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水产类论文 水产生物分子标记技术研究进展

2018-12-16 18:22:54来源:组稿人论文网作者:婷婷

  分子标记技术是根据物体所具有或者被具有的特性来认识物体的一种鉴别手段。在生命科学研究中,标记技术所采用的标记,通常是利用生物体或其显微结构,或其分子水平中的某一已知的遗传特点,或理化特异性而区别于其他个体或个体的某一结构。DNA分子标记是以生物大分子物质脱氧核糖核酸的多态性为基础的遗传标记,它能够稳定遗传,且遗传方式简单,可以反映生物的个体和群体特征。目前,它已被广泛地应用在基因定位、品种鉴定、资源评价、物种亲缘关系和系统演化分析、分子标记辅助选择等许多方面。

  近年来,水产养殖业迅猛发展,养殖的种类、数量越来越多,养殖的面积和规模越来越大,而培育优良品种是水产养殖业的重要发展方向。大多数水产生物的重要经济性状,如抗病力、生长速度、肉质等都表现为数量性状遗传.应用传统的遗传育种标记方法无法确定这些重要性状是由哪些具体的基因控制的,因此DNA分子标记技术无疑是水产生物遗传育种的有力工具。应用DNA分子标记技术进行水产生物种质资源研究、遗传结构特征分析、品种鉴定、资源状况的调查和评估,将有利于水产生物资源的保护、管理和开发;应用DNA分子标记分析水产生物亲缘关系、预测杂交优势、检测和评估育种效果、筛选优良品种,将有利于水产生物优良品种的选育、培育研究;应用DNA分子标记分析与重要经济性状有关的连锁基因,有利于重要经济性状基因的筛选、分离与克隆,从而有利于促进水产生物的品系改良的研究。由此可见,应用DNA分子标记技术来开展水产生物遗传育种是突破传统育种、有效开发和保护水产生物资源的重要途径。

  在经典遗传学中,遗传变异是指等位基因的变异,是生物个体或群体问遗传差异的客观表征;在现代遗传学中,由变异引起的遗传多样性是指基因组中任何座位上的相对差异,它是研究遗传学、育种学、生物分类学、物种起源与进化的重要技术手段。有效的遗传标记是探测生物遗传变异、研究生物遗传多样性的关键。遗传标记是生物体特有的性状或物质,指与目标性状紧密连锁、同该性状共分离且易于识别的可遗传的等位基因的变异,可以明确反映生物的个体或群体的特征,是生物个体或群体间遗传差异的客观表征。

  遗传多样性是遗传信息的总和。一般所说的遗传多样性是指种内的遗传多样性,或者称为遗传变异,即种内不同群体之间或者一个群体内不同个体的遗传变异的总和。而遗传标记就是表示遗传多样性的有效手段。遗传标记经历了4个发展阶段:①形态学水平;②细胞学和染色体水平;③蛋白质和同工酶标记水平;④DNA分子水平。前三种水平都是基因表达型的标记,可利用的多态位点较少,易受环境影响,不能满足遗传分的分子标记概念只是指DNA标记,而这个界定现在被广泛采纳。DNA标记是基因的直接反应,没有上位效应,不受环境和其他因素的影响;多态性几乎遍布整个基因组;能对各发育时期的生物个体、组织、器官甚至细胞进行检测,不受基因表达与否的影响,具有数量丰富、多态性强及操作简便等特点。这些分辨率好、信息量大的分子遗传标记目前已广泛应用于生物基因组研究以及生物的遗传育种、进化起源、分类等诸多方面,成为遗传多样性研究与应用的主流。

