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最新动物医学类论文 TLR3基因在鸭组织器官中表达情况

2018-12-13 11:08:24来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘 要

  目的:禽类Toll样受体及TLR3基因的研究已经取得了一定的进展,但还有待深入,尤其是鸭TLR3基因的相关研究。本研究以贵州某鸭场健康鸭为实验检测对象,旨在通过实时荧光定量PCR技术对鸭TLR3基因表达量进行检测分析,掌握TLR3基因在鸭组织器官中表达情况。方法:以5只50日龄贵州某鸭场健康鸭为实验对象,取其肝脏、肾脏、脾脏、气管、心脏、肺脏、胰脏、肌肉、十二指肠和脑作为实验材料。本实验根据GenBank上鸭TLR3基因和β-actin基因设计特异性引物,以β-actin基因为内参基因,采用实时荧光定量PCR对所取健康鸭10个机体组织TLR3基因表达量进行检测分析。利用Excel对数据结果进行作图,试验数据统计表结果用“平均数±标准误(⎯X±SEM)”表示。目的基因相对表达量采用2-△△Ct方法计算。结果:TLR3基因mRNA在健康实验鸭所检测组织中有着不同程度表达,TLR3基因表达量最高的是肝脏,其余表达量由高到低依次是肾脏、脾脏、气管、心脏、肺脏、胰脏、肌肉、十二指肠和脑。

  关键词:Toll样受体 TLR3基因 实时荧光定量PCR

最新动物医学类论文 TLR3基因在鸭组织器官中表达情况

  1 前言

  1.1 Toll样受体的研究进展及简述

  Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)是1988年Hashimoto C 等在对果蝇胚胎发育过程中的研究时首次发现的。随后,Toll受体的同源物在哺乳动物中相继被发现,构成Toll样受体(TLRs)家族。相关的研究不断跟进,尤其在20世纪90年代,Toll样受体的相关研究取得了很大的进展,其中在Toll样受体的结构、Toll样受体的配体、Toll样受体在信号通路中的研究取得了突破性的进展。比如1996年,在Lemaitre B 等报道出Toll具有抗真菌感染的作用的研究中,发现Toll-突变的成虫果蝇极其容易感染真菌,且能提示免疫系统,尤其是天然免疫系统。1997年Medzhitov R 等在哺乳动物中发现了能诱导炎症应答基因的表达的第一个果蝇Toll的同源物(现命名为TLR4)。1998年Poltorak 等报道了不同品系的小鼠Toll的同源物(TLR4基因)突变对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)呈低反应性。在后期的研究中,相继发现了Toll受体的同源物,逐步完善了Toll样受体(TLRs)家族成员。

  1.2 TLR3基因的研究进展

  TLRs分布于20余种细胞中,Muzio M等在对TLR1-TLR5表达于人类白细胞的研究中发现TLR3只特异性表达于树突状细胞(den-dritic cells,DC)。研究表明,TLR3属于表面模式识别受体(PRR),TLR3主要识别病毒双链RNA( dsRNA) 与合成的聚肌胞苷酸poly( (I/C ),TLR3基因具有抗病毒感染功能。经研究分析显示,chTLR3的配体与哺乳动物类的TLR3配体之间具有一定的相似性,且chTLR3能够特异性地识别dsRNA。

  1.3 TLR3基因研究的主要目的与意义

  通过几十年的Toll样受体研究,已经为TLR3基因的研究奠定了一定的基础,TLR3的应用具有良好的前景,但对TLR3的研究还有待深入,希望能为顽固性的耐抗生素的感染性疾病、感染性休克和自身免疫系统性疾病的治疗、新型疫苗的制备及肿瘤的免疫治疗提供新的思路。

  2材料

  2.1实验动物

  试验用鸭5只50日龄健康鸭,购自贵州某鸭场。

  2.2主要试剂

  DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水、 PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)、SYBR Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)、MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒,宝生物工程(大连)有限公司;异丙醇、三氯甲烷、无水乙醇,北京化工厂;

