周一至周五 | 9:00—22:00

期刊论文网 > 农业论文 > 畜牧、动物医学论文 > 动物医学研究类论文 鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验

动物医学研究类论文 鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验

2018-12-14 11:32:57来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要:传统的动物诱癌试验方法需要花大量的人力物力与时间,一般需两年左右才能得出结论,显然无法满足现今社会的需要。然而从肿瘤生化方向、核酸的研究、分子生物学以及细胞生物学、遗传学领域中涌现出一批各有其适用范围和优缺点的试验方法,Ames试验至今已成为国际上通用的遗传毒理学评价体系的必须检测项目,同时也是许多遗传毒理学新兴技术发展过程中对照验证结果的试验之一,在化合物的致突变性和潜在致癌性的初步检验中广泛应用。Ames试验又称为鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验,试验利用鼠伤寒沙门氏菌变异型菌株,即一系列组氨酸缺陷型菌株,测定受试药物诱导细菌回复突变的能力,以判断受试药物对遗传行为的影响。IST-7003为新型饲料添加剂。为了解该产品在使用过程中的安全性,本试验进行新型饲料添加剂IST-7003的鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验。试验中,IST-7003每皿剂量在1 mg ~0.0016 mg范围内,有或无代谢活化系统(S9)时,4种鼠伤寒沙门氏菌试验株的每皿平均回变菌落数均在溶剂(DMSO)对照的两倍以内,未见剂量-反应关系,两次试验结果一致。表明IST-7003对鼠伤寒沙门氏菌无致突变性。

  关键词:鼠伤寒沙门氏菌;致突变性;IST-7003

  综述

  引言

  鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验(Ames试验),在待测物中加入一组组氨酸营养缺陷型菌株,在微粒体活化系统有或没有的条件下,观察发生回复突变的特征来鉴定化学物质的诱变活性,已成为初步筛选化学物潜在致突变的首选方法。本次试验多研究的IST-7003是一种新型饲料添加剂,实验以大鼠为实验对象,通过点试验法进行阳性对照,再进行预实验,从而用平板渗入法进行正式试验。

  2、定义

  2.1回复突变(Reversemutation)

  细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。

  2.2基因突变(Genemutation)

  在化学致突变物作用下细胞DNA中碱基对的排列顺序发生变化。

  2.3碱基置换突变(Basesubstitutionmutation)

  引起DNA链上一个或几个碱基对的置换。

  碱基置换有转换(transition)和颠换(transversion)两种形式。

  转换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘧啶所替代,或一个嘌呤被另一嘌呤所代替。颠换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘌呤所替代,或一个嘌呤被另一嘧啶所代替。

  2.4移码突变(Frameshiftmutation)

  引起DNA链上增加或缺失一个或多个碱基对。

  2.5鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验(Salmonellatyphimurium/reversemutationassay)

  利用一组鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型试验菌株测定引起沙门氏菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的组氨酸缺陷型(his-)转变为原养型(his+)回复突变的试验方法。

  3、原理

  鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸,所以在组氨酸缺乏的培养基上,只有少数自发回复突变的细菌生长。假如存在致突变物,则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型,因此能形成菌落并且生长,根据这现象来判断受试物是否为致突变物。即利用是否能引起鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型(hisˉ)菌株的回复突变来区别突变的类型(置换或移码突变),并能判断化学物质是否诱变剂和致癌剂。(如图a图b所示)

  需要说明的是:通过代谢活化某些化学物质才有致变作用,因为细菌缺乏这种酶系统,故把诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液加入在测试系统中,可增加检测的灵敏度,同时弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。

  图a图bb

  注:图a和图b分别为未加入致突变物质的培养皿和加入致突变物质的培养皿,两培养皿中的菌株均为鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)的组氨酸营养缺陷型(his-)菌株。可以看出,在含微量组氨酸的培养基中,除极少数自发回复突变的细胞外,一般只能分裂几次,形成在显微镜下才能见到的微菌落(图a)。而在受诱变剂作用后,大量细胞发生回复突变,自行合成组氨酸,发育成肉眼可见的菌落(图b)。鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关,故此法现广泛应用于致癌物的筛选。

  4、试验方法

  4.1诱变试验:

