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动物医学论文 ELISA检测DEV感染后鸭ILs表达情况

2018-12-12 11:18:00来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要

  目的:目前有关三穗鸭白介素研究的资料较少。本研究以三穗鸭细胞因子为检测对象,旨在通过定量ELISA检测分析鸭瘟(DEV)感染后白细胞介素在鸭体血清中的表达变化,为动物的白介素研究提供一些基础资料。方法:将健康鸭采用腿部肌肉注射接种DEV病毒液,每只0.1 ml。于第0h、6h、18h、30h、48h、72h、96h、120 h、168h采集血液样本备用。血液采集后进行提取离心,收集上清保存于﹣20℃冷冻备用。待所有实验材料收集完毕,按鸭定量分析ELISA试剂盒说明书操作步骤进行实验,用酶标仪检测血清中细胞因子的OD450nm值,记录并处理数据,采用SPSS 18.0 软件单因素方差分析统计分析数据,利用Excel对数据结果作图,试验数据统计表结果用“平均数±标准差(`x±SD)”表示。结果:IL-2在6h时,分泌水平最高,为89.37,120h时分泌水平达最低,为33.72。IL-8在6h时分泌水平最高,为22.13,96h时达到最低,为0.69。IFN-γ在6h分泌水平达高峰为21.73,在120h最低为1.66。结论:在DEV感染的鸭血清中,IL-2、IL-8、IFN-γ的分泌呈现先升高后降低再升高的动态变化趋势。

  关键词:DEV,细胞因子,ELISA,检测,表达

  1前言

  1.1 DEV病毒与细胞因子

  鸭瘟(DP)又名鸭病毒性肠炎(DEV),是引起鸭、鹅等水禽类的一种急性、热性、接触性传染病。DP的病原是鸭瘟病毒(DPV),是属疱疹病毒科的病毒,是一种全身性泛嗜性感染的病毒。成熟完整DP病毒的结构包括含双股DNA、核衣壳、外膜和囊膜。鸭瘟临诊主要表现为发热、下痢、流泪、双脚麻痹,部分病鸭头颈部明显肿大,俗称“大头瘟”。该病易感成年鸭和母鸭,死亡率高,雏鸭感染后死亡率相比较低。DEV由Baudet于1923年在荷兰首次报道,我国首次发现DEV是1957年在广州。贵州省鸭瘟发病率和死亡率很高,且各地域都有发生,对养鸭业造成巨大的经济损失。

  细胞因子是因抗原或致病因子刺激相关免疫细胞或相关细胞而产生的具有调节细胞功能的一类高活性多肽或蛋白质分子,不包括补体、免疫球蛋白和一般生理性细胞。细胞因子能参与机体免疫应答反应、促进炎症反应、抗病毒及抗肿瘤,细胞因子能对疾病起到有效的治疗作用,而且是抵抗感染必不可少的物质。近年来, 人们逐渐意识到了细胞因子在疾病防治中的重要意义,随着对细胞因子的不断研究和分子生物学技术的日益发展,大量的细胞因子得以快速克隆和定性分析,将许多细胞因子制成基因工程药物,给治疗疾病提供了新的手段,带来了巨大的经济利益和社会效益,但畜禽细胞因子的研究还较为落后,很少用于临床应用。本次实验研究的是IL-2、IL-8、IFN-γ在DPV感染鸭源后的表达情况,主要以研究这三种细胞因子的动态变化趋势为目的。

  1.2 本研究的目的和意义

  细胞因子在抗感染中发挥着重要的作用,近年来细胞因子在病毒感染中的作用日益受到关注,细胞因子在动物体的表达调控研究也越来越多,目前有关鸭细胞因子在抗病毒感染方面的研究资料较少。本研究以三穗鸭细胞因子为检测对象,旨在通过定量ELISA检测分析DEV感染后细胞因子在鸭体血清中的表达变化,以期为细胞因子的研究提供一些基础资料,也为我省鸭瘟的防御治疗做出贡献。

  2 实验材料与方法

  2.1 实验材料

  2.1.1 实验动物

  健康的60日龄的三穗鸭40只,购自贵州某鸭场。

  2.1.2 实验试剂

  鸭肠炎病毒GZ株(DEV-GZ),由贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室提供;鸭源细胞因子酶联免疫分析(ELISA)检测试剂盒,购自武汉基因美公司。