  2.3 主要仪器

  离心机(3K18),Sigma;

  Bio-radIQ5伯乐荧光定量PCR仪,美国Bio-Rad公司;

  微量分光光度计:Thermo NANODROP 2000,美国GE公司);

  紫外分光光度计(Q-5000),Quwell;

  高压灭菌锅(AMA440N),英国Astell;

  颗粒制冰机(100s),太仓市科教器材厂;

  -20 ℃ 冰箱(BCD-215KCF),Haier公司;

  -80 ℃ 冰箱(MDF-382E),SANYO公司;

  超净工作台(SW-CJ-2D),苏州净化设备有限公司;

  恒温水浴锅(HW.SY11-K),北京长风仪器仪表公司;

  自动双重纯水蒸馏器(SZ-93 型),上海亚荣生化仪器厂;

  离心管、PCR管、移液枪、吸头、500ml量筒、500ml锥形瓶等耗材,上海生物工程技术服务有限公司。

  3 方法

  3.1 引物设计与合成

  3.1.1 TLR3和β-actin荧光定量PCR引物设计与合成

  从GenBank获得TLR3和β-actin的mRNA序列,利用引物设计软件Primer 5.0,各设计一对特异性引物并命名为qtlr3和qβ-actin。经过Blast分析,引物序列具有特异性。所用的引物如表1所示。引物委托鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。

  表 1 引物序列

  Table. 1 primer sequence

  目的基因引物序列(5’-3’)qtlr35'-CTTGGAACGAAAGAGAA-3'5'-CAATAGAAAGTGGAGCA-3'qβ-actin5'-CTACAGCTTCACCACCACAGCC-3'5'-GCTGTGGCCATCTCCTGCTCAA-3'3.1.2 引物的溶解与稀释

  合成引物成品一般为白色固体粉末,附着在离心管壁,直接打开极易散失。所以打开管盖之前需进行离心,经2000 rpm 离心2 min后使引物粉末聚于管底,慢慢打开管盖后按说明书计入一定量的灭菌ddH2O使其浓度为100 μm,于震荡器上充分震荡混匀,低速离心后于4℃过夜溶解,-20℃保存。为避免污染,使用前进行稀释为10 μm后分装,4℃保存。

  3.2 RNA提取及cDNA合成

  3.2.1 总RNA提取

  分别采集试验动物大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、腿肌、气管和十二指肠共 10 个组织,迅速置于液氮冻存,待用。收集组织完毕后运用TaKaRa Mini BEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒进行RNA的提取,具体操作步骤如下:

  剪取适量组织与研钵中充分研磨,研磨过程中加入液氮。向已经研磨成粉末状的组织中加入一定量的裂解Buffer RL(使用前请确认已加入50×DTT Solution),使裂解液均匀混合于组织表面并裂解细胞,然后使用移液枪反复吹打使其充分混匀。将含有细胞的裂解液转移到EP中,并用移液枪反复吹吸裂解液至裂解液中没有明显沉为止。

  将充分裂解后的裂解液室温避免强光照射静置2 min。

  取出gDNA Eraser Spin Column放置于2 mL的Collection Tube(试剂盒提供)上。

  将裂解液用移液枪移入到gDNA Eraser Spin Column中。

  12000r,离心1 min。

  丢弃gDNA Eraser Spin Column,往含有滤液的2 mL Collection Tube管中加入相同体积的70 %乙醇,用移液枪反复吹打将溶液混合均匀。

  迅速将混合液(含沉淀)全部转入到RNA Spin Column(含2 mL Collection Tube)中。(如果混合液的体积大于600 μL,请分批加入,每次加入的体积不能大于600 μL)。