  在缺乏组氨酸的底层培养基上试验用菌不能生长成菌落,而经致癌/诱变剂作用,在有(或无)代谢活化系统条件下,可回变(逆向突变)为原养型,在组氨酸缺乏的情况下,可生长出菌落。根据回变菌落的总体情况,判断受试物的致癌/诱变性。其具体作法如下:

  4.1.1定量试验(平板渗入法)

  (1)完全溶解顶层琼脂,加入无菌0.5mML、组氨酸、0.5MD、生物素溶液,再混匀后加入少量组氨酸,可以使所有细菌分裂几次。

  (2)将顶层琼脂分装于灭菌试管中,每管2-3m1,450C恒温。

  (3)依次加入0. lml菌液,0.1m1(或以下)受试物溶液,如果需要再加入S-9混合液0.5m1于2~3m1的45℃顶层琼脂中。

  (4)迅速摇匀,倾注于底层琼脂板上铺平。

  S-9混合液45℃下保持数秒钟即可以影响活性,而试验用菌在45℃保持几分钟不受任何影响,故(3), (4)两步应尽量20秒钟内完成。

  (5)静置数分钟待凝,1小时之内将平皿放入无光37℃培养箱中培养48小时。

  (6)计数每平皿回变菌( His +)查数,若超过自发回变率2倍以上即表明被试物有诱变性。顶层琼脂中受试物浓度与His十菌数有一定量的关系,但此法不能测定细菌的生存数,检测致死作用强的诱变/致癌物时,只有在一个十分狭窄的浓度变化范围内,才能发现His菌落数随着受试物浓度的增加而增加,因此,需要配制不同浓度级受试物溶志方能获得剂量反应关系,一般用x 2, x 5, x 10, x 20倍稀释液进行实验,仅在药物致死效应可以葱略的范围内,直线关系才成立。对任何一个阳性受试物都应取剂量反应曲线(直线关系)这一段报告每平皿的His十菌落数。

  4.2定性试验(点试法):

  测示未知诱变物,一般首先采用此法,然后再用定量试验确定其诱变性和诱变率。具体作法与定量实验大部分相同,唯一不同是受试物不加入顶层琼脂,而取少量受试物溶液(大约10微升)或晶体加在含成验菌和S-9混合液(或无)的顶层琼脂某点上;也可加在6mm直径滤纸片上,再置于顶层琼脂表面。最好待顶层琼脂凝后立即加受试物。37℃培养48小时,若在试点周围出现一抑制圈,圈外有大量回变菌落(超过自发回变率若干倍)即为阳性结果。点试法最简便,特别适宜于大量筛选,它不需制备被测物溶液,亦可测定非完全无菌的标本。通过试点周围抑制圈范围的大小以及回变情况,了解被侧物对细菌约毒性作用、是否需要S-9混合液代谢以及是否具有诱变性等。虽然点试法非常有用,但有着明显的局限性,有些物质如道诺霉素等用本法效果不佳,可能是琼脂对这类被试物的吸收不好有关。它只能测示在琼脂中能弥散的物质,并且在任何情况均仅少量细菌与被测物接触,故敏感性不如标准渗入法。一般认为只有在试点周围菌落数超过自发回变若干倍才算阳性结果,而Ames认为只有通过标准渗入试验证明了它的剂量反应曲线,才能确认具有诱变性。

  正文

  Ames试验又称为鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验,试验利用鼠伤寒沙门氏菌变异型菌株,即一系列组氨酸缺陷型菌株,在有或无活化系统的条件下测定受试药物诱导细菌回复突变的能力,以判断受试药物对遗传行为的影响。在含微量组氨酸的培养基中,除极少数自发回复突变的细胞外,一般只能分裂几次,形成在显微镜下才能见到的微菌落。而在受诱变剂作用后,大量细胞发生回复突变,自行合成组氨酸,发育成肉眼可见的菌落。IST-7003为新型饲料添加剂。为了解该产品在使用过程中的安全性,本试验进行新型饲料添加剂IST-7003的鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验。

  5、 材料与方法

  5.1 试剂

  IST-7003,批号:2014080904,由广州英赛特生物技术有限公司提供。前期试验结果表明, 该受试物LD50为1000 mg/kg。4℃密封保存备用。

  标准诱变剂:叠氮化钠、2-氨基芴、敌克松,均为分析纯。

  一般试剂:磷酸氢钠胺、枸椽酸、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钠、氯化钾、氯化镁、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、二甲基亚砜、D-生物素、L-组氨酸、葡萄糖、6-磷酸葡萄糖、还原型辅酶Ⅱ、琼脂粉、牛肉膏、胰胨等,均为分析纯试剂。