  一、常用分子遗传标记技术

  1.1 RFLP

  限制性片段长度多态性(RFLP)标记被认为是打响了基因组革命的第一枪,标志着生物科学进入了一个全新的时代。RFLP是20世纪80年代最为盛行的遗传变异分析方法。如其名所述,RFLP建立在用一种或者多种限制性内切酶酶切基因组DNA后产生的DNA片段长度差异的基础上。基因组DNA经一种或者多种限制性内切酶酶切后,可在琼脂糖胶上进行分离。为便于进一步分析,琼脂糖上分离的DNA片段需转移到相关固体载体上,如硝酸纤维膜或尼龙膜。利用放射性标记与目标位点亲和的DNA或RNA分子作为探针,可杂交检测可能具有片段长度差异的特定DNA位点,杂交之后,洗脱非特异性探针,只留下与特定位点杂交结合的探针。然后,将膜置于放射性自显仪下观测DNA条带差异。尽管RFI,P应用较广,但它只能检测比较大的DNA片段。因而,它只能检测大片段是否有插入或缺失,以及限制性位点的增加或丢失。由于琼脂糖凝胶电泳分辨率低,RFLP不能检测大量的点突变和小片段的插入和缺失。因而,在大多数位点上,RFLP的多态性较低。目前,RFLP标记已做了大量而富有成效的工作。但由于RFLP只能一次检测一个位点的遗传多样性,且多态性较低,加上费用较高,实验步骤繁琐,大大限制了RFLP的应用。需要特别指出的是,RFLP需要提供遗传信息,如探针的获得和序列信息。但在许多鱼类或其他水生生物中,这些信息是难以获得的。

  与最近发展起来的其他标记技术[如扩增片段长度多态性(AFLP)或微卫星标记]相比,RFLP标记在揭示遗传变异方面的能力相对较弱。大多数物种的基因组中都存在限制性位点的插入、缺失和重排,但在所研究的特定位点上发生此事件的概率则相当低。同样,在一个拥有109碱基对的基因组中,大约存在250000个的6碱基限制性识别位点(约占整个基因组的0.15%或1.5×106 bp)。限制性位点中的碱基替换也广泛存在,同样,在所研究的特定位点上发生碱基替换的概率也相当低。

  RFLP标记的主要优点在于它是共显性标记(比如在分析中可以观察到一个个体的两个等位基因)。因为片段大小差异通常比较大,因而其计数相对容易。AFLP的最主要缺点是多态性水平相对较低。此外,由于需要序列信息(PCR分析)或者探针(Southern杂交分忻),在不知道物种分子信息的情况下,分析较为困难和耗时。

  1.2 RAPD

  随机扩增多态性DNA(RAPD)是建立在聚合酶链式反应(PCR)基础七的多位点DNA指纹技术。RAPD技术于1990年首次出现,其方法是利用单一的短链PCR引物(长度为8~10bp),通过PCR随机扩增未知的核DNA片段。由于引物长度较短,且退火温度较低(通常为36~40℃),因此能扩增出数量较多的条带或产物,每个不同的条带或产物代表一个不同的位点。在相关物种、群体或个体间扩增出不同的条带,即产生了不同的RAPD标记。因而,RAPD标记是短链PCR引物在一个随机基因组位点上扩增出的差异性条带。由于绝大多数脊椎动物的核基因组为非编码区,所以大多数的扩增位点是中性选择。类群间基因组相同位点上的核苷酸变化导致扩增产物的出现或缺失,可用来评估同一类群内或不同类群间的遗传变异与分化。RAPD多态性可能主要由引物结合位点上的碱基替换,或引物位点间扩增区域的插入或缺失造成。RAPD的多态性相当高,通常一个单引物能扩增出j~20个条带。用多对能产生差异性扩增条带的RAPD随机引物即可实现对生物的全基因组扫描。由于每一条带(扩增产物的有或无)代表一个由两个等位基因组成的位点.因而RAPD反映的多态信息含量(PIC)要低于微卫星标记和单核苷酸多态性(SNP)标记。RAPD的扩增条带数要低于扩增片段长度多态性(AFLP)方法产生的条带数,其信息量也不如AFLP标记丰富。尽管如此,由于RAPD标记的多态性程度较高,操作简单。对实验设备和实验技能的要求较低,RAPD标记技术已广泛应用于水产养殖生物和其他生物的遗传分析。

  RAPD不仅具有以PCR为基础发展起来的所有标记的全部优点,同时还具有引物可以通过商业购买、不需要预先了解目的DNA的序列信息或基因结构等优点。尽管更高分辨率的非连续聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染技术已取得显著进展,但RAPD多位点扩增产物的琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色分离能节省更多的财力和精力。RAPD的另一个优势是能方便地进行大样本和多位点筛选。

