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动物医学类论文 FI16在金葡菌呼吸道感染中作用的初步研究

2018-12-09 13:29:19来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要

  目的 干扰素诱导蛋白16是P200 (亦称HIN200),作为多功能效应蛋白参与细胞生长、分化、衰老、凋亡,作为天然DNA 感受器则参与细胞天然、被动免疫反应等过程。据研究表明,IFI16 及其炎症小体的形成与机体对抗病原菌感染具有密切联系。金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)肺炎是急性的肺部感染,是由金葡菌所引起的呼吸道感染。在病情相对比较严重的情况下,会出现极高的病死率。由此,本实验目的是初步研究IFI16在金葡菌呼吸道感染中的作用。方法 通过建立小鼠肺炎感染模型,进行荷菌量分析、观察肺组织病理变化、Western Blot检测磷酸化IRF3蛋白的表达、MPO活性测定分析IFI16基因缺失对嗜中性粒细胞趋化作用的影响。结果 实验结果显示,与WT组相比较,IFI16基因缺失小鼠的血液和肺组织中的荷菌量显著增多,肺部出现明显的病理损伤,感染病灶明显,MPO活性无显著差异,磷酸化IRF3蛋白表达较弱。总之,初步确定,IFI16基因在金葡菌呼吸道感染中,对机体有保护作用。

  关键词:IFI16;金黄色葡萄球菌;肺炎

  前言

  金葡菌归类于细球菌科、葡萄球菌属,是革兰阳性球菌,因为在显微镜下观察以葡萄串状的形式分布,所以被叫做葡萄球菌。金黄色葡萄球菌对于营养需求相对来说比较低,在普通培养基上就可以良性增殖,需氧或者兼性厌氧,对菌体增值最有益的温度为37℃,有利的pH 为7.4。可以在空气中仍保持活性,不能增殖。极强的耐热性,70℃加热1小时,80℃加热30分钟也不会被杀死,而且耐低温,在冷冻食品中也会存活,耐高渗,在含有50%-66%蔗糖或者大于15%食盐食品中才会被阻碍生长,可以在15%NaCl和40%胆汁中增殖。由于金葡菌能够产生各种毒素和胞外酶,因此它的致病威力是极大的。即使是小范围的感染也有造成脓肿,甚至是致使机体组织发生恶性反应,所以,金葡菌肺炎会促使形成肺脓肿和脓胸。

  干扰素诱导蛋白16(Interferon-inducible protein16, IFI16) 是干扰素-γ 诱导蛋白P200 (亦称HIN200)家族成员,PHYIN 家族蛋白的作用十分普遍,在自身免疫的发展中IFI16的确切关联仍不清楚,但当它在内皮细胞超表达时一些数据涉及其在一系列炎症中的作用,其中包含通过NF-κB介导的激活蛋白酶2和激活蛋白酶3在细胞凋亡中的发挥的功能。IFI16作为多功能效应蛋白,介入细胞生长、分化、衰老、凋亡,作为天然DNA 感受器则参与细胞天然、被动免疫反应等过程[1]。

  第一章 综述

  第一节 金黄色葡萄球菌肺炎的研究进展

  金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)肺炎是急性的肺部感染,由金葡菌所引起。在病情相对比较严重的情况下,会出现极高的病死率。大多是情况下还会伴有并发症,而且是化脓性。金葡菌肺炎有两种感染途径,一种是呼吸道感染,多继发于肺结核和肺癌病患,或麻疹、流感等病毒感染之后。另一种血源性感染,例如蜂窝织炎、皮肤毛囊炎、疖、痈、伤口或手术感染等。由此依据金葡菌的侵入途径可以归类为原发性(吸入性)和继发性(血源性)肺炎,原发性肺炎即金葡菌在空气中或存留于上呼吸道侵入肺部引起的,发生此种肺炎的条件是在患者患流感、感冒或气管炎,从而机体对于产生青霉素酶的金葡菌感染的治疗已经成为临床上一个非常严重问题,比较困难[2]。由于金葡菌肺炎大多数发生在医院环境中,这种情况的发生,与预防工作没有做到位以及抗生素处于抵抗力低下。而继发性肺炎则是由金葡菌败血症引起的肺部炎症,并且大多数情况为双肺及多个病变,一些病例发病前存在手指或者趾割伤、甚至面疖或身体其他部位疮疖的情况,在肺外可伴有的病灶是迁徙性的。

  1.1金黄色葡萄球菌

  葡萄球菌属(Staphylococcus)目前经研究显示,不少于20个种。其中金黄色葡萄球菌对人和动物来说,是极其严重的致病菌,可以导致多种感染,致病力超强,感染后,对人体有害。具有代表性的金黄色葡萄球菌绝大部分也不含有荚膜,革兰氏染色呈阳性。

  Staphylococcus aureus,S. aureus,简称金葡菌,是一种共生的条件性致病菌,可以引起广泛的人类和动物的疾病,从程度较轻的特应性皮炎到软组织感染,甚至程度较为严重的侵袭性的疾病,如菌血症、肺炎和骨髓炎等,并且这些侵袭性疾病的共同特点是均具有较高的发病率和死亡率。1961年,由英国首次报道耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA),MRSA成为第一个医院获得性病原体,此时甲氧西林从推出到临床应用仅有一年的时间。1990年代后期,社区相关性MRSA(CA-MRSA)作为一种新型的MRSA,被分离并广泛传播开来在医疗机构以外是第一次[3],它的特性是具有高水平表达的致病毒力因子,这样就会使得健康人群也有机会感染此病原菌即使他们不与任何医疗设施发生接触,由此可见,对MRSA的抗感染治疗呈现出日益严峻的趋势。金葡菌侵袭性疾病中大多数是非常严重性的,位居与其中第二的则是金葡菌肺炎。

  金黄色葡萄球菌对于营养需求相对来说比较低,在普通培养基上就可以良性增殖,需氧或者兼性厌氧,对菌体增值最有益的温度为37℃,有利的pH 为7.4。可以在空气中仍保持活性,不能增殖。极强的耐热性,70℃加热1小时,80℃加热30分钟也不会被杀死,而且耐低温,在冷冻食品中也会存活,耐高渗,在含有50%-66%蔗糖或者大于15%食盐食品中才会被阻碍生长,可以在15%NaCl和40%胆汁中增殖。