  5.2 仪器设备

  双人单面超净工作台、JA2003电子天平、SZ-2自动双重蒸馏器、 QYC-200C空气恒温摇床、D98-9052B-2隔水式电热恒温培养箱、YXQ.SG41.280手提式压力蒸汽灭菌器、微量移液器(10 µL、100 µL、200 µL、1000 µL)、超低温冰箱(-80 ℃)、Centrifuge 5415R高速冷冻离心机、电热恒温水浴箱、D98-9052B-2电热恒温培养箱、菌落计数器、培养皿等。

  5.3. 培养基及试剂配制

  5.3.1 营养肉汤培养基

  成分: 牛肉膏 2.5g

  胰 胨 5.0g

  氯化钠 2.5g

  磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O) 1.3g

  加蒸馏水至 500.0mL

  加热溶解,用1N氢氧化钠溶液调pH至7.4,分装后于0.103MPa下高压灭菌20min。4℃冰箱保存备用。

  5.3.2 营养肉汤琼脂培养基

  成分: 琼脂 1.5g

  营养肉汤培养基 100.0mL

  加热融化后,用1N氢氧化钠溶液调pH至7.4,于0.103MPa下高压灭菌20min。趁热无菌倒入平皿(直径90mm),约25 mL/皿,待冷却凝固后,37℃培养过夜去除表面水分并检查有无污染,4℃冰箱保存备用。

  5.3.3 底层培养基

  ① 磷酸盐贮备液(V-B盐贮备液)

  成分: 磷酸氢钠胺(NaNH4HPO4·4H2O) 175.0g

  枸椽酸(C6H8O7·H2O) 100.0g

  磷酸氢二钾(K2HPO4) 500.0g

  硫酸镁(MgSO4·7H2O) 10.0g

  加蒸馏水至 1000.0mL

  配制:先将前三种成分加热溶解后,再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中,加蒸馏水至1000mL。于0.103MPa下高压灭菌20min。4℃冰箱保存备用。

  ② 40%葡萄糖溶液

  成分: 葡萄糖 400.0g

  加蒸馏水至 1000.0mL

  配制:加少量蒸馏水加温溶解葡萄糖,再加蒸馏水至1000mL。于0.068MPa下高压灭菌20min。4℃冰箱保存备用。

  ③ 底层琼脂培养基

  成分: 琼脂粉 7.5g

  蒸馏水 485.0mL

  磷酸盐贮备液 10.0mL

  40%葡萄糖溶液 5.0mL

  配制:首先将前两种成分于0.103MPa下高压灭菌20min后,再无菌加入后两种成分,充分混匀倒底层平皿(直径90mm),约25 mL/皿,待冷却凝固后,37℃培养过夜去除表面水分并检查有无污染,4℃冰箱保存备用。

  5.3.4 顶层培养基

  ① 0.5mmol/L组氨酸-生物素溶液

  成分: L-组氨酸(MW 155) 78.0mg

  D-生物素(MW 244) 122.0mg

  加蒸馏水至 1000.0mL

  配制:将上述成分加热,以溶解生物素,然后在0.068MPa下高压灭菌20min。4℃冰箱保存备用。

  ② 顶层琼脂培养基

  成分: 琼脂粉 1.2g

  氯化钠 1.0g

  加蒸馏水至 200.0mL

  配制:上述成分混合后,于0.103MPa下高压灭菌30min。4℃冰箱保存备用。临用前加热融化,无菌加入0.5mmol/L组氨酸-生物素溶液20mL。混匀后无菌分装于灭菌小试管中,每管2 mL,45℃水浴中保温待用。

  5.3.5 10%S9混合液配制

  ① 1.65mol/L氯化钾溶液

  成分: 氯化钾(KCl) 61.5g

  加蒸馏水至 500.0mL

  配制:在水中溶解上述成分后,于0.103MPa下高压灭菌20min。4℃冰箱保存备用。

  ② 0.4mol/L氯化镁溶液

  成分: 氯化镁(MgCl2·6H2O) 40.7g

  加蒸馏水至 500.0mL

  配制:在水中溶解上述成分后,于0.103MPa下高压灭菌20min。4℃冰箱保存备用。

  ③ 0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)

