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最新动物医学论文 沙罗拉纳治疗犬跳蚤感染性皮肤病的临床药效学研究

2018-12-04 10:13:39来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要

  本试验按《兽药临床试验质量管理规范》(农业部公告【2009】第2337号)开展,试验设计依据农业部发布的《兽药化学药品生物等效性试验指导原则》中的“临床疗效研究法”(农业部公告【2009】第1247号)。针对目前硕腾公司美国林肯生产厂生产的沙罗拉纳咀嚼片这一新型抗犬体外寄生虫药,本试验将其与阳性对照药物福来恩增效滴剂Frontline Plus(梅里亚公司生产)比较,研究沙罗拉纳咀嚼片(Simparica)治疗和控制自然发生的犬皮肤跳蚤感染的临床药效并对其安全性进行评估。试验选用120只犬,平均分为跳蚤试验组和跳蚤对照组两组。试验结果表明,用药治疗期间和用药结束后,试验犬皮肤的体外寄生虫跳蚤(及虫卵)数量平均减少率为100%,符合≥90%的规定标准,且试验犬的患部无瘙痒,无红疹、皮屑或试验犬自我啃咬的损伤,疗效判定为有效。

  关键词:沙罗拉纳、犬、跳蚤、皮肤病

  1.前言

  1.1试验目的及意义

  受硕腾公司委托,遵照进口兽药注册的相关要求,在海南海口开展临床验证试验,以验证沙罗拉纳咀嚼片对中国犬只的临床疗效,并评估该产品的临床使用安全性。

  1.2试验背景

  1.2.1受试药物

  沙罗拉纳(Sarolaner)是一种新型的异恶唑啉类杀螨剂和杀虫剂。其中,异噁唑啉可以防止血液摄食类节肢动物的传播感染,该能力可能取决于它们如何迅速中断寄生虫的喂食并杀死媒介,根据发表于其他地方的研究这一特殊问题的文献,异噁唑啉在限制寄生虫喂养持续时间和减少感染传播方面起到一定作用。

  异噁唑啉类化合物的作用机制是有据可查的,根据以往的文献报道,异噁唑啉通过昆虫GABA和谷氨酸门控氯化物通道的特异性阻断表现出抗寄生虫活性。进而得知,沙罗拉纳的作用点为昆虫的神经肌肉交接处,通过抑制神经递质λ-氨基丁酸 (GABA) 受体和谷氨酸受体的功能,使神经肌肉活动失去控制,进而导致昆虫或螨的死亡。

  沙罗拉纳咀嚼片(Simparica)口服给予后,沙罗拉纳被迅速吸收,大部分可在一分钟内被完全消化吸收,而且咀嚼片适口性好[4]。在对12只比格犬进行的研究中,禁食动物单次按每Kg体重2mg的剂量口服沙罗拉纳咀嚼片,平均血浆峰浓度(Cmax)为1100ng/mL,平均达峰时间(Tmax)为3小时。在禁食和饱食犬中的平均口服生物利用度分别为86%和107%。在禁食和饱食动物中的平均口服半衰期(t1/2)分别为10天和12天。沙罗拉纳与血浆蛋白的结合率高(>=99.9%),在犬体内代谢缓慢,在犬体内主要通过胆汁和粪便排泄。按推荐剂量一次口服给药,药效可持续一个月。可用于杀灭犬成年跳蚤,用于治疗和预防犬的跳蚤感染,如猫栉首蚤(Ctenocephalides felis);也用于治疗和控制犬的蜱感染,包括美洲钝眼蜱(Amblyomma americanum)、斑点钝眼蜱(Amblyomma maculatum)、变异革蜱(Dermacentor variabilis)和棕色狗蜱(Rhipicephalus sanguineus)。目前该药物已在北美、欧洲、亚洲多国上市。