  美国先前的一项调查显示,USA300菌株是多年以来快速普遍的社区获得性甲氧西林耐药金葡菌(CA-MRSA)重度感染的首要菌株,更严重的是,USA300株MRSA可以发生程度极强的传染。Methodist医院Musser博士等在关于此调查中指出,截止日前发现的MRSA的USA300菌株,在基因方面大体上是同源的。并且金葡菌耐药现象逐渐呈现出普遍性,据相关报道显示,2005 年美国大概有1.9万人是由于感染了MRSA,导致机体抵抗力极速降低,随后死亡。此种致命性感染大多出现在医院,学校和其他公共场所也有逐渐的普遍性。Pallin博士称, 美国急诊科的软组织和皮肤感染患者,由1993年的120 万例,快速上升到2005 年的340万例。DeLeo博士指出,USA30菌株具有特殊的适应性,并且可以发生和极其强大的转化。基于此种特性,推测出在稍近的几年,USA300的衍生物有极大的概率会表达出来,同时也会携带超强的致病力。

  1.2金黄色葡萄球菌流行病学特点

  金葡菌通常有以下几种的流行病学特点,一是季节分布,春夏季多发;二是中毒食品品种丰富,例如奶、肉、蛋、鱼及其制品。还有的一部分是,因剩饭、油煎蛋、糕点类食品等导致的中毒事件报道越发频繁。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率达到80%以上,由此动物和人类化脓性感染部位大多时候会形成重要的污染源。该菌的致病力的轻重程度首要是由其产生的毒素和侵袭性酶来决定,而且肠毒素能够经得住100℃煮沸30分钟却不会遭到威胁。由其导致的食物中毒的普遍表现为机体嘴角有大量分泌物或者是排大量水样粪便。

  感染金黄色葡萄球菌者,可以选择红霉素、新型青霉素、庆大霉素、万古霉素的治疗。该菌普遍存在于外界环境中,大气、水、尘埃甚至是人和动物的代谢物中都能够存在。所以,食品会有相当大的可能性会被其污染。美国疾病严控机构明确指示,由该菌导致的发病位列仅仅次于首位,即只亚于大肠杆菌。另外,金黄色葡萄球菌肠毒素已经构成了全球范围的卫生问题,美国所有细菌性食物中毒的大于30%的比例是因金葡菌肠毒素导致的,相对占有更高比例的是加拿大,大约为45%,越来越多的这种中毒事件在中国每年均有发生。

  1.3金葡菌肺炎

  临床研究表明,金葡菌肺炎患者的临床症状因感染途径而有所不同。原发性的吸入性肺炎患者一般占少数,很大一部分是突然发病的,在患流感后,金葡菌肺炎的另一种比如院内获得性的,同呼吸机辅助呼吸或气管插管在一定程度上有很大联系。临床上表现为咳嗽、高热、寒战、咯粘稠黄脓痰或脓血痰、紫绀、胸痛、呼吸呈现出困难等症状。患者的X线胸片具有多样性的表现,肺实变发生在多个部位、并伴有不同程度大小的脓肿、进而快速出现空洞。幼儿患者大多干咳、高热、病情十分迅速的发展、病情会在相对较短的时期内呈恶化趋势、胸片正常表现可发上在初期,但是,少许时间后薄壁脓肿会出现在肺内、甚至形成肺气囊,由此可导致胸腔积液即脓胸。金葡菌肺炎类型的另外一种比如血源性的,大多表现出原发性病灶,并且主要是毒血症,导致患者化并发脓性骨髓炎或者右侧心内膜炎,是感染性的。虽然多发性肺部浸润灶可以在胸片上显现出来,形成空洞是经常性的,但是会表现出比较轻微较轻或者不明显的呼吸道症状。由心内膜炎引起的患者体检报告显示有皮肤淤点、三尖瓣区收缩期杂音、镜下血尿和贫血、脾肿大等,周围血白细胞计数和中性粒细胞比例增加[4]。

  使用激素的时间段很长、全身抵抗力异常低下,或者是伴有慢性型肺疾患,是发生金葡菌肺炎的患者的常有的表现。其临床表现轻重程度有差别,而且大多发病急骤,高热会持续,甚至程度比较重的会神经精神症状伴发。实验室检查显示为,白细胞总数及中性粒细胞呈现出显著增多,中性粒细胞核发生左移,有中毒颗粒在胞浆内、且会出现空泡征象.患者痰液被采取然后经环甲膜穿刺或者培养经纤支镜吸取呼吸道分泌物,金葡菌阳性对临床诊疗具有特殊的参考意义。因为本病是化脓性的渗出,所以X线显现出的病变阴影相当浓密,和其他细菌性肺炎作比较,甚至比肋骨密度更大,血源性感染的则呈炎性浸润,并且是多发性散在式存在,不同数目的空腔也会出现,还有就是蜂窝状透光区会呈现,气囊或大泡则在痊愈后呈现,严重的感染者即十分广泛的病变携带者,病情很大程度上会积累及至胸腔,致使自发性气胸或脓气胸的形成。

  第二节 IFI16研究进展

  IFI16蛋白不但可以感受胞质dsDNA,而且还可以感受细胞核内dsDNA。IFI16蛋白含有核定位信号肽,先前研究可以证明,IFI16蛋白可以存在于细胞核或者核仁内。但是,最近的研究表明,IFI16蛋白不但可以存在于细胞质中,也可以存在于细胞核内,但是究竟存在于胞质还是核内则由细胞的类型决定。最近的一项研究,说明在炎性激活、功能性低聚炎性由NLRP3和ASC的粒子被排出到外环境,这些颗粒充当危险的信号胞外环境由传播炎症胱天蛋白酶-1的活化,或外环境或巨噬细胞内化。最近的一项研究说明了IFI16合作组装成双链DNA丝状物,这已被建议作为一个整体机制来检测外源DNA。此外,本研究还表明,IFI16簇分成一个类似开关的方式和信号灶能使用裸双链DNA的大小作为分子标尺来区分自体异体。这种承认后导致STING-TBK1途径的活化导致产生的干扰素[5]。IFI16当被分泌到细胞外内皮细胞,通过较高的邻近细胞相互作用亲和膜结合影响主要内皮细胞功能。这项活动被抑制时,在PYRIN域IFI16是由抗IFI16-N端抗体掩盖,这样行为涉及IFI16是潜在警示或损坏造成内源性错误定位分子,类似DAMPS,其中在慢性炎症和自身免疫的发展做出重大贡献。