  成分: 磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O) 2.965g

  磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 29.015g

  加蒸馏水至 500.0mL

  配制:溶解上述成分后,于0.103MPa下高压灭菌20min。4℃冰箱保存备用。

  ④ 0.025mol/L辅酶Ⅱ(氧化型)溶液

  成分: 辅酶Ⅱ(MW 743.4) 0.93g

  加蒸馏水至 50.0mL

  配制:溶解上述成分后,过滤除菌。-20℃以下冰箱保存备用。

  ⑤ 0.05mol/L葡萄糖-6-磷酸溶液

  成分: 葡萄糖-6-磷酸(MW 304.1) 0.76g

  加蒸馏水至 50.0mL

  配制:溶解上述成分后,过滤除菌。-20℃以下冰箱保存备用。

  ⑥ 10%S9混合液

  每10 mL10%S9混合液由以下成分组成,临用时无菌操作配制。

  0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4) 6.0mL

  1.65mol/L氯化钾溶液 0.2mL

  0.4mol/L氯化镁溶液 0.2mL

  0.05mol/L葡萄糖-6-磷酸溶液 1.0mL

  0.025mol/L辅酶II溶液 1.6mL

  大鼠肝S9 1.0mL

  将上述试剂置冰浴中预冷,然后用灭菌移液器和移液管按体积依次取出各成份加入一支预冷的灭菌试管(15 mL)中,混匀,置冰浴中待用。实验结束,剩余S9混合液应该丢弃。

  5.4 菌株鉴定用和特殊用途试剂

  5.4.1 组氨酸-生物素平板

  底层培养基 914.0mL

  磷酸盐贮备液 20.0mL

  40%葡萄糖溶液 50.0mL

  灭菌组氨酸水溶液(0.4043g/100mL) 10.0mL

  灭菌0.5mmol/L生物素溶液 6.0mL

  配制:以上成份均已分别灭菌。底层培养基加热融化后,将灭菌40%葡萄糖,磷酸盐贮备液和组氨酸溶液加入,混匀。待溶液稍为冷却后,加入灭菌生物素,混匀,浇制平板。

  1.4.2 氨苄青霉素平板和氨苄青霉素/四环素平板

  底层培养基 910.0 mL

  磷酸盐贮备液 20.0mL

  40%葡萄糖溶液 50.0mL

  灭菌组氨酸水溶液(0.4043g/100mL) 10.0mL

  灭菌0.5mmol/L生物素溶液 6.0mL

  氨苄青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/LNaOH中) 3.15mL

  四环素溶液(8mg/mL于0.02mol/L HCl中) 0.25mL

  配制:底层培养基加热融化后,将无菌的葡萄糖、磷酸盐贮备液和组氨酸-生物素溶液加入,混匀。冷却至大约50℃,无菌条件下加入四环素溶液和/或氨苄青霉素溶液。

  四环素溶液仅在使用对四环素有抗性的TA102菌株时加入。

  5.5 试验菌株及其生物学特性鉴定

  5.5.1 试验菌株

  采用TA97、TA98、TA100和TA102一组标准测试菌株,由江苏省疾病控制中心提供。菌株储存于-80 ℃。试验菌于37 ℃水浴振荡培养24 h,4 ℃保存。

  5.5.2 增菌培养

  取营养肉汤培养基5mL,加入无菌试管中,将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内,37℃振荡(100次/min)培养10h。该菌株培养物应每毫升不少于1~2×109活菌数。

  5.5.3 生物学特性鉴定

  试验前进行菌株的生物特性鉴定。采用鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验(GB 15193.4-2003)标准判断法进行试验菌株的生物学特性和自发回变菌落数的检测,试验结果表明,TA97、TA98、TA100和TA102一组标准测试菌株均符合表3-1的生物学特性要求。

  5.6 大鼠肝微粒体酶的诱导和S9的制备

  选择健康雄性成年SD大鼠2只,体重200~220g,采用多氯联苯(Aroclor1254)作为诱导剂,多氯联苯溶于玉米油中,浓度为200 mg/mL,按500 mg/kg b.w.无菌操作一次腹腔注射。动物诱导后每天给予正常的饮食和饮水,诱导后第5日颈椎脱臼处死动物,处死前12 h停止饮食,正常饮水。

