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动物医学类论文 H9N2亚型禽流感、新城疫经典毒株二联灭活疫苗的试制

2018-12-17 14:11:52来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要:本章节试验基于第一章的研究成果,利用第一章节的A/chicken/Shandong/LY1/2017 H9N2亚型禽流感分离株和新城疫经典La Sota株制备了禽流感(H9N2亚型)灭活疫苗、新城疫(La Sota)灭活疫苗、禽流感(H9N2亚型)-新城疫(La Sota)二联灭活疫苗。制备时按照《中华人民共和国兽药典》要求进行毒株EID50检测、HA检测、抗原的灭活检验、疫苗的乳化检验。研究中选取21日龄非免鸡为试验动物,分成4组分别免疫禽流感灭活疫苗、新城疫灭活疫苗、禽流感-新城疫二联灭活疫苗,设立空白对照组。42日龄时进行一次加强免疫。在初免后21天和加强免疫后7天对各组翅静脉采血,分离血清检测各组血清中HI中和抗体水平。二免后10天分离培养各组鸡脾脏淋巴细胞并选用LPS、PHA刺激,采用MTT方法检测各组淋巴细胞增殖能力。同时通过抗原刺激脾脏淋巴细胞后获取细胞上清进行IL-4、IFN-γ细胞因子的检测。结果显示,毒株EID50、HA效价,制成疫苗的无菌检验、乳化检验均符合《兽用生物制品质量标准》(2006-2008)。在HI中和抗体水平检测中,禽流感灭活疫苗和禽流感-新城疫二联灭活疫苗在两次免疫后均能刺激机体产生很高的、无显着差异的AIV中和抗体水平,均高于10log2;新城疫灭活疫苗和禽流感-新城疫二联灭活疫苗在两次免疫后机体NDV HI中和抗体水平为7log2。分离脾脏淋巴细胞培养后,各实验组脾脏分离淋巴细胞增殖能力无显着差异,但均高于空白对照组。IFN-γ细胞因子表达水平各组之间无显着差异,但实验组的IL-4细胞因子表达水平比对照组有轻微提升。综上,试验中研制的禽流感-新城疫二联灭活疫苗能够提供和禽流感灭活疫苗、新城疫灭活疫苗同水平的保护性中和抗体,并能无差异的激活淋巴细胞增殖和轻微提高IL-4为代表的体液免疫水平。禽流感(H9N2亚型)-新城疫(La Sota)二联灭活疫苗能够提供有效的免疫效果,其研制初具成效。

  关键词:禽流感;新城疫;二联灭活疫苗;免疫效果

  材料

  1.1实验动物

  健康、雌性、3~4周龄非免疫鸡购自青龙山养殖场;10日龄非免疫鸡胚由南京天邦公司提供。

  1.2种毒

  A/chicken/Shandong/LY1/2017 H9N2亚型禽流感分离株和经典新城疫病毒La Sota株由本实验室保存;

  1.3主要试剂

  PHA植物凝集素、LPS脂多糖购自Sigema公司;DMSO裂解液购自广东光华科技股份有限公司;脾脏淋巴细胞分离液和MTT购自Solarbio生物科技公司;细胞因子ELISA检测试剂盒(IL-4、FN-γ)购自武汉基因美生物科技公司;3.8%的柠檬酸三钠抗凝剂由本实验室配制;氯化钠、氯化钾、甲醛(40%)等试剂均为分析纯级。

  2.实验方法

  2.1种毒EID50的测定

  H9N2亚型禽流感病毒分离株(A/chicken/Shandong/LY1/2017)和经典新城疫病毒La Sota株分别用无菌PBS液进行10倍稀释成10-6~10-10不同稀释度,每个稀释度重复接种5枚鸡胚,每枚鸡胚接种0.1mL病毒稀释液,以石蜡封口,在37℃下孵育、观察5日,早晚各照蛋1次,弃去24h内的死胚,收获24~120h死胚及活胚尿囊液并观察鸡胚病变。逐个检测尿囊液血凝价,依据Reed-Muench法计算EID50(≥4log2判定为阳性)。

  2.3 H9N2亚型油乳剂灭活疫苗的制备

  2.3.1抗原的灭活及灭活检验

  参考《中华人民共和国兽药典》中的抗原灭活检验方法,分别取部分H9N2亚型禽流感病毒尿囊液和新城疫病毒尿囊液向其中加入终浓度为0.2%的甲醛溶液,并使其充分混合,置于37℃摇床上灭活30h。取灭活完成尿囊液再次以尿囊腔接种途径接种10日龄非免疫鸡胚,每种抗原各接种5枚,0.1mL/枚,早晚各照蛋1次,37℃孵育120h。收获尿囊液并检测血凝价,<3log2判定为阴性,说明病毒已被灭活完全。