  1.2.2 对照药物

  福来恩适用于预防和治疗犬体表蚤、蜱、虱的寄生,抑制白蛉、厩蝇和蚊子的叮咬,并可用作辅助治疗因蚤引起的过敏性皮炎。驱杀效力可以维持在一整个月。其有效成分有两种,其一,二氯苯醚菊酯,属I型菊酯类杀虫剂、杀螨剂和驱虫剂,主要影响脊椎动物和无脊椎动物的电压依赖性钠通道,延迟和延长该通道激活与失活,导致寄生虫高度兴奋,直至死亡。其二,吡虫啉,为新一代氯代烟碱杀虫剂,对昆虫的中枢神经系统突触后烟碱型乙酰胆碱受体具较高亲和性,可抑制乙酰胆碱活性,导致寄生虫麻痹和死亡。对成年蚤和各个阶段幼蚤有效,对环境中幼蚤也有杀灭作用。二者联合使用,具有协同作用。还可抑制蜱、白蛉、蚊子吸血,减少血媒性传染病的发生和传播。局部使用,犬局部使用后,能迅速扩散到体表,治疗后4周内动物体表和毛发均能检测到活性药物。

  福来恩滴剂仅供皮肤外用。用药时应保持舒服的姿势。首先应确认毛发已完全干燥(建议使用前后两天避免用香波洗澡),然后拨开犬背部肩胛骨之间(此部位可避免犬自身舔舐)的毛发至看到皮肤,将滴管前段抵住皮肤,沿拨开的皮肤将药液全部挤出,最后用毛覆盖用药部位。注意不要滴在毛发上,药剂在毛发上会蒸发掉,很少量进入皮脂腺储藏起来,会限制产品效力的发挥。

  对某些对外寄生虫药剂敏感的个体,投药处可能出现暂时性刺激,例如皮肤红肿,脱毛等,多数病例数天后可自行恢复,若症状不退或加剧,应记录下来,归为不良反应。

  1.2.3作用对象

  跳蚤是世界范围内最常见的感染犬的危害严重的体外寄生虫,并且易于侵袭人类,跳蚤感染率很高,据报道,兽医处理的皮肤病病例有超过50%都是跳蚤感染性皮肤病;跳蚤防治带来的经济影响也很大,全球的宠物主人每年仅在与跳蚤有关的产品上就至少花费20亿美元。由于跳蚤等体外寄生虫威胁着宠物和人类的健康,并传播潜在的致病疾病,其中一些会造成严重的公共健康后果,认识到其感染的危害性以及其所带病原的潜在严重性和高流行性,所以我们需要安全有效的产品来对其虫体的侵染进行预防和治疗。

  跳蚤感染的峰值处于气温高,雨水多,潮湿的季节,此时跳蚤繁殖快;而在气温低,干燥的季节,感染处于最低值,这个时候是不适合跳蚤繁殖的。在大多数温带地区,一年中跳蚤出现数量的变化很大,冬季很少,但不会完全消失,然后从春季到秋季,跳蚤数量逐渐增多。据报道,在西班牙,意大利,匈牙利和德国,跳蚤感染的峰值通常处于6月至8月间,1月至4月期间最低。感染率从一年到另一年可能变化很大,但其变化也取决于地点,比如农村或城市,还取决于宠物能否进入户外活动。其感染可以导致直接的不适,引发过敏反应并传播致病物质。为了缓解跳蚤的直接不利影响,减轻过敏反应的影响,并且破坏跳蚤的生命周期,杀寄生虫剂的一个重要特征就是杀虫速度快。

  蚤目昆虫为小型无翅昆虫。虫体左右扁平,体长1-3mm,体表覆盖有较厚的几丁质,深褐色或黄褐色。头部三角形,侧方有一对单眼;触角3对,位于触角沟内。刺吸式口器,头小,与胸紧密相连,3节,有3对粗大的足。腹部分为10节,有7节清晰可见,后3节变为外生殖器。发育属完全变态。蠕形蚤科的昆虫,吸血后雌虫腹部显著增大,并呈卵圆形。蚤卵呈椭圆形,长0.4-2.0mm,白色有光泽。