  按GB 15193.4-2003方法制备S9。配制75%酒精4000 mL分装于两只有盖大口容器内,将颈椎脱臼处死的动物放入1#容器内用75%酒精(0-4 ℃)消毒动物皮毛5 min,再将动物捞出放入2#容器内继续用75%酒精(0-4 ℃)消毒动物皮毛5 min,在无菌室超净工作台内,剖开腹部,取出肝脏,去除肝脏的结缔组织,用无菌的0.15 mol/L氯化钾溶液(0 ℃)淋洗肝脏5次,按每克肝脏加入无菌的0.15 mol/L氯化钾溶液(0 ℃)3 mL。用组织匀浆器(20 000 r/min,1 min)制成肝匀浆,在4 ℃条件下,以9000 g离心10 min,取其上清液(S9)分装于无菌塑料管中,每管1 mL,经无菌检查、蛋白含量测定、生物活性鉴定合格后-80 ℃保存备用。

  表3-1 试验菌株鉴定的判断标准

  菌株组氨酸

  缺 陷脂多糖

  屏障缺陷R因子

  (抗氨苄青霉素)uvrB

  修复缺陷抗四环素自发回变

  菌落数(-S9)TA97++++-90-180TA98++++-30-50TA100++++-120-200TA102+++-+240-320注“+”表示需要组氨酸“+”表示

  抑制带“+”表示具有

  R因子“+”表示

  无修复能力“+”表示有

  四环素抗性

  5.7 样品处理和试验方法

  IST-7003对大鼠LD50为1000 mg/kg。依据受试物的理化性质,试验时先制备IST-7003:试验前称取0.1 g IST-7003白色粉末平铺于称量纸上放置于无菌工作台紫外杀菌2h,试验时将其溶于10 mL 二甲基亚砜(DMSO)中,递次稀释至所需浓度,现用现配。

  按GB15193.4-2003鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)方法,检测样品致突变性。

  5.8 阳性对照

  点试验法。按每张纸片饱和吸水量为0.01 mL计,加S9 TA97、TA98、TA100、TA102菌株均用2-乙酰氨基芴(2-AF),浓度为2 mg/mL,不加S9 TA97、TA98菌株用敌克松浓度为5 mg/mL,TA100菌株用4-硝基喹啉-N-氧化物1 mg/mL,TA102菌株用甲基磺酸甲酯0.2 mL/mL。平板掺入法试验加S9 TA97、TA98、TA100、TA102菌株均用2-乙酰氨基芴(2-AF),浓度为100 μg/mL(10 μg/100 μL·皿);不加S9 TA97、TA98用敌克松,浓度为0.5 mg/mL, TA100用4-硝基喹啉-N-氧化物,浓度为5 μg/mL,TA102用甲基磺酸甲酯,浓度为10 μL /mL。

  5.9 预实验

  预实验采用点试法。将50 mg/mL设为受试药物每个点的最高剂量,再按5倍递次稀释,下设4个剂量组,即10、2、0.4、0.08 mg/mL,另外设阴性(溶剂)对照组及相应的阳性对照组。

  每个剂量分别加S9(+S9)和不加S9(-S9)两个系列,设2个平行平皿。

  受试药物溶液每皿点样10 µL,按设定的最高剂量,确定受试药物溶液需配置的最高浓度和需配制的体积。计算配制溶液需称取/量取受试药物的量。

  准确称取IST-7003提取物0.5 g于试剂瓶内,加入适量DMSO溶解,转入10 mL容量瓶内,混匀定容至10 mL。即得预实验最高剂量组所需的受试药物溶液。分取足量供最高剂量组试验用,剩余溶液用DMSO进行5倍递次稀释,可获得其余几个剂量组所需的受试药物溶液。

  取备用底层培养基平皿128个,分4个菌株重复,每个重复8组,每组4个平皿,在平皿上做好标记。取已融化并在45 ℃水浴中保温的顶层培养基一管(2 mL),用灭菌移液管加入测试菌株增菌液0.1 mL(+S9组同时加10%S9混合液0.5 mL),迅速混匀,倒在底层培养基上,移动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上,平放固化,取直径6 mm的灭菌滤纸圆片小心贴放在已固化的顶层培养基中心位置,用移液器吸取10 µL受试药物(或阳性对照物)小心点在纸片上,37 ℃培养48 h,观察结果。

