有疫苗将会失去其保护效力。因此,开发出一种具有诱导广泛交叉反应免疫应答的广谱禽流感疫苗具有特别的意义。

  基于高度保守抗原位点的广谱流感疫苗一直是流感疫苗研究的热点。有研究人员用流感病毒M2蛋白离子通道的胞外区(M2 ectodomain,M2e)的单克隆抗体14C2被动免疫小鼠后对小鼠进行攻毒,结果显示小鼠肺部的病毒滴度不及对照组1/100,证实了M2e蛋白具有一定的免疫保护作用,并且M2e提供保护效力的方式主要依赖于细胞毒性T淋巴细胞反应,而非生成中和抗体。M2e只有23个氨基酸大小,作为疫苗的免疫原性比较差。De Filette等用真核转录激活蛋白GCN4的四级结构域作为M2e的载体使其融合表达。Neirynck等用乙肝病毒核心蛋白(HBc)构建了M2e-HBC的融合颗粒。上述两种方式均能提升M2e的免疫原性,并能达到显著的广谱交叉保护作用。

  流感病毒的主要抗原蛋白HA蛋白上具有一段相对保守的茎部区域,由HA2和部分HA1组成。有很多的研究人员对于这段HA的保守区域及交叉保护作用做了广泛的研究。Wang等构建了HA茎部的长α螺旋结构和钥孔血蓝素偶联复合物,使用偶联复合物结合佐剂免疫小鼠后,对H5亚型流感病毒产生了一定的保护作用。同时,有研究发现在接种了基于HA茎部结构域的广谱疫苗的猪中观察到加剧的临床症状甚至死亡,这表明广谱疫苗在猪的临床应用应该更加的谨慎。

  除M2e蛋白和HA蛋白保守的茎部区域外,有研究者用流感病毒的多个保守蛋白联合作用以达到更好的交叉保护效果。以色列BiondVax公司开发了HA、NP、M1蛋白中保守的线性表位组成的通用型流感疫苗,具有很好的交叉保护效果,目前已经进入Ⅱ期临床研究阶段。美国Dynavax公司研制了一种以A型流感病毒中高度保守的NP蛋白和M2e蛋白组成的通用疫苗N8295,也已经进入临床试验阶段。

  除此之外,广谱流感疫苗中还有把多种流行毒株同时制作到疫苗中的多价疫苗,比如用H9亚型毒株和H5亚型毒株制作的二联灭活疫苗。但这种疫苗目前存在以下两点缺陷:第一,只有在疫苗株和流行毒株相匹配的情况下,疫苗才能提供免疫保护效果。第二,几个不同毒株抗原混合免疫时,抗原之间存在竞争效应,导致免疫效果不佳。

  4.4 DIVA疫苗(Differentiating infected from vaccinated animals)

  除弱毒疫苗外,大多数类型的疫苗都可以与DIVA疫苗在免疫程序中组合免疫,这种免疫方式能够有效区分出野毒感染动物和疫苗免疫动物并控制疾病传播。Tumpey等发现在用禽流感病毒灭活疫苗免疫接种的动物中不存在针对非结构蛋白(NS1)的抗体,这种差异可以成为区分病毒感染的生物标记。在利用特定基因或蛋白(HA或NA)构建的DNA疫苗或亚单位疫苗进行免疫时,机体仅诱导针对靶蛋白的特异性免疫应答,可在免疫程序中结合DIVA疫苗进行免疫。Brahmakshatriya等和Rohrs等研制了神经氨酸酶缺失的H5N1禽流感病毒弱毒疫苗,并可用于DIVA策略。荷兰瓦赫宁根大学的研究人员利用H5N1亚型高致病性AIV HA基因和人B型流感病毒NA基因构建了一株重组流感病毒,试验表明,利用该毒株制作的灭活疫苗免疫鸡群后攻毒,鸡群不出现感染H5亚型AIV临床症状并且完全不会排毒。血清学试验表明该疫苗可用于H5亚型AIV的防控,并符合DIVA疫苗的免疫策略。

  第二篇 试验研究

  第二章 H9N2亚型禽流感病毒的全基因克隆和序列分析

  摘 要:对H9N2禽流感病毒进化关系的监测和分析不仅对养禽业的发展至关重要,而且对人类的安全有很大的意义。本研究提取了禽流感病毒分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017的RNA作为模板,反转录为cDNA。通过RT-PCR方法从该禽流感分离株cDNA扩增该毒株的8个vRNA全长片段,并克隆至载体pMD-18T中。经测序得到分离株的全基因序列,并对其变异性、抗原性、遗传进化关系进行分析。