  跳蚤感染分为仅寄生于犬和野生犬科动物的犬栉首蚤和寄生于猫和犬的猫栉首蚤。在欧洲国家,猫栉首蚤被发现于猫和犬感染案例的90%以上,是优势种。跳蚤有三种幼虫,一龄幼虫和二龄幼虫以植物和动物性物质(包括成年跳蚤的排泄物)为食物,三龄幼虫只作茧,不吃食,茧为卵圆形,不易被人发现,它通常附在犬的垫料上,几天后化蛹,总过程大约需要两周时间,即从卵发育为成年跳蚤。成年跳蚤吸血,分泌毒素,排泄有刺激性的粪便,引起急性散在性皮炎和慢性非特异性皮炎,有剧烈的痒感。犬、猫烦躁不安,啃咬、搔抓和蹭痒患部。在耳廓、肩胛、臀部或腿部附近可出现急性散在性皮炎,有的在后背部和阴部发生散在性非特异性皮炎。

  病初患部出现丘疹、红斑,病程延长时出现脱毛、落屑、痂皮、皮肤增厚和色素沉着。严重时出现贫血、消瘦。被感染时,被毛间可见白色有光泽的蚤卵,背部被毛的根部有煤焦油样的颗粒(蚤粪便)。感染特点是以荐背部、颈背部瘙痒性抓挠和红疹为主,瘙痒部位有游走性,以夏季和秋季常见。

  诊断要点一是根据临床症状(瘙痒不安等),二是观察到跳蚤或跳蚤粪便的存在,三是发现犬复孔绦虫结片的存在;四是根据跳蚤抗原的皮内试验结果。

  2.试验动物及方法

  2.1动物来源

  试验犬只来源于海口市公安局流浪犬猫救助中心,饲养规范,每天饲喂两次,采食标准犬粮。中心饲养人员2名,均能较好执行临床兽医医嘱。

  2.2品种和数量 

  试验犬品种不限,数量及性别等情况见表格1。试验犬共120只,其中受试药物组(沙罗拉纳咀嚼片)60只,对照药物组(福莱恩增效滴剂)60只。详情见表格3试验动物分组。

  表格 1试验用犬的品种、数量及性别等情况

  注:F=雌性,M=雄性,雄性犬只均为去势犬只。

  2.3病例选择

  试验犬品种不限,性别不限,年龄在8月龄至12岁龄之间,体重0.6kg以上。试验开始前5周内未曾用过抗体外寄生虫药。满足上述要求的试验犬均于给药前接受兽医的体格检查,进行外寄生虫感染程度的调查、确诊。

  对于跳蚤自然感染病例,在试验前跳蚤感染程度最低为2级。跳蚤感染程度分级标准见表格2。检查时需仔细计数观察到的在犬毛上或犬毛中跳动或移动的跳蚤数量,为弥补跳蚤计数准确性不够的缺点,同时计数蚤粪数量。

  表格 2跳蚤感染程度分级标准

  2.4试验分组

  将符合试验要求的犬按照病例的类型逐一编号,按照随机方式分配到受试药物组与对照药物组。对于混合感染病例,在实验分组及随后临床观察过程中,虽然观察总体临床疗效,但为了方便数据分析,每种病例独立记录观察结果,不交叉重复进行病例统计。

  表格 3试验动物分组

  2.5 病例淘汰

  使用受试药物不足推荐给药疗程的动物;因伴发其它疾病或需要联合用药,或中断治疗的动物,均予以淘汰。

  2.6给药方案

  2.6.1受试药物

  沙罗拉纳咀嚼片(Simparica),由硕腾(上海)企业管理有限公司(Zoetis Inc.)提供。

  以沙罗拉纳计,口服,每月1次,最小推荐剂量为每1kg体重,犬2mg。可在一年的任何时间启动治疗。对于跳蚤全年盛行的地区,可全年用药治疗(每月1次)。沙罗拉纳可能会引起异常的神经症状,如颤抖,本体感受减弱,共济失调,威胁意识减弱或消失,和/或癫痫。

  注意事项:1. 仅在兽医指导下用药。2. 仅供犬口服用。不能用于人和猫。3. 不能用于小于6月龄的犬或体重小于1.3公斤的犬。4. 对处于育种,妊娠和哺乳期的犬,尚未进行安全性研究。5. 给药后,应留心观察几分钟以确保动物服下全部的剂量。如果漏服,重新开始给药。6. 置于儿童和宠物不可触及。