  归纳5个递减剂量对4个试验菌株的预试验结果。结果显示,IST-7003提取物未出现明显抑菌圈,根据剂量设计原则受试药物最高剂量设为50 mg/mL(5 mg /100μL·皿),以下再设4个剂量组。每个剂量组均做三个平行平板。按GB15193.4-2003中“鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验”方法,检测样品致突变性。

  5.10正式试验(平板掺入法)

  5.10.1 剂量组设计

  将1mg/100μL·皿确定平板掺入法试验的最高剂量,下设4个剂量组,另外设阴性(溶剂)对照组及阳性对照组。每个剂量分加S9(+S9)和不加S9(-S9)两个系列,设3个平行平皿。

  5.10.2 受试药物溶液配制

  每皿加入受试药物溶液体积0.1 mL,按设定的试验最高剂量10 mg/mL,确定受试药物溶液需配制的最高浓度和需配制的体积。计算配制溶液时需称取受试药物的量。准确称取受试药物0.1g于试剂瓶内,加入适量DMSO溶解,转入10 mL容量瓶内,混匀定容至10 mL。即得试验最高剂量组所需的受试药物溶液。分取足量供最高剂量组试验用,剩余溶液用DMSO进行递次稀释,可获得其余4个剂量组所需的受试药物溶液。

  5.10.3 试验操作

  取备用底层培养基平皿192个,分4个菌株重复,每个重复8组,每组6个平皿,在平皿上做好标记。取已融化并在45 ℃水浴中保温的顶层培养基一管(2 mL),用移液管依次加入受试药物溶液0.1 mL,测试菌液0.1 mL(+S9组同时加入10%S9混合液0.5 mL),迅速混匀,倒在底层培养基上,转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上,平放固化,37 ℃培养48 h,观察结果。如第一次平板掺入法试验结果阴性,需再重复一次试验;如第一次平板掺入法试验结果阳性,需再重复两次试验。

  5.10.4 试验结果判断

  整理各次试验结果,菌株回变菌落数表述为()/皿。试验结果列表。

  如阴性对照组每皿自发回变菌落数在正常范围内,试验组每皿回变菌落数增加1倍以上(即试验组回变菌落数等于或大于阴性对照组回变菌落数的2倍),并有剂量-反应关系或至少某一测试点有重复的并有统计学意义的阳性反应,即可认为该受试药物为诱变阳性;当试验组受试药物浓度达到1 mg/100μL·皿,每皿回变菌落数与阴性对照组比较无统计学差异,可认为是诱变阴性。

  5.11 结果评价

  阳性结果至少进行三次重复测试,阴性结果至少进行二次重复测试,才能对受试药品作出最终评价判定。受试药物的点试法试验结果要用平板掺入法进行确证。

  如果受试药物对4种菌株(加S9和不加S9)的平皿掺入试验均得到阴性结果,可认为此受试药物对鼠伤寒沙门氏菌无致突变性。如受试药物对一种或多种菌株(加S9或不加S9)的平皿掺入试验得到阳性结果,即认为此受试药物是鼠伤寒沙门氏菌的致突变物。

  6、试验结果

  两次重复试验结果见表3-2和表3-3,4种试验用鼠伤寒沙门氏菌株菌苔生长正常,阳性对照试验,各菌株反应合格。IST-7003每皿剂量在1 mg ~0.0016 mg范围内,有或无代谢活化系统(S9)时,4种鼠伤寒沙门氏菌试验株的每皿平均回变菌落数均在溶剂对照的两倍以内,未见剂量-反应关系,两次试验结果一致。表明IST-7003对鼠伤寒沙门氏菌无致突变性。

  7、 试验结论

  本试验结果显示,阳性对照组各菌株回变菌落平均数均超过其相应阴性对照组回变菌落平均数的二倍以上,证实鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型突变菌株对受试物的检测有效;而各菌株每剂量组回变菌落平均数均未超过其相应阴性对照组回变菌落平均数的二倍,显示IST-7003在有、无S9的情况下均无诱变活性。

  表3-2 IST-7003的鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验结果±SD(第一次)