  RAPD的主要缺点在于其低退火温度导致实验的低重复性。但如果仅对亮度比较高的扩增条带进行统计分析,这个问题并不是一个主要问题。实际上,在实验中并没有遇到很多关于重复性低的问题。当然,如果为了尽可能多地统计所扩增出来的RA]?D条带数,许多亮度非常弱的条带也被统计进去,那些弱条带可能不易重复,这就会导致实验结果的可靠性降低。也由于某些实验的低重复性,许多研究者错误认为RAPD条带并不遵循孟德尔遗传规律,在某些研究中,这个结论也来自纯合子状态被错误假设的前提下。RAPD的第二个缺点是它遵循显性遗传方式。由于显性遗传的特点,RAPD不能把显性纯合子和杂合子区分开。此外,非同源位点的PCR扩增产物的出现(来自不同DNA区域的相同长度扩增片段)限制了RAPD标记的应用。RAPD的这些缺点限制了它在渔业和水产养殖中的应用。

  1.3 AFLP

  RAPD和AFLP等基于PCR的多位点DNA指纹技术对于遗传变异研究极其重要,这类技术无需事先了解基因组信息就可以迅速产生大量的遗传数据,适用于各种研究对象,产生的指纹图谱可用于鉴定特定的DNA样品,或评价样品之间的相互关系;其保守的共有条带可界定亲缘关系,多态性条带则可界定系统学上的分化并用于群体遗传分析。

  AFLP综合了RFLP与RAPD方法的优点,其原理是通过PCR有选择地扩增部分基因组的限制性酶酶切片段:首先用两种限制性酶将基因组DNA切成片段,片段两端连接上双链DNA接头,接头序列和相邻的限制性位点序列作为引物结合位点;在PCR引物的3’末端加上选择性碱基,限制性片段只有两端切点后面的碱基与PCR引物的选择性碱基匹配才能被扩增,扩增的片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离产生AFLP指纹图谱。

  AFLP标记的主要优点有:①AFLP技术无需事先知道研究对象的DNA序列信息。这点对于水产养殖生物特别有用,因为水产养殖生物往往没有DNA序列信息可供利用。②花费较少的精力和资源就可以使AFLP产生很多多态性标记。③AFLP有大量的引物组合可供使用,是一个非常强大有效的检测基因组分化的标记系统,很容易检出微小的基因组的变异。④PCR反应中引物越长,退火温度就可设置得越高,PCR反应结果的重复性也就越强。在这一点上,AFLP技术显著优于重复性不高的RAPD技术。⑤每个AFLP引物组合通常都可以产生很多多态性标记,因此AFLP标记技术的成本相对低廉。尽管AFLP试剂盒价格较高,但平均到每个多态性标记的成本则较低。

  AFLP标记的主要不足之处在于其显性遗传的特性,实际上它只能检测到一个等位基因,能够提供的遗传信息比较有限;其真实的等位基因被记录作为一个不同的位点,因此AFLP分析将研究中观察到的位点数目夸大了。另外显性标记难以在不同实验室之间进行信息转移共享。此外,AFLP对实验技术要求较高,对仪器设备要求也较高,例如需要有测序凝胶电泳设备或自动DNA测序仪。

  1.4 微卫星标记

  微卫星由串联排列的1~6bp简单序列重复(如AC、CCA、GATA等)组成。根据重复序列的组成,微卫星通常分为单核苷酸微卫星、二核苷酸微卫星、三核苷酸微卫星和四核苷酸微卫星等。只包含一种简单序列重复的微卫星称为简单微卫星,含有两种及两种以上序列重复的微卫星称为复合微卫星。

  微卫星作为分子标记的优点包括:在基因组中含量丰富,分布广泛;长度小,能通过聚合酶链式反应(PCR)检测;呈共显性孟德尔式遗传以及丰富的多态性。微卫星作为分子标记的不足之处包括:需要预知研究对象基因组的分子遗传信息,为了获得微卫星引物必须做大量的前期工作,微卫星引物的设计、检测和PCR条件优化相当烦锁,工作量很大。所有微卫星位点必须逐一鉴定,逐一测定其侧翼序列以设计PCR引物。由于复制时聚合酶的滑动,一个微卫星位点的等位基因之间可能存在微小的长度差异(二核苷酸微卫星中可能小到只有2bp的差异)。为此,传统上是用放射性标记PCR扩增的微卫星DNA,在测序凝胶中电泳分离后,将X线片置于干燥后的胶板上曝光过夜,进行检测。使用自动荧光测序仪加上计算机控制的影像系统,已经能够在一天内完成实验并分析多得多的标本。