  2.1.3 实验仪器及用品

  离心机(3K18),Sigma;﹣20 ℃ 冰箱(BCD-215KCF),Haier公司;酶标仪(SUNRISE),瑞士TECAN公司;离心管,一次性采血针,真空采血管等耗材,上海生物工程技术服务有限公司。

  2.2 实验方法

  2.2.1 人工感染及样本采集处理

  将40只60日龄健康鸭观察7d无异常后,采用腿部肌肉注射接种DEV病毒液,0.1 ml/只。于第0、6、18、30、48、72、96、120 h、168h采集血液样本备用。

  将采集的血液样本放置室温下自然凝固一段时间,离心10分钟(2000-3000转/分),收集上清。血液样本采集后尽早进行提取,若不能马上进行试验,可将样品放于﹣20℃冷冻储存,保存过程中若出现沉淀,应再次离心,但应避免反复冻融。

  2.2.2 样本中三种细胞因子的检测

  收集各时间段实验鸭血清,通过定量ELISA方法测定血清中IL-2、IL-8和IFN-γ细胞因子含量。按照定量分析酶联免疫检测试剂盒说明书操作进行检测:在前10孔将标准品稀释,稀释浓度为5个梯度,每个梯度2孔,分别为180 pg/mL,120 pg/mL,60 pg/mL,30 pg/mL和15 pg/mL,同时设空白对照孔两个,再加待检样品,根据说明书进行操作,用酶标仪测定OD450nm值,根据此值绘制相应的细胞因子标准曲线。

  绘制标准曲线:OD值为纵坐标,标准物浓度为横坐标。样品的浓度可用检测出的样品OD值对应标准曲线查出相应的浓度,再乘以稀释倍数;或将样品的OD值带入标准曲线的直线回归方程式,计算出样品的浓度后乘以稀释倍数,即为样品实际浓度。

  3 实验结果

  感染DEV后,于第0h、6h、18h、30h、48h、72h、96h、120h、168h采集血清,用鸭IL-2、IL-8、IFN-γ的ELISA定量试剂盒检测,结果见表1。

  表1 血清中IL-2、IL-8、IFN-γ检测结果 (`x±SD) (pg/ml)

  时间细胞因子IL-2IL-8IFN-γ0h55.31±0.64ABb5.3±0.06ABab2.44±0.05Bb6h89.37±24.7Aa22.13±1.23Aa21.73±0.85Aa18h61.67±12.51ABa7.97±1.29 ABab4.61±0.42 Bb30h59.23±6.81 ABab11.51±1.16 ABab5.80±0.40 Bb48h53.11±3.65 ABa9.72±1.04 ABab2.08±0.08 Bb72h37.46±4.28Bc13.56±0.33 ABab3.27±0.15 Bb96h35.81±2.11Bc0.69±0.13Bb1.83±0.02 Bb120h33.72±8.47Bc2.78±0.25Bb1.66±0.09 Bb注:肩标不同大写字母表示纵向差异极显著(P<0.01),相同表示无差异极显著。肩标不同小写字母表示差异性显著(P>0.05),相同表示无差异显著。

  168h73.56±9.51ABab6.67±1.39ABab10.83±0.68ABb

  3.1 DEV感染后IL-2的水平变化趋势

  感染DEV后不同时间段血清中IL-2分泌水平均有变化。6h时达到最高,与0h时差异极显著(P<0.01);18h时开始逐渐下降,且与6h时差异极显著(P<0.01);120h时分泌水平达最低,之后开始回升;168h时较高,与6h时差异显著(P<0.05),与其他时间段分泌水平差异极显著(P<0.01),其整体趋势为0h至6h升高,6h至120h降低,120h至168h再次升高。(见图1)

  图1 感染DEV后IL-2在血清中分泌水平变化

  3.2 DEV感染后IL-8的水平变化趋势

  感染DEV后不同时间段血清中IL-8分泌水平均有变化。6h时最高,与0h时差异极显著(P<0.01);18h时下降,且与6h时差异极显著(P<0.01),18h到72h之间呈上升趋势;96h时达到最低水平,且与96h之前任何时段差异极显著(P<0.01),此时开始升高,升至168h时与0h时差异无显著性。(见图3)