  组别TA97TA98TA100TA102-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S95 mg /皿154.33±11.93149.67±36.6738.00±2.6539.33±6.51170.00±2.00162.33±9.87277.33±16.77268.67±14.471 mg /皿158.67±2.31134.00±9.1742.33±9.8736.33±5.03168.33±8.02158.33±6.51284.67±4.16270.67±4.510.2 mg /皿144.00±4.36154.00±19.0841.00±7.0032.67±1.53168.33±4.16164.67±8.33276.33±8.02268.67±11.930.04 mg /皿147.33±23.01159.67±7.3740.00±3.0045.33±2.08154.33±13.58148.33±4.04269.67±10.97257.67±5.510.008 mg /皿156.33±10.69155.67±6.3537.00±2.0041.67±5.03162.33±4.93140.00±4.36271.00±9.64263.67±5.69DMSO141.00±8.67128.67±35.1041.00±6.0040.00±5.57163.00±17.6146.00±7.00267.33±21.36274.67±16.26阳性对照敌克松(50μg)2-AF(10μg)敌克松(50μg)2-AF(10μg)NaN3 (1.5μg)2-AF(10μg)甲基磺酸甲酯(1.0μl)2-AF(10μg)>20001398.00±87.68932.00±57.17>2000>2000>2000392.67±12.86392.67±12.86组别TA97TA98TA100TA102-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S95 mg /皿154.33±11.93149.67±36.6738.00±2.6539.33±6.51170.00±2.00162.33±9.87277.33±16.77268.67±14.471 mg /皿158.67±2.31134.00±9.1742.33±9.8736.33±5.03168.33±8.02158.33±6.51284.67±4.16270.67±4.510.2 mg /皿144.00±4.36154.00±19.0841.00±7.0032.67±1.53168.33±4.16164.67±8.33276.33±8.02268.67±11.930.04 mg /皿147.33±23.01159.67±7.3740.00±3.0045.33±2.08154.33±13.58148.33±4.04269.67±10.97257.67±5.510.008 mg /皿156.33±10.69155.67±6.3537.00±2.0041.67±5.03162.33±4.93140.00±4.36271.00±9.64263.67±5.69DMSO141.00±8.67128.67±35.1041.00±6.0040.00±5.57163.00±17.6146.00±7.00267.33±21.36274.67±16.26阳性对照敌克松(50μg)2-AF(10μg)敌克松(50μg)2-AF(10μg)NaN3 (1.5μg)2-AF(10μg)甲基磺酸甲酯(1.0μl)2-AF(10μg)>20001398.00±87.68932.00±57.17>2000>2000>2000392.67±12.86392.67±12.86注:阳性对照物后括号内对照物剂量为(μg /100μl·皿或μl /100μl·皿),下同。 试验编号:FA20150519 第 页 共 23 页

  表3-3 IST-7003的鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验结果 ±SD(第二次)

  组别TA97TA98TA100TA102-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S95 mg /皿157.00±4.36152.00±23.5838.67±3.5133.33±2.52163.33±23.69160.33±10.41281.33±23.03267.33±23.861 mg /皿151.00±14.11128.33±7.3739.67±5.5137.67±6.03171.00±7.55166.00±3.00279.33±1.53264.33±8.960.2 mg /皿155.67±6.66152.33±17.7935.67±4.1638.67±2.52169.00±1.00165.33±10.07270.67±6.66277.67±9.020.04 mg /皿166.33±3.06154.67±8.3342.67±3.2136.00±3.61159.33±9.29141.33±3.51271.00±13.23264.00±14.110.008 mg /皿164.00±6.25145.67±8.9641.33±3.2144.67±6.66164.67±8.33145.33±7.23272.00±13.00267.67±12.42DMSO 134.00±38.30131.00±30.4543.33±2.5241.00±4.00156,33±14.98138.67±11.68263.00±22.11263.33±6.66阳性对照敌克松(50μg)2-AF(10μg)敌克松(50μg)2-AF(10μg)NaN3 (1.5μg)2-AF(10μg)甲基磺酸甲酯(1.0μl)2-AF(10μg)>2000939.33±15.53>2000>2000>2000>2000>2000393.33±5.86

  7、 试验结论

  本试验结果显示,阳性对照组各菌株回变菌落平均数均超过其相应阴性对照组回变菌落平均数的二倍以上,证实鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型突变菌株对受试物的检测有效;而各菌株每剂量组回变菌落平均数均未超过其相应阴性对照组回变菌落平均数的二倍,显示IST-7003在有、无S9的情况下均无诱变活性。

栏目分类