  2.3.2 H9N2亚型禽流感灭活疫苗、新城疫灭活疫苗的制备

  参照《兽用生物制品质量标准》(2006-2008),分别向检验合格的H9N2亚型禽流感灭活抗原和新城疫灭活抗原中按1:3的比例加入白油佐剂,充分振荡混匀,使其乳化,待尿囊液和白油充分包容并滴水不散开,即为合格的油乳剂灭活疫苗,定量分装,置于4℃冰箱保存。

  2.3.3 H9N2亚型禽流感和新城疫二联灭活疫苗的制备

  参照超滤管说明书,分别将H9N2禽流感病毒灭活抗原、新城疫病毒灭活抗原用超滤管在离心机中12000rpm/min、离心30min进行超滤浓缩。离心结束后弃去滤过液,收集超滤液并检测其血凝价。取超滤浓缩抗原按照H9N2亚型禽流感病毒灭活抗原:新城疫病毒灭活抗原:白油佐剂=1:1:6的比例乳化,定量分装,置于4℃冰箱保存。

  2.3.3灭活疫苗的乳化检验

  剂型检验:疫苗滴落于干净液面呈聚团状不扩散即为合格。

  稳定性检验:取少量制备完成的疫苗以3000rpm离心15分钟,不会观察到油水分层的现象即为合格。

  黏度检验:室温下吸取1mL左右制备好的疫苗,疫苗自然垂直流出0.4mL的时间限制在8秒内即为合格。

  2.3.4灭活疫苗的无菌检验

  参照《中华人民共和国兽药典》,进行灭活疫苗的无菌检验。从各组灭活疫苗中分别吸取少量疫苗加入无菌的LB液体培养基中,置于37℃摇床(200r/min),灭活30h,检验有无细菌生长。

  2.4实验动物分组和免疫程序

  将21日龄非免疫鸡随机分为4组,每组15只。试验分为空白对照组G1、H9N2亚型禽流感灭活疫苗组G2、新城疫病毒灭活疫苗组G3、H9N2亚型禽流感和新城疫二联灭活疫苗组G4。常规饲养几日,无任何异样,随后对鸡进行免疫。免疫程序如表3-1所示,各疫苗组颈部皮下注射300μL对应灭活疫苗,空白对照组颈部皮下注射300μL PBS。在一免后21d使用相同方法剂量对鸡进行第二次免疫。

  表3-1实验动物分组与免疫程序

  Table3-1 Immune procedure and grouping for chickens

  组别免疫程序动物数量GroupsImmune procedureAnimal amountG1(PBS)初次免疫21天后

  进行加强免疫,

  (每次免疫疫苗剂量为300μL)

  15G2(AIV)15G3(NDV)15G4(AIV+NDV)15

  2.5 HI抗体效价检测

  分别于初免后21天,加强免疫后一周,通过翅静脉采集实验鸡血液样品至1.5mL离心管中。室温静置1h后,置于4℃冰箱过夜。随后5000rpm离心5min收集血清留存,分别检测各组AIV HI抗体效价和NDV HI抗体效价。

  2.6 T淋巴细胞增殖实验

  (1)取出鸡,每组3只,剪颈部血管放血处死,于75%酒精中浸泡,在生物安全柜中取出浸泡后的鸡,采取脾脏组织,后用灭菌PBS液洗涤3次。

  (2)将脾脏包裹尼龙网转移至平皿中,加入PBS 6-8 mL研磨充分;后将平皿中单细胞悬液无菌转移转至15 mL离心管中,1200 rpm离心10 min。

  (3)取压紧的细胞沉淀,参照红细胞裂解液说明书(Solarbio公司)加入红细胞裂解液,吸取淋巴细胞层,弃去其余液体。

  (4)用6-8ml mL无血清RPMI1640清洗淋巴细胞3次,使用含10%血清的1640培养液进行重悬,将细胞悬液浓度调整到3×106/mL。

  (5)将细胞浓度为3×106/mL的细胞悬液以100μL/孔加入96孔细胞培养板中。

  (6)将96孔板中的细胞分别用抗原、LPS(10ng/mL)、PHA(10ng/mL)进行刺激,其中LPS、PHA作为阳性对照,抗原刺激物作为阴性对照。

  (7)将96孔细胞板放入含有5%CO2的37℃恒温培养箱中培养48h~72h。

  (8)在48 h~72h后每孔加入20μL浓度为5mg/mL MTT,混匀后放入含有5%CO2的37℃恒温箱中作用4 h,然后3500 rpm离心5 min,小心弃去上清。加入DMSO 100μL/孔,混匀至黑色晶体溶解,将细胞板放入酶标仪OD570nm读取结果。