  图2 感染DEV后IL-8在血清中分泌水平变化

  3.3 DEV感染后IFN-γ的水平变化趋势

  感染DEV后不同时段血清中IFN-γ分泌水平均有变化。6h时达到最高,与0h时差异极显著(P<0.01);18h时开始下降,且与6h时差异极显著(P<0.01),18h到120h之间呈整体较平稳下降趋势;120h后开始升高,至168h时与6h时和其他各时段差异极显著(P<0.01)。

  图3 感染DEV后IFN-γ在血清中分泌水平变化

  4 分析与讨论

  4.1 DEV诱导后IL-2、IL-8、IFN-γ表达结果的分析

  检测细胞因子的方法有生物活性检测法,酶联免疫吸附试验(ELISA),放射免疫法,免疫荧光试验,分子杂交试验,逆转录多聚酶链反应法等。目前,检测细胞因子最常用的免疫学方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)。本实验采用定量ELISA检测方法。因其成本低,仪器小,自动化高,操作简易时间短,没有放射性成分,并且能够应用于数量较多的细胞因子的检测。在ELISA试验中,用酶标仪测出被检物质所吸收的光密度,即OD值,是反映被检物质含量的重要参数。

  本实验0h为正常对照组,在6h时,IL-2分泌水平升至最高,与0h时差异极显著(P<0.01),IL-8分泌水平也升至最高,与0h时差异极显著(P<0.01),IFN-γ分泌水平达到最高,与0h差异极显著(P<0.01)。自18h开始,IL-2分泌水平开始下降至120h时最低,在168h时达到除6h时的第二高峰。IL-8分泌水平在6h到18h呈大幅下降,18h自72h呈较小的上升趋势,96h时分泌水平最低且与96h之前任何时间段差异极显著(P<0.01),之后明显升高,但168h分泌水平与0h差异不显著。IFN-γ分泌水平在6h后下降至120h达最低水平,之后呈上升趋势,168h的分泌水平依然与6h时差异显著,也与0h的分泌水平差异显著。整体得出:IL-2在0h至168h间呈先上升后下降再上升的变化趋势,IL-8、IFN-γ在0h至168h呈上升、下降、上升、下降、上升的变化趋势。

  查阅相关研究文献,任小交将鸭甲肝BDA型病毒感染原代鸭胚成纤维细胞后检测到IL-2和IFN-γ在6h-72h分泌水平呈上调状态,在96h呈下降状态,并存在差异显著性。王爱国将传染性法氏囊病病毒感染4周龄健康雏鸡以荧光定量RT-PCR检测发现IL-2和IFN-γ在3-7d呈上升状态,随后持续下降,出现免疫抑制状态。李素[8]的研究中表明猪瘟病毒感染血管内皮细胞后IL-8分泌水平持续上调在第4d上调至42倍,随后呈下调态势至第8d降到10倍,而IFN-γ的转录水平在感染前后都保持恒定。而在刘温泉的研究中,新城疫强毒株(BDF48E9株)和弱毒株(BDLasota株)均能让IFN-γ高效表达,呈先上调后下调的趋势,Lasota株能诱导IL-2高效表达,F48E9株却不能诱导IL-2的表达。何青将猪繁殖与呼吸综合征病毒的强弱两只毒株诱导猪肺泡巨噬细胞产生的IL-8的水平略高于对照组,但差异不明显,且在两毒株感染组之间差异也不明显。

  上述提到的研究表明,在病毒诱导下,各细胞因子的表达水平因病毒的种类不同、强弱不同、感染动物种类及生理状态不同、表达组织不同、表达时间不同而各具差异,但细胞因子一旦有所表达都基本呈上调、下调、上调的规律。与上述参考文献结果进行比较,本实验对DEV诱导感染后IL-2、IL-8、IFN-γ的检测结果与上述文献中病毒诱导感染IL-2、IL-8、IFN-γ表达趋势的研究所得结果基本一致。

  4.2 DEV诱导对IL-2、IL-8、IFN-γ表达影响的讨论

  目前,对DEV的研究多为其病原学研究和快速检测方法的研究,而对细胞因子的研究多为其在机体生长代谢和免疫应答方面的研究,病毒感染后细胞因子的表达和功能的研究较欠缺。本实验选取的研究对象IL-2、IL-8、IFN-γ在机体免疫应答反应中各有其重要意义,如:鸭的IL-2能够刺激鸭的淋巴细胞增生,能增强异嗜性粒细胞的吞噬作用,是免疫反应中主要的免疫因子。IL-2能促进T细胞的生长发育和凋亡。IL-2还能促进B细胞的增殖、分化以及分泌抗体。IL-8可促进炎症细胞的活化、聚集和释放炎症介质,可直接刺激发热中枢引起体温增高,IL-8还有趋化中性粒细胞到炎症部位,加重炎症症状的作用。IFN-γ可诱导单核细胞、巨嗜细胞、树突状细胞、皮肤成纤维细胞、血管内皮细胞等MHC II类抗原的识别过程IFN-γ可使B细胞增殖分化,促使其产生抗体,促进NK细胞的杀伤活性等。