  实验前对所有试验犬进行称重,在给药当天按照表格4所述用法用量给药一次。药片可直接口服,如犬不肯直接食用可将其混在犬粮中给药。给药后15分钟内观察犬是否有呕吐现象,需确保给药成功。整个试验周期内给药一次。

  表格 4沙罗拉纳咀嚼片用法用量

  注:对于体重超过60kg的犬,可将相同规格或不同规格的咀嚼片适当组合来使用(咀嚼片不能被分开)。

  2.6.2对照药物

  福来恩增效滴剂(梅里亚公司生产),由硕腾(上海)企业管理有限公司购买提供。

  实验前对所有试验犬进行称重,根据药品说明书在给药当天按照表格5所述用法用量给药一次。用药时分开犬毛至看到皮肤,将滴管前段抵住皮肤,适当挤出药液到皮肤上,最后用毛覆盖用药部位。

  表格 5福来恩滴剂用法用量

  2.7试验周期

  受试药物组与对照药物组的试验周期均为30天,分别在给药后第7、14、21、30天随访一次,观察相应指标。

  2.8观察指标及观察时间

  本试验的观察指标包括外寄生虫检查、临床局部和全身检查、血液常规值、生化指标、安全性评估,观察内容时间安排见表格6,7。

  表格 6跳蚤临床药效试验观察时间点和观察内容总结

  注:血常规与血生化检查在受试药物组中随机选择60只动物,在对照组中随机选择60只动物进行。采血时间点分别在给药前0天,给药后第7天,试验结束时即第30天。

  2.9临床检查与安全性评估

  2.9.1体外寄生虫检查

  在试验第0天,给药后第7、14、21、30天对犬进行体外寄生虫检查与计数。记录跳蚤感染(蚤粪分布与数量)等级,按6.1中提供的公式来计算活跳蚤及蚤粪的平均减少率。

  收集的跳蚤可通过流行病学调查及形态学特征进行鉴定,亦可根据需要采用分子生物学方法(PCR)进行进一步的鉴定。

  2.9.2临床局部检查

  在试验第0天,给药后第7、14、21、30天对犬皮肤进行检查,按照以下表9提供的评价标准评估犬局部瘙痒、红疹脓疹程度。

  表格 7临床检查各项指标评分标准

  注:“-”评分为0;“+”评分为1;“++”评分为2;“+++”评分为3;“++++”评分为4

  2.9.3临床全身检查

  在试验第0天、第7天和第30天对犬进行临床全身检查(体温、呼吸、心率、血液常规值、生化指标)。

  2.9.4安全性评估

  在试验第30天即试验结束时,根据与给药有关(或可能与给药有关)的不良反应或临床异常对药品进行安全性评价。评估标准见表格8。

  表格 8安全性评价标准

  2.10药物疗效与安全性评价

  2.10.1药效评价

  犬用药前后跳蚤(蚤粪)感染程度为药物疗效的主要评估指标,同时参考各组犬的局部瘙痒、红疹脓疹程度进行辅助评估。跳蚤(或蚤粪)平均减少率计算公式如下:

  平均减少率(%)=[(T0-Tn)/T0]´100%

  T0: {∑ln(第0天感染该寄生虫数值+1)}/治疗组内感染该寄生虫病例的总数

  Tn: {∑ln(第n天感染该寄生虫数值+1)}/治疗组内感染该寄生虫病例的总数

  n:第0天,给药后第7、14、21、30天.