  12000 r,离心1 min,倒掉滤液。再将上一步的RNA Spin Colum放回到2 mL Collection Tube中。

  向RNA Spin Column管中加入500μL的Buffer RWA,12000 r离心30s,倒掉滤液。

  再向RNA Spin Column中加入600μL的Buffer RWB,12000 r离心30s,倒掉滤液。加样前先确认Buffer RWB中已经加入了指定体积的100%乙醇。加样时应沿RNA Spin Column管壁四周缓慢均匀加入Buffer RWB,使沾附于管壁上的盐份完全冲洗下去,保证实验的准确度。

  DNase I消化:利用试剂盒中的gDNA Eraser Spin Column以及RNA Spin Column可以有效地去除培养细胞中绝大部分的基因组DNA,提取的RNA一般不含基因组DNA,从而达到纯化RNA的效果。若后续实验对RNA纯度要求比较严格,可以选择性地在RNA Spin Column 膜上进行DNase I消化。

  ① DNase I反应液的配制:取5μL 10×DNase I Buffer,4μL Recombinant DNaseI(RNase free,5 U/μL),41μL RNase free dH2O加入到新的1.5 mL RNase Free Tube中,混合均匀。

  ② 用移液枪往RNA Spin Column膜中央缓慢加入50μL DNase I反应液,室温避免阳光直射静置15min。

  ③ 再用移液枪往RNA Spin Column膜中央缓慢加入350μL Buffer RWB,12000 r离心30s,去掉滤液。

  重复操作步骤10。

  将RNA Spin Column重新安置于2 mL Collection Tube上,12000 r离心2min。

  将RNA Spin Column安置于1.5 mL的RNase Free Collection Tube(试剂盒提供)上,在RNA Spin Column膜中央处缓慢加入50-200μL的RNase Free dH2O或0.1% DEPC处理水,室温静置5min。

  离心机12000 r离心2min洗脱RNA。

  如果要提高RNA的收量,可再向RNA Spin Column膜中央缓慢加入50-200μL RNase Free dH2O或0.1% DEPC处理水洗脱RNA;若要得到高浓度的RNA,可以将第一次的洗脱液重新加回至RNA Spin Column中,室温下静置5min,12000 r离心2min洗脱RNA。

  3.2.2 RNA的质量检测

  将提取的总RNA在NanoDrop-2000 浓度测定仪测定浓度和OD 260/280比值,每个样品测三次取平均值。OD260/280值在1.8~2.0范围内时,说明所提取的RNA纯度较高,OD260/280值低于1.8时,说明RNA中存在蛋白质污染,OD260/280值高于2.0时,说明RNA已经发生了降解。浓度值(conc)会在设置后由系统直接显示。

  3.2.3 cDNA的合成

  以已经提取的用DNase处理的总RNA为模板,使用PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time),反转录试剂盒进行cDNA的合成。具体操作步骤如下:

  配制RT反应液(反应液配制请在冰上进行):向0.5mL离心管依次加入2.0 μL 5×

  PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time),2.0 μL Total RNA,6.0 μL RNase Free

  ddH2O,总体积10.0 μL。

  (2) 轻柔混匀后进行反转录应,条件如下:

  37℃ 15 min(反转录应),85℃ 5 sec(反转录酶的失活应),4℃ 保存。

  3.3 荧光定量PCR反应体系及程序

  3.3.1荧光定量PCR反应体系

  在成功获得试验动物大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、腿肌、气管和十二指肠等10 个组织cDNA后,本试验采用10 µL体系,具体组分如下:

  Maxima SYBR Green/ROX QPCR Master Mix(2X)5 µl上游引物(10 µm)0.5 µl下游引物0.5 µlcDNA模板1 µlddH203 µl总体积10 µl 将以上组分加入0.2 mL八连管中,且在操冰上操作,然后用小型离心机短暂离心,使反应液置于管底。每个样品做3个重复。混匀后立即置PCR仪中按程序反应。