  微卫星标记一个位点上具有大量等位基因,在所有的DNA分子标记中其杂合度和多态信息含量(PIC)最高。近年来,微卫星已成为遗传研究中应用非常广泛的一种分子标记,近年创刊的《Molecular Ecology Notes》杂志E刊登的几乎全是从各种生物中新开发的微卫星引物或其等位基因频率的数据,就是证明。在过去十多年中,微卫星标记已被广泛用于渔业中包括遗传图谱、亲子鉴定、亲缘关系和种群结构等多方面的研究。

  1.5 SNP

  单核苷酸多态性(SNP)是指由点突变引起的DNA序列多态性,在某一特定的单个核苷酸位点上发生碱基替换产生不同的等位基因。从1977年DNA测序开始,这些由碱基替换引起的序列差异已经被很好地描述,但是直到20世纪90年代后期出现了一些重要的技术进步,才使得大规模的SNP基因分型研究得以迅速发展。随着荧光定量技术、基因芯片技术、焦磷酸测序技术和电离飞行时间质谱技术即基质辅助激光解析飞行时间质谱分析的发展,SNP以其在所有生物都具有极丰富的多态性再一次成为分子标记研究的热点,它适于自动化操作,并且能够显示其他分子标记和方法难以检测到的多态性。SNP分子标记被许多人认为是未来最佳的标记选择。

  SNP基因分型需要一系列技术和仪器设备,从小规模、低成本到高成本、高通量的检测系统。对于SNP基因分型研究来说,决定基因分型技术平台最重要的因素是设备的实用性。在设备能满足需要的情况下,可以根据预算数额、标记数量、个体数量和可靠性要求确定采用何种技术。虽然SNP在水产养殖基因组研究方面的应用尚处于较低的水平,但是随着越来越多的水产生物序列信息的获得,SNP标记将会得到普遍应用。同样重要的是,一旦遗传连锁图谱构建成功,数量性状位点的基因组扫描技术将会紧随其后发展起来,该技术用于研究水产生物重要的性状,而这又依赖于明确的功能相关分析的应用。因为SNP标记是性状一基因型相关分析重要的分子标记,它们在水产养殖上的应用将变得非常重要。未来少数从事水产生物基因组学研究的实验室将有可能绘制出包含大量SNP标记的遗传图谱,从而省去许多其他同类实验室的麻烦,使他们能集中精力进行生物学和养殖性状方面的研究。

  二、DNA分子标记技术在水生生物遗传中的应用

  2.1 水产动物遗传多样性分析

  遗传多样性指的是种内或种间表现在分子、细胞、个体三个不同水平的遗传变异程度,具体表现在DNA 分子水平的多态性、形态特征和核型特征。获取遗传结构信息和物种的遗传多样性不但对物种的遗传变异与系统地位的研究具有重要作用,还能为物种的分类和品种改良作基础。分子标记是基于基因的差异进行个体或群体遗传多样性分析的有力工具。常用于水产动物遗传多样性分析的分子标记有 RAPD、AFLP 和 SSR 等。孙景春等利用40个随机引物对玻璃红鲤、荷包红鲤和兴国红鲤及野鲤(俗称“江西三红”)进行了RAPD检测和聚类分析。结果表明:三个品种内,荷包红鲤的遗传距离最小;对于品种间,则是玻璃红鲤与兴国红鲤较为相似,“江西三红”之间的遗传差异较小。杨淞等运用AFLP分子标记技术,检测了橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼的种群遗传多样性。两个罗非鱼种群均具有较高的遗传多样性,橙色莫桑比克罗非鱼种群内遗传多样性相对更高些,两种罗非鱼的种间遗传距离为0.279,推测该杂交组合可能具有杂种优势。Mc Connel 对加拿大东海五个大西洋鲑群体的遗传多样性进行了微卫星分析。鲁双庆等采用微卫星技术,用 9 对微卫星引物对 4