  应用SPSS统计学软件对不同组试验动物每个采样时间点的各评估指标进行单因素方差分析,结果以各组的平均数±标准差表示,方差分析比较结果的差异性水平p<0.05。

  按以下标准判断药效:

  (1)有效:用药治疗期间和用药结束后,试验犬跳蚤(或蚤粪)数量平均减少率≥90%,患部无瘙痒、皮屑或试验动物自我啃咬的损伤。

  (2)无效:用药治疗期间和用药结束后,试验犬跳蚤(或蚤粪)数量平均减少率<90%,患部仍有瘙痒、皮屑等,动物自我啃咬性损伤明显存在。

  2.10.2安全性评价

  根据试验结束时对每个治疗组内犬的安全性评分结果,分别得出每组在0、1、2三个评分级别下犬的数量分布及百分比分布情况。

  3.实验结果与分析

  3.1跳蚤虫种鉴定

  形态学观察及PCR检测结果显示本试验中感染跳蚤为猫栉首蚤。

  ①形态学鉴定根据《兽医寄生虫学》蚤类鉴定资料蚤类鉴定要点,对收集的跳蚤在显微镜下进行了形态学鉴定:蚤虫体左右扁平,体长1~3mm,体表覆盖有较厚的几丁质,光滑,棕色。头部三角形,侧方有一对单眼。刺吸式口器,胸部小,3节,有3对粗大的肢。针状具刺的口器。各足基节特大,近端5个附节,有端爪1对。腹部10节,有7节清晰可见,后3节变为外生殖器。详见图1。

  图1跳蚤形态特征

  ②PCR分子生物学鉴定 通过观察跳蚤的形态学特征可鉴定样本为猫栉首蚤,为了验证形态学鉴定的准确性,本试验利用文献报道PCR方法测定跳蚤的细胞色素C氧化酶亚基I (COI)基因序列并与GenBank中基因序列进行比对。PCR产物经凝胶电泳检测后出现约700bp左右特异片段的PCR产物。将PCR产物送基因测序公司测序,得到较为完整的跳蚤线粒体COⅠ基因序列。将测得的序列提交NCBI进行BLAST分析,比对结果显示:跳蚤样本COⅠ基因序列与猫栉首蚤COⅠ基因序列相似度99%。再次验证了形态学鉴定结果。

  3.2药效评价结果

  表格 9试验组与对照组药效评价总结

  3.3结论

  沙罗拉纳咀嚼片(Simparica),按照推荐剂量使用,可以有效的预防和治疗犬跳蚤感染,用药后七天内即可达到良好的药效和治愈效果,药效可持续一个月,且没有明显的不良反应与副作用,适口性好,是一种安全有效的治疗犬跳蚤感染的口服产品。

  4.讨论

  4.1跳蚤的预防

  在临床实习中,我发现外寄生虫感染的皮肤病病例非常多,很少有动物主人能够完全做到一个月一次体外驱虫,三个月一次体内驱虫,大部分主人的观念还是觉得偶尔驱一次可以作用很久,或者不知道驱虫还有体内体外之分,或者不知道驱虫是需要不间断进行,而不是夏天虫多就驱一下就好,不少主人都是等到自家宠物被感染了才来到医院求助。如果主人能够提前使用药物预防,就不用担心带着狗狗去进行爬山之类的野外运动或者变换生活环境会引起寄生虫的叮咬感染。基于此,我认识到,大多数时候,主要利益相关者,即动物主人对驱虫的理解不到位或是没有积极实践,这一点是影响控制外寄生虫效果众多因素中很重要的一点。也促进我们思考,为什么市面上这么多种看似十分有效的防治产品,为什么控制体外寄生虫这么久,跳蚤感染发生率还是如此之高。说明我们在这方面对人的教育还需进一步普及和提升。总结一下跳蚤控制失败的常见原因,一是防治产品没有按规定时间按时给予,间隔时间过长或是冬季不给予;二是只有到了发现跳蚤感染的时候才进行给药;三是没有将处于同一生活环境的感染动物和健康动物有效隔离;四是使用剂量不正确,没有按相应体重和品品种给予;五是滴剂没有滴于皮肤而是滴在毛发上无法达到效果或是口服产品没有与适当食物一起给予以得到最佳吸收等等。