  3.3.2荧光定量PCR反应程序

  本试验反应程序按照荧光染料SYBR Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书进行两步法反应,其具体步骤如下,反应程序:预变性Initial denaturation 95℃ 30s;变性Denaturation 95℃ 5 s、退火Annealing 55℃ 30 s共设置40个循环。在退火同时进行荧光采集,并且完成溶解曲线的采集,温度范围应设为60~95℃,台阶温度应设为0.5℃,荧光采集时间应设为5 s。

  3.4 数据处理

  采用SPSS 18.0 软件单因素方差分析对数据进行统计分析,利用Excel对数据结果进行作图,试验数据统计表结果用“平均数±标准误(⎯X±SEM)”表示。目的基因相对表达量采用2-△△Ct方法计算,计算公式如下:

  目的基因相对表达量=2-△△Ct;

  △△Ct=(处理组目的基因Ct值–处理组β-actin Ct值)–(对照组目的基因Ct值–对照组β-actin Ct值)

  4 结果

  4.1 实时荧光定量PCR产物特异性及扩增效率分析

  对目的基因及内参基因进行荧光定量检测,观察其扩增结果见图1、图2。

  β-actin基因溶解曲线均为单峰,无引物二聚体及非特异性扩增产物出现,说明所设计引物特异性良好;扩增曲线均呈“S”形、拐点清晰、基线平缓且无上扬趋势,说明动力学线性整体平行性较好。

  图1 β-actin基因荧光定量PCR相关曲线

  Fig.1 Curves of real-time PCR for β-actin gene

  TLR3基因基因溶解曲线均为单峰,无引物二聚体及非特异性扩增产物出现,说明所设计引物特异性良好;扩增曲线均呈“S”形、拐点清晰、基线平缓且无上扬趋势,说明动力学线性整体平行性较好。

  图2 TLR3基因荧光定量PCR相关曲线

  Fig. 2 Curves of real-time PCR for TLR3 gene

  综上所述,由2个基因的相关曲线,可认为β-actin基因、TLR3基因2个基因可用于2-△△Ct相对定量分析。

  4.2 TLR3基因的组织表达谱

  采用β-actin基因作为内参基因,利用荧光定量仪(Roche Sweden)进行实时荧光定量PCR反应。利用Fold = 2–ΔΔCt 计算基因的相对表达量,得到TLR3基因在不同组织器官中的相对表达量。

  用实验鸭各个织器官的TLR3基因与β-actin内参基因进行实时荧光定量PCR反应,以心脏中的表达量作对照组,用Fold = 2–ΔΔCT法计算TLR3基因在健康实验鸭各组织器官中的相对表达量,结果见表2。以各组织名称为横轴,相对表达量为纵轴,绘制出TLR3基因组织表达谱,结果见图3。

  表2 TLR3基因在各组织的相对表达

  Fig.2 The relative expression of TLR3 gene in different tissues

  组织心脏肝脏脾脏肺脏肾脏相对表达量1.00±0.00Dd23.21±0.73Aa4.57±0.40Cc0.71±0.02Dd9.72±1.13Bb组织脑胰脏肌肉气管十二脂肠相对表达量0.54±0.03Dd0.92±0.04Dd0.60±0.22Dd4.50±0.04Cc0.94±0.09Cc注:肩标不同大写字母表示纵向差异极显著(P<0.01),相同表示无差异极显著。肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同表示无差异显著

  图 3 TLR3在不同组织基因表达差异

  Fig. 3 The relative expression of TLR3 gene in different tissues

  TLR3基因mRNA在健康实验鸭所检测组织器官中均有表达,表达量从高到低依次为肝脏、肾脏、脾脏、气管、心、十二指肠、胰脏、肺脏、肌肉和脑,分别是对照组的23.21、9.72、4.57、4.50、1、0.94、0.92、0.71、0.60和0.54倍。运用SPSS 18.0将TLR3基因在各组织的表达量进行比较,发现肝脏、脾脏、肾脏及气管均高于其余各组,差异极显著(P < 0.01)。