  本研究通过免疫学酶联吸附实验(ELISA)定量分析DEV感染后血清中IL-2、IL-8、IFN-γ不同时间段的分泌水平。从整个实验结果推论,导致血清中细胞因子在规定时间范围内先上升后下降再上升的原因可能是:在DEV感染初期(0h至6h),病毒刺激机体产生相应的免疫应答反应,该时期鸭瘟病毒诱导刺激机体激活相关免疫程序,调动和增强相关免疫细胞的功能,免疫因子和免疫细胞被活化和释放,各免疫细胞发挥最大作用,同时各免疫反应得到促进,机体积极抵抗病毒的感染,且病毒数量还相对较低,导致细胞因子含量较高,水平大幅上升且偏高,与0h对照组差异极显著(P<0.01);之后因病毒进入血液循环,以及机体的免疫细胞和各种细胞因子对病毒有了一定的抵制消除作用,使细胞因子水平下调(6h至96h或6h至120h),后期因病毒大量增殖,再次刺激机体产生强烈的免疫应答反应,细胞因子水平再度升高(96h或120h至168h)。使整个观察时间段内三种细胞因子的分泌水平动态变化成了倒“S”状。

  4.3 细胞因子在动物抗病毒感染中的研究

  抗病毒的细胞因子一般主要有两种作用机制:一,直接作用于细胞产生抗病毒蛋白,例如IFN-γ、IFN-α、IFN-β等;二,既可以刺激细胞产生抗病毒蛋白又可以通过免疫调节有效抑制病毒的复制,包括IL-2等的白细胞介素类。随着细胞因子的产生和相互作用对机体防御疾病有着越来越重要的意义,国内外对细胞因子在病毒感染中表达调控、功能、作用机制等的研究也越来越多。如:李秀丽等研究了鸭坦布苏病毒(DTMUV)感染不同日龄雏鸭后,检测鸭血清中相关细胞因子的动态变化,及其在不同日龄雏鸭中的差异性。李金磊证实了猪细小病毒(PPV)感染外周淋巴细胞(PBMC)后可引起干扰素及相关细胞因子、凋亡相关细胞因子、炎性细胞因子mRNA 分泌水平发生显著变化,且从细胞因子方面探讨了 PPV 的致病机制。干扰素诱导的跨膜蛋白( IFITMs)具有抗病毒的作用,陈永坤等研究了IFITMs的分类、抗病毒作用以及潜在的抗病毒作用机制。有研究表明微RNA(miRNA) 是定量调控细胞因子基因表达的重要因素。研究药物对病毒感染中细胞因子表达的调控也越来越多。另外,有研究发现,一些病原会导致免疫抑制的原因可能是IL-2等细胞因子分泌水平降低或表达不正常。IL-2还能作为免疫佐剂提高疫苗免疫效果。在病毒感染实验中,研究者不仅仅局限于常见细胞因子,还有越来越多的不常见的细胞因子以及新近发现的细胞因子被发现在病毒的免疫应答反应中有重大意义。不同的病毒感染后各细胞因子的活跃程度不同,但它们有着一定的相互关系。

  本实验成功在DEV感染后鸭血清中检测到IL-2、IL-8、IFN-γ不同时段的分泌水平,但对其中的发生机制以及三种细胞因子的功能和作用机制有待进一步的探索。细胞因子间的调控网格和作用机制十分复杂,了解细胞因子在抗病毒感染过程中的意义和相互作用还需大量的研究工作。

  5 结论

  本实验的结论是:在DEV感染的鸭血清中,检测出IL-2、IL-8、IFN-γ不同时段的分泌水平呈现先升高后降低再升高的动态变化趋势,最高分泌水平和最低分泌水平呈差异极显著(P<0.01)。说明鸭IL-2、IL-8、IFN-γ都参与了对DEV的免疫应答反应。

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