  关键词:H9N2禽流感病毒;全基因克隆;序列分析

  1实验材料和主要仪器

  1.1毒株和菌种

  试验所用毒株禽流感病毒(A/chicken/Shandong/LY1/2017 H9N2)由本实验室于2017年分离、初步鉴定并保存。

  大肠杆菌E.coli.DH5α21由本实验自行保存。

  1.2鸡胚

  10日龄非免疫鸡胚购于南京天邦生物公司。

  1.3主要试剂

  DEPC购买自Solarbio生物科技公司;TaqDNA聚合酶、2000DNA Marker、质粒抽提和DNA片段回收试剂盒、PrimeScriptTMRT Master Mix反转录试剂盒、pMD18-T Vetor Cloning Kit均购买自大连宝日医生物科技公司;低熔点琼脂糖购自上海生工生物工程股份有限公司;化学试剂均为分析纯。

  1.4主要仪器和设备

  PCR仪 德国eppendorf公司

  Centrifuge5804R 型台式高速冷冻离心机 德国 eppendorf 公司

  凝胶成像系统 中国 Tanon 公司

  水平电泳槽 中国 Tanon 公司

  恒温培养摇床 太仓华利达实验设备公司

  无菌操作台 苏净集团安泰公司

  移液器 德国 eppendorf 公司

  CO2 恒温培养箱 美国 Thermo Scientific 公司

  电热恒温水箱 重庆科学仪器厂

  1.5引物设计

  根据NCBI中已收录的H9N2亚型禽流感病毒的全基因组序列作为参考,借助Premier 6.0设计了针对H9N2亚型禽流感病毒8个不同组成片段的基因序列的引物序列,如表1-1所示。

  表1-1 H9N2亚型禽流感病毒各片段PCR引物

  Table1-1 Specific primers for each segment of H9N2

  基因

  片段_x0007_上游引物(5’-3’)_x0007_下游引物(5’-3’)_x0007_产物大小(bp)_x0007__x0007_1_x0007_PB2_x0007_上段:AGCGAAAGCAGGTCAAATATAT CTCTGGTGGAGCTGCTGCAAATGGT

  下段:AGGCATTTCCAAAAGGAATGCAAAG AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTGC_x0007_2341_x0007__x0007_2_x0007_PB1_x0007_上段:AGCAAAAGCAGGCAAACC GAGGTCTTATTTTCTCGATTTTCT

  下段:AGAAAATCGAGAAAATAAGACCTC ACTCCTGCTTGTATTCCCTCA_x0007_2341_x0007__x0007_3_x0007_PA_x0007_上段:AGCGAAAGCAGGTACTGATCC ACTCCCTTCATTATGTATTC

  下段:AACAAGCCAATTGAAGTGGGCACT AGTAGAAACAAGGTACTTTTTT_x0007_2233_x0007__x0007_4_x0007_HA_x0007_AGCAAAAGCAGGGGAATT_x0007_AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTGC_x0007_1742_x0007__x0007_5_x0007_NP_x0007_上段:AGCAAAAGCAGGGTA CCTCTGTTGGTTGGTGTT

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  2.方法

  2.1种毒的繁殖

  将经过初步鉴定A/chicken/Shandong/LY1/2017 H9N2亚型禽流感病毒干粉用无菌5mL生理盐水稀释、混匀,通过尿囊腔途径接种10日龄非免疫鸡胚,每胚0.1mL,在37℃下培养、观察5日,每日照蛋2-4次,弃去24h内的死胚,收获24h~120h的死胚以及120h活胚尿囊液,-80℃保存备用。

  2.2病毒总RNA的提取

  按照Trizol试剂说明书从含收取的尿囊液中提取RNA。具体方法如下:

  取300μL尿囊液加入到1.5mL的DEPC处理过的离心管中,加入700μL Trizol,剧烈振荡混匀,室温静置10min。

  加200μL氯仿,剧烈振荡混匀,室温静置10min。

  于4℃提前预冷的离心机中12000rpm离心10min,提前封口避免污染。

  离心后取上清,加入等体积异丙醇,振荡混匀,于-20℃沉淀30min。

  12000rpm离心15min,离心后弃上清。

  加入400μL提前预冷(4℃)的无水乙醇洗涤,轻轻上下颠倒混匀,12000rpm离心5min。

  弃去上清,瞬离一次,弃去残留的液体,置超净台吹干,约20min。

  吹干后,加入30~50μL的DEPC水吹打混匀,即刻进行反转录,或-80℃保存。

  2.3 cDNA的合成

  按PrimeScriptTMRT Master Mix反转录试剂盒说明对提取的总RNA进行反转录。10μL反转录反应体系为:

  5×PrimeScriptTM RT Master Mix 2µL

  总RNA <500 ng

  RNase Free dH2O up to 10 µL

  反转录反应条件如下:

  37℃反转录反应 15 min

  85℃反转录酶失活反应 5s

  4℃保存

  反转录结束后及时收取cDNA于-20℃保存备用。

  2.4 RT-PCR反应体系和条件的设置

  以cDNA为模板扩增病毒的8个基因片段。PCR反应体系(50μL)如下:

  反应体系组成_x0007_体积(μL)_x0007__x0007_PCR Mix_x0007_25_x0007__x0007_ddH2O_x0007_20_x0007__x0007_上游引物_x0007_2_x0007__x0007_下游引物_x0007_2_x0007__x0007_cDNA_x0007_1_x0007__x0007_PCR程序设置条件如下:

  95℃预变性_x0007_5min_x0007__x0007_95℃变性_x0007_40s_x0007__x0007_52.5℃退火_x0007_50s_x0007__x0007_72℃延伸_x0007_1min30s_x0007__x0007_72℃延伸_x0007_10min_x0007__x0007_循环数_x0007_35_x0007__x0007_

  2.5 PCR产物琼脂糖凝胶电泳和回收

  扩增结束后的PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳。按百泰克胶回收试剂盒说明切胶回收并纯化。

  2.6 大肠杆菌E.coli.DH5α 21感受态的制备

  取出存放于-80℃的DH5α甘油菌液,划线接种到无抗LB平板,37℃培养过夜。

  无菌挑取单菌落到5mL无抗LB液体培养基中,37℃摇床中振荡培养过夜。

  无菌取100μL DH5α菌液至5mL LB培养基中,37℃摇床振荡培养1-2h,至OD600为0.3~0.5。

  将菌液按1mL/管分装到无菌离心管中,于提前预冷至4℃的离心机中5600rpm/min离心5min。

  弃上清,倒尽残液,用500μL 0.1M Cacl2 溶液(提前4℃预冷)重悬菌液,冰浴30min。

  取出冰浴后的离心管,于提前预冷至4℃的离心机中5600rpm/min离心5min,弃上清。

  加200μL冰浴预冷的0.1M Cacl2 溶液重悬菌液,轻柔混匀,4℃放置2h后使用或-80℃存放

  2.7目的基因的连接、转化和克隆

  将回收纯化后的各基因片段PCR产物,按pMD18-T Vetor Cloning Kit(Taraka)试剂盒说明分别与pMD18-T载体连接。步骤如下:

  在制备好的大肠杆菌E.coli.DH5α感受态细胞中加入连接产物10μL,轻轻混匀,冰浴30min。

  再将上一步的混合液42℃水浴热击90sec。热击结束后立即将离心管放入冰块冰浴,静置3min。

  加入700μL的LB培养液,37℃恒温摇床上培养1h。

  取100μL悬液于含有100μg/mL Amp的LB平板上小心涂布均匀,37℃培养12-16h。

  5. 于超净工作台中用无菌接种环挑取单个白色的克隆斑接种至5mL含5μL Amp的LB培养液中,37℃振荡培养过夜。

  2.8 菌液PCR鉴定

  取培养过夜的菌液进行PCR鉴定,并且设置不含菌液模板的阴性对照。25μL PCR体系如下:

  反应体系组成_x0007_体积(μL)_x0007__x0007_PCR Mix_x0007_12.5_x0007__x0007_ddH2O_x0007_10_x0007__x0007_上游引物_x0007_1_x0007__x0007_下游引物_x0007_1_x0007__x0007_菌液_x0007_0.5_x0007__x0007_PCR程序设置条件如下:

  95℃预变性_x0007_5min_x0007__x0007_95℃变性_x0007_40s_x0007__x0007_52.5℃退火_x0007_50s_x0007__x0007_72℃延伸_x0007_1min30s_x0007__x0007_72℃延伸_x0007_10min_x0007__x0007_循环数_x0007_35_x0007__x0007_2.9测序及各基因片段测序结果的拼接、比对、遗传进化分析

  取阳性菌液送南京擎科生物公司测序。利用Lasergene7.1中的Editseq、MegAlign和NCBI的BLAST程序进行序列的比对、剪切和拼接,将A/chicken/Shandong/LY1/2017基因组序列结果上传GenBank数据库。采用NJ法,应用MEGA5.0绘制各个基因片段系统进化树,分析遗传进化关系。