  2.1 IFI16

  IFI16蛋白,在二十年前被发现,在细胞核和淋巴细胞的核仁中组成性表达,在骨髓细胞中可被干扰素诱导。此种IFI16干扰素诱导表达由AP-1转录控制,由于不同的mRNA剪接,它天然存在与3种亚型(A, B 和 C)中,其中,729氨基酸IFI16-B亚型最丰富。而此前IFI16表达被认为是限于造血细胞,后来它的表达在血管内皮细胞和角质形成细胞中也被发现。首先,IFI16与髓样细胞分化、p53基因介导的致瘤性控制、转录调节、抑制细胞增殖和DNA损伤发信号相关[6]。IFI16超表达通过NF-κB的介导的分泌性促炎分子如ICAM1,E-selectin, IL-8 and MCP-1驱动炎症反应的早期步骤。抗IFI16抗体存在于系统性硬化症(SSC)系统性红斑狼疮(SLE),类风湿关节炎(RA)]和干燥综合征(SS)患者的血清中,最近,在相同的自体免疫疾病作为血清循环蛋白被发现。SLE和SSC患者皮肤活组织切片检查中,在表皮和炎症浸润真皮中的IFI16自身抗原的超表达非常明显,而抗IFI16自身抗体的表达水平也可以被发现和被利用来诊断和区分有限的和弥漫性皮肤硬化症。在统计研究中,29%SSC和63%的SLE人口对于显著较高的抗IFI16自身抗体检测呈阳性,而这个数据可能与疾病特征有关联。在自身免疫的发展中IFI16的确切关联仍不清楚[7],但当它在内皮细胞超表达时一些数据涉及其在一系列炎症中的作用,其中包含通过NF-κB介导的激活蛋白酶2和激活蛋白酶3在细胞凋亡中的发挥的功能。

  胞外IFI16已知对内皮抑制正常细胞功能造成不利影响,通过高亲和膜具有约束力。这表明的参与IFI16活性炎症通路需要调查,刺激IFI16内皮细胞是负责促炎性分泌物分子。通过共培养UV-B处理的HeLa细胞与原发性内皮细胞,有人指出,外泄漏IFI16从HeLa细胞中的蛋白质,结合邻近的HUVEC[8]。因此,IFI16蛋白由HUVEC内化,IFI16激活细胞途径相互作用。在这个方向上,最近的数据提供的证据表明已知的IFI16刺激内皮细胞通过P38 MAPK和NF-趋化因子和细胞黏附分子KB P65激活上调炎症。此外,也显示IFI16与脂多糖协同以增强IL-8和IL-6的分泌,通过MyD88-依赖途径。这说明详细的分子生物学研究调查IFI16参与潜在TLR和细胞内激酶和转录因子的激活。不同的物理损害错误定位IFI16,然后最终将其释放到细胞外空间,结合相邻区域和传播炎症。另一方面,循环IFI16充当自身抗原触发生产自动的抗体。

  2.2 IFI16作为模式识别受体

  先天免疫系统监视病原体存在相关分子模式(PAMPs)和损害有关分子模式(D-AMPS)由生殖系编码的模式识别受体,包含Toll样受体、视黄酸可诱导的基因样受体、核苷酸寡聚化结构域样受体、有关胞内DNA传感功能方面的最新研究,产生新成员,即AIM2样受体,其包括AIM2和IFI16[9]。

  IFI16的模式识别方面取决于它是否是能够感知并在分子水平区分自身和非自身的DNA 。IFI16已被认定为双链DNA先天免疫传感器,检测的病原独立的双链DNA顺序和GC含量,这样的序列无关的DNA捆绑由静电力积极之间建立充电HIN区残基和双链DNA糖磷酸盐支链,允许IFI16从卡波西氏感知双链DNA肉瘤相关疱疹病毒、埃巴病毒(EBV)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和人免疫缺陷病毒(HIV-1)。IFI16的连续HIN域,尤其是具有更强亲和力的DNA结合域在病毒DNA识别中共同作用。150 bp的片段,形成大约10 个IFI16原体的一个最佳结合集群。最近的一项研究说明了IFI16合作组装成双链DNA丝状物,这已被建议作为一个整体机制来检测外源DNA[10]。此外,本研究还表明,IFI16簇分成一个类似开关的方式和信号灶能使用裸双链DNA的大小作为分子标尺来区分自体异体。这种承认后导致STING-TBK1途径的活化导致产生的干扰素。虽然已经知道,DNA识别由IFI16同时出现在细胞核和细胞质,最近也发现,乙酰化在对核两个不同的站点定位信号,位于IFI16的N末端区域,调节IFI16的细胞核-细胞质定位。IFI16的NLS是必需的核定位,乙酰化目前在第99位和128赖氨酸残基,严格禁止核进入。这样的结构研究阐明DNA结合和IFI16齐聚功能改善我们对非自体DNA检测和IFI16定位理解。但很少涉及核问题,STING和IFI16的激活细胞内的相互炎性作用仍然没有答案。

  IFI16蛋白不但可以感受胞质dsDNA,而且还可以感受细胞核内dsDNA。IFI16蛋白含有核定位信号肽,先前研究可以证明,IFI16蛋白可以存在于细胞核或者核仁内。但是,最近的研究表明,IFI16蛋白不但可以存在于细胞质中,也可以存在于细胞核内[11],但是究竟存在于胞质还是核内则由细胞的类型决定。IFI16蛋白通过感受胞质和核内dsDNA,从而发起不同的天然免疫应答。诱导产生干扰素-β( IFN-β) 与炎症性细胞因子。

  Fabio Martinon 等于2002 年首先提出炎性复合体/炎症小体( inflammasome) 的概念。炎症复合体主要由NLR[NLRP1、NLRP3、NLRC4 (IPAF) 、NLRP6 和NLRP12]或者HIN-200 蛋白( 包括AIM2、IFI16) 家族组成[12],它本质上分子复合物并且是由多个蛋白组成的,功能是能够介导辨别细菌以及内源性的危险信号来触发caspase-1的活化。而caspase-1 活化后能够促进炎性细胞因子的成熟和排出,例如IL-1β、IL-18 和IL-33等。研究表明,多个临床疾病和caspase-1 活化以及IL-1β 分泌调控的异常有密切关系。此外,活化的caspase-1 也能够介导细胞死亡,此种细胞死亡形式被称为“Pyroptosis”形式,是由细菌病原体诱导的。因此,对炎性复合体的深入探讨会对于炎症反应的深入研究和了解疾病的发病机理及可能的临床治疗具有重要意义。