  我们对犬使用沙罗拉纳咀嚼片,正是出于动物福利的考虑,预防犬的跳蚤感染性皮肤病,动物主人也应培养起预防体外寄生虫的观念,不要等到犬身上已有大量可见的跳蚤甚至引起皮炎的时候才想起来要驱除杀灭跳蚤,一旦被感染上跳蚤,不仅仅会直接导致犬血液被吸食,出现瘙痒难耐等不舒服的感觉,甚至引起过敏性皮炎,也可能会危害到动物主人的健康,因为跳蚤是许多病原的载体,其中有些病原是人畜共患病如耶尔森菌(鼠疫)、伤寒立克次体 (斑疹伤寒)、巴尔通体(人的猫抓病)、绦虫中的犬复孔绦虫。上述概念强调需要将动物健康,人类健康和环境因素三者结合起来,同时要协调加强对动物和人群的媒介传播感染的治疗和预防这一研究重点,更好地理解人,媒介,动物,环境之间的相互作用,做到这些,将帮助我们增强对种种疾病的临床表现的了解。

  所以,我们人作为动物的依靠者,一定要真正了解到跳蚤综合防治的重要性和必要性,保持防治积极性,正确选择防治跳蚤感染的药物,为人类和动物创造出一个安全舒适的生活环境做出自己力所能及的努力。

  4.2沙罗拉纳的研究前景

  新型异噁唑啉类化合物沙罗拉纳的发现是进行药物化学、体内和体外寄生虫学、药理学、代谢和安全性研究的科学家在硕腾开展密集合作和多学科研究项目的结果。硕腾公司的科学家通过有针对性的合成和筛选程序发现了沙罗拉纳,该项目评估了3000多种单个化合物,根据其结构的独特性,效力,哺乳动物安全性和药物动力学适应性,负责人选择开发该物质,并对其进行长达一个月的效能分析。在至少一个月内,配制成风味的,可咀嚼药片的沙罗拉纳(2-4 mg / kg)对于治疗和持续控制跳蚤是有效的。对付猫栉首蚤,沙罗拉纳可以快速发挥作用,在8h治疗期内或随后28天的再次感染期中,可以控制超过98%的感染。这种持续而快速的效果带来的结果就是跳蚤35天的产卵完全停止,并且在模拟跳蚤感染的家庭环境研究中发现,在两周内,跳蚤数量减少了96%,然后第二个月用药后,狗身上已经不再发现跳蚤。一个月的试验后,沙罗拉纳也被证实对犬栉首蚤有效。在美国和欧洲进行的实地研究表明,在600多名主人拥有的狗中,用沙罗拉纳进行三次月度治疗是安全的。此外,沙罗拉纳非常适合口服片剂,在欧洲实地研究中,1280次为犬提供自由选择的机会,93%的情况下犬会选择沙罗拉纳咀嚼片,足以说明其适口性良好。对于犬来说,沙罗拉纳这种成分是一种在有效性、安全性和药代动力学方面都进行了优化的手性纯分子。在受试的3000多种化合物中,沙罗拉纳是最有效的,而且要比现在市场上在售的异噁唑啉类体外寄生虫杀虫剂,阿福沙纳和氟雷拉纳,更加有效。

  含有沙罗拉纳的咀嚼片能够在口服给药后对美国和欧洲的狗身上的跳蚤提供快速治疗和持续一个月的控制。为了尽快中断这些寄生虫的喂养,它在整个月内迅速开始起效以及保持极快的杀虫速度,这一特征对于减轻直接的不利和刺激作用以及降低媒介传播病原体的风险至关重要。

  当前,沙罗拉纳咀嚼片已经在北美、欧洲、亚洲多国市场上进行推广和应用,其驱跳蚤的临床疗效在本试验中也得到了肯定,其表现出的对目标寄生虫的效力,安全性以及其药理学和药代动力学特性,足以保证将其开发为犬每月口服驱虫产品。

  通过各类试验表明,沙罗拉纳是一种对哺乳动物安全性高、杀虫活性高的异噁唑啉类杀虫剂。相信随着国内外的科研工作者和研究机构对该类杀虫剂不断深入的研究和探索,相关的商业化产品也一定会日益丰富,而其研究、应用和推广工作的进一步增进,势必为当今的临床驱虫工作提供更多的选择和更好的效率。

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