  3.结果

  3.1 H9N2病毒各片段的电泳扩增结果

  从A/chicken/Shandong/LY1/2017禽流感病毒株中成功提取RNA并反转录为cDNA,通过RT-PCR扩增到该株毒株的全部8个基因片段,其中PB2、PB1、PA、NP分两段扩增,HA、NA、M、NS仍为一段。利用BLAST程序与GenBank数据库中查找基因序列的同源序列,将测序结果通过MEGA5、MegAlign等软件比对、剪切、拼接之后,得到A/chicken/Shandong/LY1/2017基因组全长,确定为H9N2亚型禽流感病毒。vRNA片段1~8及其大小如下表所示:

  vRNA_x0007_PB2_x0007_PB1_x0007_PA_x0007_HA_x0007_NP_x0007_NA_x0007_M_x0007_NS_x0007__x0007_大小(bp)_x0007_2341_x0007_2341_x0007_2233_x0007_1742_x0007_1565_x0007_1458_x0007_1027_x0007_890_x0007__x0007_

  序列结果上传至NCBI的GenBank数据库,GenBank数据库登录号为分别为MH018674-MH018681。

  3.2 HA基因遗传进化分析

  3.2.1 HA基因核苷酸及推导的氨基酸同源性分析

  分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017H9N2的HA基因全长1742个核苷酸,有一个完整的开放阅读框,其编码的HA蛋白含560个氨基酸。分离株核苷酸同源性和氨基酸同源性均与A/chicken/Shanghai/F/98株最高,分别为96.3%和99.2%。与参考毒株A/chicken/Jiangsu/7/2002、A/Swine/Jiangsu/C1/2008等株遗传距离非常接近,表明周边省份流行株H9N2 AIV和分离株可能是由一个毒株进化而来。A/chicken/Shandong/LY1/2017H9N2株的HA1部分和HA2部分没有发现核苷酸的插入、缺失,分别含321个氨基酸和221个氨基酸。

  图:分离株与参考毒株HA基因核苷酸同源性比较

  图:HA氨基酸同源性分析

  3.2.2 HA氨基酸变异分析

  3.2.3 HA基因连接肽/信号肽序列分析

  3.2.4HA基因潜在糖基化位点分析

  3.2.5 HA基因抗原位点分析

  3.2.6 HA基因遗传进化树

  图:HA基因遗传进化树

  Fig . Phylogenetic tree for H9N2 HA gene

  3.3 NA基因遗传进化分析

  3.3.1NA基因的同源性分析

  分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017H9N2的NA基因编码区全长1458个核苷酸,有一个完整的开型阅读框,编码的NA蛋白的466个氨基酸。

  图:NA核苷酸同源性分析

  图:NA氨基酸同源性分析

  3.3.2NA的遗传进化树

  图XX NA基因遗传进化树

  Fig XX . Phylogenetic tree for H9N2 NA gene

  3.4 NS基因测序相关结果及遗传进化分析

  图XX NS基因遗传进化树

  Fig XX . Phylogenetic tree for H9N2 NS gene

  3.5 M基因测序相关结果及遗传进化分析

  分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017 H9N2的M基因编码M1和M2两个蛋白。M1开放阅读框由第26-784位的核苷酸组成,编码252个氨基酸。M2开放阅读框经转录后加工拼接而成,由第26-51位和第740-1007位两段共294个核苷酸组成,编码97个氨基酸。

  图XX M基因遗传进化树

  Fig XX . Phylogenetic tree for H9N2 M gene

  3.6 NP基因测序相关结果及遗传进化分析

  分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017 H9N2的NP基因编码区全长1565个核苷酸。

  图XX NP基因遗传进化树

  Fig XX . Phylogenetic tree for H9N2 NP gene

  3.7 PA基因测序相关结果及遗传进化分析

  分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017 H9N2的PA基因编码区全长2233个核苷酸。

  图XX PA基因遗传进化树

  Fig XX . Phylogenetic tree for H9N2 PA gene

  3.8 PB1基因测序相关结果及遗传进化分析

  分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017的PB1基因编码区全长2341个核苷酸。

  图XX PB1基因遗传进化树

  Fig XX . Phylogenetic tree for H9N2 PB1 gene

  3.9 PB2基因测序相关结果及遗传进化分析

  分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017 H9N2的PB2基因编码区全长2341个核苷酸。

  图XX PB2基因遗传进化树

  Fig XX . Phylogenetic tree for H9N2 PB2 gene

  4.讨论

  遗传进化分析显示,试验中A/chicken/Shandong/LY1/2017分离株属于欧亚分支中的A/Chicken/Beijing/1/94亚分支,与华东地区疫苗株A/chicken/Shanghai/F/98-like最为接近。但其内部基因NS来自A/DK/HK/Y439/97亚分支,其余基因均由A/CK/BJ/1/94提供,显示这是一株基因重组病毒。分离株与周边地区H9N2流行株的遗传距离非常接近,他们可能是由同一个毒株进化而来。对A/chicken/Shandong/LY1/2017 HA基因切割位点分析发现,氨基酸组成RSSR↓G,符合低致病性H9N2 AIV的特点。

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