  第三节IFI16与天然免疫

  3.1 IFI16细胞内DNA的天然免疫识别受体

  IFI16是黑色素瘤样缺失受体,属于PYHIN蛋白家族,一组干扰素诱导蛋白,也包括AIM2,MNDA(粒细胞细胞核分化抗原)、PYHIN1 (PYRIN + -HIN-1)和通过PYHIN基因簇在1q23染色体编码的POP3(PYRIN结构域蛋白3),这些蛋白在N端共同组成PYRIN或PYD结构域,由一个或两个连续200个氨基酸的DNA连接结构域HIN链接。HIN-200域中蛋白质自身和外源的的DNA链接物和识别能力将题目区分为模式识别受体和先天免疫传感器,形成炎性信号的中心阶段[13]。此外,PYRIN域是已知的绑定促凋亡斑点蛋白,导致在细胞形成大的胞浆'污点''和激活的蛋白酶前体,在病原体中的DNA检测被切割到成胱天蛋白酶-1,导致白介素前体分泌和产生白介素,当发现与β-干扰素诱导的牛痘病毒DNA主题实验方案相关时,IFI16的先天免疫传感活动第一次被证实。然而这种复杂性进一步促使STING介导的干扰素基因的激活,因为没有IFI16防止IRF3和NF-κB的HSV-1介导的激活转录因子[14]。这解释了IFI16的传感活动存在于像其他炎性细胞浆组件,包括其公认的小鼠对应P204。不清楚的是IFI16在其核内位置,还可以感知KSHV细胞核导致炎性激活内DNA。在这种情况下,与IFI16 ASC交互易位到细胞质导致胱天蛋白酶-1的激活。

  在炎性环境的IFI16,而我们的组最近已证明游离IFI16蛋白在发生自身免疫患者的血清[15]。IFI16已经证明过表达时激活大量的炎症反应在细胞内,这引起了活性潜在假设IFI16也细胞外,IFI16的N-末端PYRIN域已知参与细胞凋亡,炎症和蛋白与肿瘤监管机构的互动,包括p53和BRCA1,当这种蛋白质暴露于细胞外环境,它可以具有与组件潜在的相互作用先天免疫反应,特别是的PRR[16]。我们最近的研究方向表明,IFI16当被分泌到细胞外内皮细胞,通过较高的邻近细胞相互作用亲和膜结合影响主要内皮细胞功能。这项活动被抑制时,在PYRIN域IFI16是由抗IFI16-N端抗体掩盖,这样行为涉及IFI16是潜在警示或损坏造成内源性错误定位分子,类似DAMPS,其中在慢性炎症和自身免疫的发展做出重大贡献[17]。

  全身性自身免疫性疾病大多是由组织损伤和细胞凋亡的影响,致使泄漏与自身抗原的暴露于免疫系统,在大多数的情况下,死细胞和组织碎片被清除由单核巨噬细胞系统,但是当失败时,他们暴露自身抗原可能致使潜在的慢性源自身免疫的发展[18]。自身免疫性综合症时期,几个细胞介导的免疫反应失败,从而发展自身抗体堆积。多种自身抗原和对应抗体被确定为不同的系统性自身免疫性疾病,就像在SLE,显示了广阔流通中的抗体数量。最近,基于ELISA的统计研究,以确定在IFI16的存在下,在游离形式中循环内全身自身免疫性病人血清。观察IFI16的显著水平在硬皮病的34%,系统性红斑狼疮的37%,SJS的47%,和RA患者的56%,这样IFI16的细胞外出现表示的参与细胞凋亡,损伤或无功能的自身抗原的间隙机制,导致其在胞外环境中的释放[19]。

  细胞内DNA传感器检测宽范围的的PAMP和诱导细胞内炎性激活先天免疫级联为危险信号的传播。点头样受体含Pyrin域(PYD),被称为NLRPs和AIM2样受体(ALRS),包括IFI16发挥宿主防御关键作用通过促进病原体清除和维护健康微生物菌群,NLRPs and ALRs编码相似在细胞内的胱天蛋白酶-1炎性激活端接成熟[20],最近的一项研究,说明在炎性激活、功能性低聚炎性由NLRP3和ASC的粒子被排出到外环境,这些颗粒充当危险的信号胞外环境由传播炎症胱天蛋白酶-1的活化,或外环境或巨噬细胞内化。另外,活性胱天蛋白酶-1内的巨噬细胞导致的所谓的释放“胱天蛋白酶-1分泌蛋白质”,一组促炎症分子的包括IL-1β,IL-18。HMGB1和其它蛋白质主要涉及在炎症和组织修复[21]。活性胱天蛋白酶-1介导的巨噬细胞“细胞凋亡”破坏细胞膜完整性释放细胞内分子,包括LDH,这被认为是作为一种有效的机制。细胞凋亡的另一个功能方面涵盖聚合适配器ASC和ASC斑点的组装是新的caspase-1的促炎症细胞因子IL-1β的成熟。在炎性活动,这些ASC斑点也积聚在细胞外空间,它们继续促白介素的成熟。在巨噬细胞外,这些斑点ASC的溶酶体损伤和接收白介素细胞进一步激活。对已被发现的自身免疫综合症患者ASC斑点自身抗体,有一起明显ASC斑点在从发炎组织的体液的存在。