  2.7细胞因子检测

  2.7.1样品的采集

  参照实验方法2.6从鸡体内无菌分离脾脏制备成淋巴细胞细胞悬液(3×106/mL)。在24孔细胞培养板中加入500 mL单细胞悬液,加入刺激物放于37℃恒温箱中孵育48h。孵育完毕后收集培养液上清,放于-70℃冰箱保存。

  2.7.2试剂盒检测细胞因子

  严格按照武汉基因美公司IFN-γ、IL-4细胞因子ELISA检测试剂盒说明进行实验操作。具体步骤如下

  (1)标准品的稀释:于96孔包被板上设置标准品孔10孔,按要求浓度倍比稀释成制作标准曲线所需标准品浓度。

  (2)加样:分别设立空白孔、待测样品孔。待测样品孔中先后加入40μL稀释液和10μL样品。

  (3)温育:封板膜封板后置37℃恒温箱孵育30 min。

  (4)配液:用蒸馏水稀释适量30X浓缩液洗涤液。

  (5)洗涤:于洗板机中洗涤5次,拍干。

  (6)加酶:于样品孔中加酶标试剂50μL/孔。

  (7)温育:同试验步骤3。

  (8)洗涤:同试验步骤5。

  (9)显色:避光条件下每孔先后加入A、B显色剂,混匀后,37℃恒温避光显色15分钟。

  (10)终止:每孔加终止液50μL,终止反应。

  (11)测定:酶标仪中以450 nm波长读取测量各孔的吸光度。

  3.实验结果

  3.1 EID50检测结果

  逐个检测收取鸡胚尿囊液血凝价,依据Reed-Muench法计算EID50(≥4log2判定为阳性)。结果如表3-2所示。

  表3-2:EID50测定结果

  Table3-2 The results of EID50

  VirusEID50/100μLA/chicken/Shandong/LY1/20178.5La Sota7.5

  3.2 HA检测

  种毒纯化后检测尿囊液血凝价以及超滤浓缩后血凝价检测结果,如表3-3所示。

  表3-3血凝价HA

  Table 3-3血凝价HA

  AIVNDV超滤浓缩前2927超滤浓缩后2122103.3感染鸡胚病理症状

  3.4灭活疫苗稳定性评价

  3.5血清HI抗体检测结果

  对一免后采取的各组血清和二免后采取的各组血清分别检测其H9N2亚型禽流感HI抗体水平和新城疫HI抗体水平,得到H9N2 AIV灭活疫苗、La Sota株NDV灭活疫苗以及禽流感和新城疫二联灭活疫苗对实验鸡血清中AIV和NDV HI抗体水平产生效果比较结果,如图2-1所示。结果显示,H9N2亚型禽流感-新城疫二联灭活疫苗组和AIV疫苗组相比,AIV HI抗体水平无显着差异,一免、二免AIV HI抗体效价均达到了6log2,且二免后AIV HI抗体效价达到了10log2个滴度。H9N2亚型禽流感-新城疫二联灭活疫苗组和NDV疫苗组相比,NDV HI抗体水平无显着差异,一免、二免NDV HI抗体效价达到了6log2、7log2,具有一定的保护力度。

  图3-1受免鸡血清中HI抗体水平比较

  Fig 3-1 Comparison of HI antibody levels in chickens serum

  3.6 T淋巴细胞增殖实验结果

  使用MTT比色法检测AIV灭活疫苗、NDV灭活疫苗、AIV-NDV二联灭活疫苗对淋巴细胞增殖的影响情况。结果如图3-2所示,AIV-NDV二联灭活疫苗组分别和AIV灭活疫苗组、NDV灭活疫苗组相比,淋巴细胞增殖能力无显着差异。

  图3-2不同免疫组脾脏淋巴细胞增殖能力结果

  Fig3-2 The results of spleen lymphocyte proliferation in different immunization groups

  3.7细胞因子IFN-γ、IL-4检测结果

  按照试剂盒说明书对血清中Th1型(IFN-γ)和Th2型(IL-4)细胞因子进行检测,结果显示:AIV-NDV二联灭活疫苗组分别和AIV灭活疫苗组、NDV灭活疫苗组相比,IFN-γ、IL-4表达水平均无显着差异。其中,各疫苗组IL-4表达水平相对于PBS组有所增强,但未达到显着水平。(图3-3)

  图3-3不同免疫组脾脏淋巴细胞IFN-γ、IL-4表达水平结果

  Fig 3-3 The expression of IFN-γand IL-4 in splenic lymphocytes from different immunization groups

  4.讨论

  试验中研制的禽流感-新城疫二联灭活疫苗能够提供和禽流感灭活疫苗、新城疫灭活疫苗同水平的保护性中和抗体,并能无差异的激活淋巴细胞增殖和轻微提高IL-4为代表的体液免疫水平。禽流感(H9N2亚型)-新城疫(La Sota)二联灭活疫苗能够提供有效的免疫效果,其研制初具成效。

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