  5 讨论

  5.1 关于荧光定量检测方法的建立

  荧光定量PCR技术是将DNA荧光结合染料或特异性荧光探针加入到PCR反应体系中,利用产生的荧光信号强弱来实时监测整个PCR过程。SYBR Green I能够与任何一种双链DNA结合而发出荧光,其特异性完全取决于扩增引物。根据试验所需数据的不同,常用的两种分析方法是绝对定量和相对定量。所谓绝对定量是指通过己知浓度的标准品绘制标准曲线,然后推算待测样品的拷贝数;相对定量是指在一定样本中靶序列相对于参照样本的量的变化,无需知道其在样本中具体的拷贝数。

  本实验采用SYBR Green I荧光嵌合染料法用相对定量检测鸭TLR3基因 mRNA的相对表达量。分析试验所得溶解曲线可知扩增产物呈现特异性良好的单峰,没有其它杂峰,表明引物的特异性较好。相对定量法是通过内参基因β-actin基因来消除mRNA在提取和反转录效率上的差异,即保证结果的准确性又节省了检测的时间,但此方法需要内参基因和目的基因的扩增效率具有一致性或相似性。运用实时荧光定量PCR研究目的基因mRNA转录水平时,需要确保所提取的总RNA无基因组DNA的污染。

  5.2关于TLR3基因mRNA表达水平研究

  TLR 作为模式识别受体,通过识别不同的 PAMPs,引起一系列胞内信号的级联反应而启动机体的免疫反应。随着基因组学的发展,人们发现 TLR 在昆虫、线虫、植物、鱼类、哺乳动物及鸟类的进化上相对保守。然而,由于不同的物种TLR功能可能存在差异的同时,不同物种的TLR的mRNA在不同组织的表达量也可能存在差异。本研究通过实时荧光定量的方法研究了TLR3的mRNA在鸭不同组织中的相对表达量,为TLR3在禽类抗病原体感染过程中的作用机理研究打下基础。

  经过本实验,4.2中结果表明,TLR3基因mRNA在健康实验鸭所检测的10个组织器官中均有表达,在肝脏中的表达量最高;其余表达量由高到低依次为肾脏、脾脏、气管、心脏、肺脏、胰脏、肌肉、十二指肠、脑,在脑中的相对表达量最低(仅为0.54±0.03Dd)。研究发现,人TLR3mRNA 在脑、心、肺、胎盘、肌肉和胰腺中有广泛表达,且在胎盘和胰腺中的有高丰度表达。健康鹅TLR3 mRNA 在的各个组织有广泛分布,在胰腺组织中表达量最高,其次是脾脏、十二指肠和肺脏,而在肌肉(胸肌)和皮肤中表达量较低。

  可能是由于物种间的差异性以及不同组织器官所具有的免疫功能不同,因而本研究中TLR3基因的mRNA在组织分布上与其他物种存在差异,TLR3在鸭上的研究还比较欠缺,本实验为鸭源及禽类TLR3基因的进一步研究及其运用奠定了一定的基础。

  6 结论

  经过缜密的实验操作,和精确的实验数据的分析,得出以下结论:

  由图1、图2可清楚的看出β-actin基因和TLR3基因溶解曲线均为单峰,无引物二聚体及非特异性扩增产物出现,说明所设计引物特异性良好;扩增曲线均呈“S”形、拐点清晰、基线平缓且无上扬趋势,说明动力学线性整体平行性较好。有力的证明了本实验的真实可靠性。

  表2和图3可直接看出健康实验鸭10个实验组织器官中TLR3基因的相对表达量,肝脏中的相对表达量最高,其相对表达量为23.21±0.73Aa;脑中的相对表达量最低,其相对表达量为0.54±0.03Dd。

  健康实验鸭TLR3基因mRNA所检测的10个组织器官中均有表达,在肝脏中的表达量最高;在肾脏、脾脏、气管中的相对表达量次之;在心脏、肺脏、胰脏、肌肉、十二指肠表达量较低;在脑中的相对表达量最低。

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