  3.2 IFI16与天然免疫

  天然免疫系统不但能够借助炎症反应等机制直接把感染消除掉,并且会促使触发的免疫应答更加有效率和具有特异性。所以综上,天然免疫是最基本的免疫。非天然性免疫系统对各类外来抗原产生特异性的应答借助于基因重排产生的克隆化的淋巴细胞表面受体,而天然免疫系统识别细菌、病毒等外来微生物则有赖于数量不多的模式识别受体( pattern-recognitionreceptors,PRRs),PHYIN蛋白家族又称HIN-200( P200) 蛋白家族是一种模式识别受体[22]。虽然已经知道,DNA识别由IFI16同时出现在细胞核和细胞质,最近也发现,乙酰化在对核两个不同的站点定位信号,位于IFI16的N末端区域,调节IFI16的细胞核-细胞质定位。IFI16的NLS是必需的核定位,乙酰化目前在第99位和128赖氨酸残基,严格禁止核进入。这样的结构研究阐明DNA结合和IFI16齐聚功能改善我们对非自体DNA检测和IFI16定位理解。但很少涉及核问题,STING和IFI16的激活细胞内的相互炎性作用仍然没有答案。

  天然免疫应答的首要节点是识别细胞内的微生物DNA,先天免疫系统监视病原体存在相关分子模式(PAMPs)和损害有关分子模式(D-AMPS)由生殖系编码的模式识别受体,包含Toll样受体、视黄酸可诱导的基因样受体、核苷酸寡聚化结构域样受体、有关胞内DNA传感功能方面的最新研究,产生新成员,即AIM2样受体,其包括AIM2和IFI16,PYRIN域是已知的绑定促凋亡斑点蛋白,导致在细胞形成大的胞浆'污点''和激活的蛋白酶前体,在病原体中的DNA检测被切割到成胱天蛋白酶-1,导致白介素前体分泌和产生白介素[23],当发现与β-干扰素诱导的牛痘病毒DNA主题实验方案相关时,IFI16的先天免疫传感活动第一次被证实。IFI16的N-末端PYRIN域已知参与细胞凋亡,炎症和蛋白与肿瘤监管机构的互动,包括p53和BRCA1,当这种蛋白质暴露于细胞外环境,它可以具有与组件潜在的相互作用先天免疫反应,特别是的PRR,细胞内DNA传感器检测宽范围的的PAMP和诱导细胞内炎性激活先天免疫级联为危险信号的传播。点头样受体含Pyrin域(PYD),被称为NLRPs和AIM2样受体(ALRS),包括IFI16发挥宿主防御关键作用通过促进病原体清除和维护健康微生物菌群,NLRPs and ALRs编码相似在细胞内的胱天蛋白酶-1炎性激活端接成熟,活性胱天蛋白酶-1介导的巨噬细胞“细胞凋亡”破坏细胞膜完整性释放细胞内分子,包括LDH,这被认为是作为一种有效的机制。细胞凋亡的另一个功能方面涵盖聚合适配器ASC和ASC斑点的组装是新的caspase-1的促炎症细胞因子IL-1β的成熟。在炎性活动,这些ASC斑点也积聚在细胞外空间,它们继续促白介素的成熟。在巨噬细胞外,这些斑点ASC的溶酶体损伤和接收白介素细胞进一步激活。

  先前的研究证实在HEK293细胞中能够结合ASC从而形成炎症复合体的只有AIM2,而其他的该家族成员比如IFI16不能结合ASC,即IFI16能否形成炎症复合体还不能被确认[24]。随后Kerur 等研究充分显示,在KSHV即卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒感染机体内皮细胞并在细胞核内复制时,受感染的细胞中发生IFI16和ASC 共同表达而且会从细胞核转位到核周围,一个有功能的IFI16-ASC炎症复合体依赖于他们这种相互作用而形成,由此表明该蛋白复合体一开始只有在核内被检测到,在接下来的研究中才在核周围被发现,此项重大研究发现极有可能鉴于当人的单核或者巨噬细胞感染时,ASC接头蛋白大多存在于胞质中,相反,受到处于静息或者正常生理状态时,ASC接头蛋白大多存在于细胞核内,由此推断IFI16 蛋白转位到胞质中质有极大的可能性是由于ASC 和IFI16 的相互作用而导致[25]。另一个概念来理解在细胞外空间释放IFI16的意义是与DAMPs相关,其在细胞外空间释放,并传播危险信号免疫系统报警感染,组织损伤,独立自体或非己。在自由流通情况,DAMPS是已知与炎症模式识别受体,即Toll样受体相互作用。在细胞外IFI16的分子的活性和蛋白质的相互作用自由流通目前还尚不清楚,但其他分子与类似的行为特性,例如HMGB1是已知的,与宽范围的交互炎症的受体通过炎性细胞因子的生产能够长期刺激免疫系统开始'破坏连锁反应'还涉及生产自身抗体。HMGB1是公认的自身抗原和特异性抗体存在于几个全身自身免疫性疾病。HMGB1和IFI16相似之处值得进一步的研究调查,在不同的细胞类型的细胞外IFI16分子活性,包括血管内皮细胞,这可以解释在胞外环境IFI16溢出的后果。

  IFI16 可借助与细胞周期相关蛋白结合,从而介入细胞的生长及周期调控,是由IFI16 具有这个家族共同拥有的相同的微观组成序列决定的,就是在它的N 端含有PYD/PYHIN 区域,如BRCA1、pRb、p53、E2F及 NF-κB 等。重要的是,机体还可通过该区域与炎性细胞因子相互作用并生成炎症小体,促使细胞的天然免疫反应得以启动[26]。在PYD 区域内有NLS 核孔输入区,IFI16 通过该区域介导细胞的核定位。IFI16 的C端具有HIN A 区及HIN B 区被称作是两个相对保守的HIN200 重复区域,两区之间由1~3 个重复序列隔开即富含丝氨酸- 苏氨酸- 脯氨酸的S/T/P 的56 个氨基酸序列。IFI16 mRNA会形成含有1~3 个S/T/P重复序列的A 型、B 型及C 型IFI16 同型体因为它有着不一样的剪接方式。而Unterholzner 等证实了另一种发现,就是IFI16-HIN-200B 结构域只对dsDNA 具有很高水平的亲和力[28]。体外研究显示,IFI16参与细胞的天然免疫识别,自身免疫性综合症期间,几个细胞介导的免疫反应失败,从而发展自身抗体堆积。多种自身抗原和相应抗体被确定为不同的系统性自身免疫性疾病,就像在SLE,显示了广阔流通中的抗体数量,这说明详细的分子生物学研究调查IFI16参与潜在TLR和细胞内激酶和转录因子的激活。如归纳于图2,不同的物理损害错误定位IFI16,然后最终将其释放到细胞外空间,结合相邻区域和传播炎症。另一方面,循环IFI16充当自身抗原触发生产自动的抗体,同时也与机体多种疾病的发生有着密切联系。

  第二章 研究内容

  第一节 金黄色葡萄球菌USA300感染IFI16-/-小鼠肺炎模型的建立

  1.1材料与方法

  1.1.1 材料

  1.1.1.1 实验动物

  6周龄IFI16基因敲除小鼠、6周龄对照组小鼠,保证清洁级,体重在18~21g,小鼠饲养在吉林大学动物医学学院动物房内,提供标准的动物饲料,使其自由饮食饮水,温度控制在在20~25℃,相对湿度保持在40%~70%,每日光照12小时。

  1.1.1.2 菌株

  金黄色葡萄球菌USA 300,是被保存在本实验室的。

  1.1.1.3主要试剂与仪器设备

  BHI、PBS、乙醚、水、培养皿(手术用)、细菌涂布棒、镊子、剪子、手套、

  -80℃冰箱(SANYO)、离心机购于上海精宏有限技术公司、超净工作台购于HDL公司、手术器械、4℃冰箱、恒温培养振荡器购于天津欧诺仪器表有限公司、LDZM-80kcs-③立式压力蒸汽灭菌器购于上海申安医疗器械。

  主要试剂的配制:①PBS:首先定量称量0.2 g的 KCl,8 g的 NaCl,0.24 g的 KH2PO4和2.88 g 的Na2HPO4·12H2O加入容量为1L的烧杯中,再添加800 mL左右的去离子水,用力搅拌使其完全溶解后定容到1L,使用0.22μm滤器过滤除菌后,贮存于4℃冰箱以备用。②BHI培养基:首先准确称量38.5 g BHI Broth,然后添加1000 mL去离子水,用力搅拌使其完全溶解,再经121℃高压灭菌大约20分钟,贮存于4℃冰箱以备用。BHI平板:配制BHI液体培养基,依据15 g/L添加Agar,121℃高压灭菌大约20分钟,摇晃使其均匀混合,然后铺板,贮存于4℃冰箱以备用。

  1.1.2实验方法

  1.1.2.1小鼠金葡菌肺炎模型的建立

  (1)金葡菌准备:USA 300

  取出贮存于-80℃冰箱的细菌,使用适当的剂量例如10ul进行涂板操作,37C培养16-18小时,挑取单菌落,5ml LB,37℃恒温200rpm培养16-18小时。使用无菌PBS,10倍稀释测定OD值(原始菌液OD=0.7-1.2),取适当细菌,离心,5000rpm 5min,并用PBS洗涤,重悬后调整细菌到2.5 OD(2.5x10^9)

  (2)动物感染及感染时间:

  滴鼻感染(查阅相关文献可知剂量为4x10^8总菌,40ul总量,6h &24h;或2x10^8总菌,20ul总量,存活分析)。操作步骤为先用乙醚将小鼠麻醉,再用镊子轻拉小鼠舌于一侧,防止小鼠回呛喷出菌液,缓慢滴鼻20ul细菌(30sec一次),再滴10ul PBS,放回舌,滴后使小鼠保持立起姿势大约1分钟,然后把小鼠放入鼠笼中并且保持平躺姿势,放置于电暖气旁边直至苏醒,同时保持正常的饲养条件。

  空白对照组用同等剂量的无菌1×PBS滴鼻。

  1.1.2.2样品采集与小鼠肺的眼观病变

  (1)在超净工作台上将苏醒后小鼠麻醉,用剪刀剪口撕开腹部皮肤,打开腹腔,找到腹主动脉;

  (2)在小鼠胸膈膜上剪开小口,看到肺回缩,完全打开胸腔,再剪去胸骨和部分肋骨,使心肺露出;

  (3)使用医学输液用的注射器及软管,向右心房缓缓注入PBS,使心脏鼓起,剪开腹主动脉,继续注射10mlPBS,直到肺变白;

  (4)样品采集后存留分析,

  取右侧肺的下叶,使用滤纸吸干污血渗液然后-80℃冻存,留存用于将其制成肺组织匀浆;所取组织块的厚度约为0.2 ~ 0.3cm,大小以1.5cm x 1.5cm x 0.3cm为宜;组织块用10%甲醛溶液固定12~24小时,然后转移至70%乙醇中4℃保存;匀浆组织留存于5ml离心管中,剪碎小于 2mm即可。

  1.1.2.3荷菌数匀浆样品处理进行荷菌数分析(按照新实验仪器进行适当的调整):

  首先匀浆组织样品称重,然后按照组织重量计算PBS体积,按照PBS体积(ul)= 组织重量(g)×4×1000计算;接着,将匀浆进行第三档匀速10s x 2次处理,随后取10ul匀浆液,使用PBS 10倍和100倍稀释(根据预实验确定最佳稀释倍数)后进行涂板,保证均匀涂布,37℃培养后计算菌落数。

  1.2实验结果

  1.2.1肺的眼观病变

  WT组

  IFI16-/-组

  与WT相比,IFI16基因缺失小鼠的肺部出现明显的病理损伤,表现为肺叶肿胀、充血、呈暗红色、感染病灶明显。

  1.2.2 Bacteria Burden

  经过GraphPad Prism 6.0对数据进行统计学分析,可知,与WT组相比较, FI16基因缺失小鼠的血液和肺组织中的荷菌量显著增多。(P<0.05,差异显著)

  第二节Western blot测蛋白表达

  2.1材料与方法

  2.1.1试剂与仪器设备

  Tissue rips buffer、Leupeptin、Pepstatin、PMSF、Aprotinin、PVDF膜、去离子水30% 丙烯酰胺、脱脂奶粉、离心机购于Thermo Scientific公司、37℃培养箱购于Thermo Scientific公司、酶标仪购于宝泰克公司、电泳仪购于美国Bio-Rad公司、凝胶成像分析仪购于美国Bio-Rad公司

  主要试剂的配制

  ①RIPA裂解液的配制按照如下试剂及其用量进行:

  1ml的Tissue rips buffer(4℃贮存)

  5ul的Leupeptin(亮抑制肽)(1mg/ml, -20℃溶于水中)

  5ul的Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂)(1mg/ml,于甲醇液中, -20℃保存)

  5ul的PMSF(苯甲基磺酰氟)(1mM,-20℃于异丙醇中)

  5ul的Aprotinin(抑蛋白酶肽)(1mg/ml,溶于0.01mol/LHEPESpH8.0,-20℃保存)

  ②12%分离胶的配制:(水3.4ml,30%Acrylamide mix 4ml,1.5M PH8.8 Tris 2.5ml,10%SDS 1006 µL,10% ammonium persulfate 606 µL, TEMED 6µL)

  ③4% 浓缩胶的配制:(3.655 mL,30% 丙烯酰胺0.67 mL,1M Tris (pH6.8) 0.625 mL,10% SDS 50 µl,10% APS 60 µl,TEMED 6 µl)

  2.1.2方法

  (1)将匀浆组织样品称重,计算RIPA裂解液的体积,按照RIPA裂解液体积(ul)= 组织重量(g)×4×1000进行计算;

  (2)加入磁珠,然后研磨10min,相应的离心操作为4℃离心,13000rpm,10min,吸取上清,贮存条件为-80℃,新冰箱(-2~4),备用。

  (3)BCA测蛋白浓度

  1.BSA标准品倍比稀释:

  将BSA Standard倍比稀释(μg/μl):2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,线性范围在1~0.0625间;

  2.样品稀释:1:20(选用先前配好的裂解液);

  3.配制BCA工作液,试剂A:试剂B=50:1 现配先用,根据使用量配置;

  4. BSA Standard和样品各精确取10ul加到96孔板中,每个标准品或样品各两个重复(样品3个重复也可 );

  5.每孔加200ulBCA工作液;

  6.放入37℃培养箱中,20分钟,此处注意不要让96孔板内液体蒸干;

  7.酶标仪上,630nm(562nm最佳)测定吸光光度值及蛋白浓度。

  (4)蛋白样品的变性预处理:

  1、上样样品蛋白总量:

  2、根据蛋白浓度测定结果,配制准备上样样品,稀释时使用Basic RIPA Buffer,同时将3×SDS Loading Buffer稀释为1倍;

  3、样品及1×SDS Loading Buffer 100℃煮沸5min;

  4、Spin down备用;

  (5)SDS—PAGE(聚丙烯酰氨凝胶电泳)

  1、12%分离胶,室温放置30-45min左右会形成凝胶;4% 浓缩胶,室温放置30-45min左右会形成凝胶[30]。

  2、使Protein Maker和预变性的蛋白样品(20~60ug/sample)上样至凝胶孔,剩余孔内添加同等体积的1×SDS Loading Buffer;

  3、80V 半小时左右或45分钟内(待染料转到靠近胶板下部边际就可以,然后时间的确定要依据marker以及分析蛋白的分子量来计算,使分析蛋白置于凝胶板的下部3/4处)。

  (6)转膜:

  1、PVDF膜水化:剪取适宜大小的PVDF膜,置于甲醇内水化15sec-30sec即可;使用双蒸水进行洗涤和浸润除掉PVDF膜上的甲醇;

  2、转膜:黑色面—海绵—滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸—海绵—白色面(保证不会有气泡产生);

  3、夹好后,黑色面与黑色对照,白色面与红色对照,转移置转膜槽内;

  4、75V,60min,冰浴转膜,不间断地搅动转膜液;

  (7)封闭:

  1、备好5 % Milk,5mg脱脂奶粉溶解于100 ml 1×TBST(0.1% Tween-20),pH7.5;

  2、转膜结束后,使用圆珠笔于PVDF膜右上角标记,并且保证从开始到结束不应该与PVDF膜蛋白区域发生接触;

  3、将标记好的PVDF膜直接添加到5% Milk 10~12mL(不要使用1×TBST洗),室温低速振荡,封闭2小时。

  (8)结合一抗:

  1、封闭后,使用镊子夹取PVDF膜放入1×TBST中洗涤2次将PVDF膜上粘附的milk清理干净;

  2、一抗孵育:将8mL的一抗液(in Dilute Buffer pH7.5~7.6—5%BSA and 0.1%NaN3 in 1×TBST)进行4℃低速振荡孵育12-16小时,一抗液要回收[31];

  (9)结合二抗:

  1、一抗结合后,充足的1×TBST中,中速振荡洗涤4次,每次15分钟左右;

  2、二抗孵育:8mL二抗液(5% Milk in 1×TBST)室温低速振荡孵育大约1小时;

  (10)显色、曝光及洗片:

  1、二抗结合后,充足1×TBST中,中速振荡洗涤4次,每次15分钟左右;

  2、预先打开洗片机使其预热(大概10分钟),同时打开循环水,准确使用洗片机,确保循环水不要进入显影液和定影液中;

  3、ECL显色:取试剂A:试剂B=1:1均匀混合后,至室温保持平稳,沥干PVDF膜,却不要让其完全干,加显色液显色2min[32]。

  4、将ECL工作液除去,然后转置暗盒内,使用清洁的保鲜膜覆盖,保证不会有气泡产生。同时保鲜膜覆盖PVDF的一面必须是完全清洁的,不要与任意物品发生碰触,比如实验服;

  5、暗室中,开启胶片盒,拿出胶片,其余的胶片封装完口后倒装置盒子中;

  6、把胶片放到PVDF膜上,暗盒要压好,然后曝光;

  7、曝光之后,将胶片置于洗片机中完成洗片;

  8、洗片之后,于胶片上标记好Protein Maker,进行结果分析。

  2.2实验结果

  WT IFI16-/-

  NT USA300 NT USA300

  GAPDH

  p-IRF3

  由图分析可知,与WT组相比较,IFI16-/-组小鼠的肺组织中Ⅰ型干扰素信号通路弱,磷酸化IRF3蛋白的的显著性降低,表达比较弱。

  第三节 MPO活性测定

  3.1材料与方法

  3.1.1 试剂与仪器设备

  生理盐水、3%H₂O₂、H₂SO₄、HEPES、TMB(3mM)、Resorcinal(6mM)、磁珠、离心机、酶标仪

  3.1.2方法

  将留存的肺组织样品,在冷生理盐水中进行漂洗,并用滤纸拭干;称肺组织重量(g)配制好HEPES+STI,使配制的HEPES+STI的体积与肺重量(g)×4000相等, 加上磁珠,研磨(50Hz,研磨10秒钟,间隔10秒钟),4℃离心13000rpm,20分钟,吸取上清,沉淀加5%CTAC(0.5% CTAC添加量同前)研磨,4℃离13000rpm,20min,取上清,留样,配制底物TMB(避光配制)。(注:相对应的配置过程为对于10孔所需试剂及用量为TMB(3mM)8798ul,Resorcinal(6mM)180ul,最后加入22.5ul的3%H₂O₂。)最后加样品75ul,加底物75ul,静置2分钟,加H₂SO₄(提前4℃保存)终止,测OD450值。

  3.2实验结果

  经过GraphPad Prism 6.0对数据进行统计学分析,可知,WT组和IFI16基因缺失组,MPO活性无显著差异。(P>0.5)

  讨论

  髓过氧化物酶(MPO)是中性粒细胞所特有的,研究发现,就算在有超强的吞噬作用的巨噬细胞中也十分少见甚至完全没有此酶[33]。该酶能够把过氧化氢还原,根据此种特性,能够掌握酶的活性,在细胞化学上,通常把此种酶看作是获得中性粒细胞的依据。它的作用是将氯氧化物和氧化氢转化成次氯酸盐[34]。形成炎症的情况下,此酶就会被释放到细胞外液,进入循环。中性粒细胞主要介入固有免疫,而且还会发挥极度关键的作用,它位于机体防御微生物病原体尤其是在化脓性细菌攻击机体的第一线,发挥超强的趋化作用、吞噬作用、杀菌作用。中性粒细胞的趋化作用关键是依赖伪足的伸缩来完成的[35]。趋化作用,就是细胞朝着一个化学物质刺激的方向移动。某些物质能够对中性粒细胞产生趋化作用,被叫做中性粒细胞趋化因子。趋化因子的受体存在于中性粒细胞膜上,受体和趋化因子相接触,胞膜上的钙泵被激活,细胞朝着前面伸出片足,IgGFc受体和补体C3受体存在于能够让细胞移向产生趋化因子的部位性粒细胞膜的表面[36],能够使吞噬作用变得更迅速,而且被吞噬的异物被抗体和补体包裹时,和中性粒细胞膜上的对应受体联合,由此也会使细胞对其产生更为严重的吞噬杀菌作用,叫做调理作用。

  炎症反应不是一个简单的过程,中性粒细胞作为炎症反应中被非常普遍研究的细胞,同时还是功能最为复杂的细胞[37]。并且,在整个炎症反应过程中,中性粒细胞的功能涉及到中性粒细胞的激活、迁徙、还有对病原体和损伤组织的彻底去除[38]。这一过程是中性粒细胞利用表面模式识别受体和相关分子模式作用被激活,继而它的受体与表达在血管内皮上的配体相互作用进行迁徙,到最后通过吞噬作用和脱颗粒作用对病原体还有损伤组织进行彻底去除[39]。大量报道指示,组织细胞和微生物产生的趋化剂对嗜中性粒细胞的趋化作用在机体对抗病原体感染的过程中起到关键作用。

  Ⅰ型干扰素(type I interferon)是天然免疫的重要构成部分,有利于机体控制和彻底去除病原体,Ⅰ型干扰素的诱导表达是固有免疫的主要调控和效应机制[40],先前的调查显示,许多转录因子例如NF-kappa B、ATF-2/c-Jun、IRF3、IRF7可以在Ⅰ型干扰素的转录调控区域产生稳定的转录增强复合物(enhanceosome),由此可以诱导Ⅰ型干扰素表达,并且是快速和大量地。关于机体的研究分析已经十分确定,干扰素调控因子3(IRF3)是介导细胞表达Ⅰ型干扰素特别重要的转录因子,细胞的抵抗病毒的能力与它的转录活力和生物学功能有直接联系[41],大量研究表明,在Ⅰ型干扰素的诱导表达中至关重要的是IRF3/7,在细胞缺乏IRF-3或者IRF-7的表达的状况下,大部分病毒感染后Ⅰ型干扰素的诱导分泌无法实现,进而缺乏IFN的应答,IRF3 缺失的小鼠对病毒的易感性显著大于正常小鼠,更为普遍的是,IRF3 缺失的胚胎成纤维细胞如果发生病毒感染,其,由诱导产生的Ⅰ型干扰素的量明显减少[42]。

  最近10年关于对IRF3的研究,使得它的分子生物学被更深层次和具体的了解,包括它的结构及其功能,还有IRF3和病毒的相互作用,甚至是IRF3在固有免疫中的重要作用[43]。IRF3在大部分细胞中以组成性表达形式存在,以在细胞浆中存在为。IRF3在尚未被侵袭细胞中,在胞内存在,并且在胞质中不会发生与其他蛋白质的连接,存在形式为非活化的单体[44]。如果受到上游信号转导,例如病毒感染、双链RNA的刺激,IRF-3被磷酸化激活,其分子内部的自我抑制域不再封闭,形成同二聚体或者与IRF-7形成异二聚体,继而迁移到细胞核内,与共同活化因子CBP/p300接触能够使转录活性得以加强[45]。磷酸化后的IRF-3会和β-干扰素启动子相接触,使病毒介导的I型IFN的表达呈明显上升趋势,因此可以在抗感染免疫中起到关键作用[46],并且Ⅰ型干扰索也能够使自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力显著显著增强,从而发挥免疫调节作用。

  结论

  与WT组相比较,FI16基因缺失小鼠的血液和肺组织中的荷菌量显著增多,IFI16基因缺失小鼠的肺部出现明显的病理损伤,表现为肺叶肿胀、充血、呈暗红色、感染病灶明显。说明IFI16基因可以有效缓解炎症症状。

  嗜中性粒细胞MPO活性检测,无显著差异,但WT组小鼠含有完整的IFI16基因,嗜中性粒细胞稍多,清除的细菌多,说明IFI16不减弱中性粒细胞的趋化,不会削弱炎症反应中中性粒细胞的趋化作用,吞噬杀菌作用。

  与WT组相比较,IFI16-/-组小鼠的肺组织Ⅰ型干扰素信号通路弱,磷酸化IRF3蛋白的的显著性降低,表达比较弱。说明,IFI16活化Ⅰ型干扰素信号通路,发挥免疫调节作用,有利于机体清除病原菌。

  因此,IFI16在金葡菌呼吸道感染中,对机体有一定的保护作用。

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