  个鲫鱼群体普通鲫鱼、红鲫 、白鲫和彭泽鲫的遗传多样性进行研究。结果表明,4 个鲫鱼群体的遗传多样性总体水平较高,但白鲫的遗传多样性最高,鲫鱼的遗传多样性最低。

  2.2 水产动物亲缘关系研究

  种群亲缘关系的研究在水产动物选育过程具有非常重要的意义,它为确定育种方案、预测交优势提供了重要的理论依据。种群亲缘关系的传统研究方法是生化标记、细胞标记和形态标记,但这些标记方法由于具有标记数目有限、多态性较差、易受环境条件影响等不足之处,因此近年来已逐渐被分子标记所取代。用于水产动物亲缘关系研究的分子标记主要有 RAPD、RFLP、SNPs和 D-loop 等。张四明等利用 RAPD 技术对中华鲟、 达氏鲟、 史氏鲟、意大利鲟、短吻鲟、长江白鲟和匙吻鲟的基因组进行了研究,阐明了鲟形目鱼类的系统发育关系。Wilson 等利用mt DNA的RFLP分析了几种鲑科鱼类的系统进化关系,得到的结果与经典的形态分析结果相一致。Smith 等利用 10个SNPs 位点成功地将分别位于美国和加拿大流域的大鳞大麻哈鱼区分开来,其精确度达到95%。江世贵等用 mt DNA 扩增出细胞色素b(cytb)基因,研究了四种鲷科鱼类的分类地位与进化关系。王伟等对鳅鮀亚科两个属8个种10个个体 D-loop全序列进行了测定,探讨了鳅鮀鱼类的系统位置及属间相互关系。

  2.3 水产动物亲子鉴定

  亲子鉴定是依据亲代与子代的遗传特征来判断亲子关系的技术,在水产动物中已得到广泛应用。在水产动物家系选育中,利用亲子鉴定技术可以准确地鉴定不同的家系,这样就可以减少因分池饲养而产生的遗传差异,同时也节省了空间,降低了管理强度。另外在品种选育过程中,亲子鉴定还可以有效的防止因近亲交配而导致的种质退化。水产动物亲子鉴定最常用的标记方法是微卫星标记。

  孙昭宁等利用微卫星标记确定中国对虾后代的亲缘关系,以 4 个谱系清晰的家系为基础,检测两对微卫星标记在中国对虾家系鉴别中的应用,结果表明,利用两对微卫星引物产生的 DNA 指纹图谱,能够有效地区分中国对虾 4 个家系。

  Dean 等利用 8 个微卫星位点作为亲子鉴定分子标记,对同池养殖的22个日本对虾家系后代10%的最优个体进行亲子鉴定,从中筛选出生长较快及较慢的家系,并检测了在商业养殖环境中性状表达的基因环境互作效应。Jaime 等利用鲷科鱼类中发表的11个微卫星标记对金头鲷进行亲子鉴定,来自于8个不同池塘中的159个亲本产下的996个个体分别被鉴定出来。葛会争等采用8个微卫星标记对黑龙江野鲤♀×德国镜鲤♂(正交组合),及德国镜鲤♀×黑龙江野鲤♂(反交组合)进行亲子鉴定,结果表明,正反交组分别利用 6 和 8 个多态性良好的引物就能正确鉴定。

  2.4 水产动物种质鉴定

  种质鉴定在水产动物育种过程中具有非常重要的意义,鉴定出优良遗传变异的个体可以明显地缩短育种年限,从而使育种工作得以高效的进行。水产动物种质鉴定方法有很多,主要包括形态、养殖性能、染色体、同工酶和 DNA 分析等,其中建立在 DNA 水平上的分子标记技术由于具有不受环境影响、数量丰富、遗传稳定等优点而在近年来得到广泛应用。常用于水产动物种质鉴定的分子标记主要有RAPD、SCAR、RFLP、SSR 和 Cytb等。

  Govidaraju 等应用 RAPD 技术对 7 个石斑鱼群体进行了分析,为石斑鱼的系统分类和种质鉴定提供了依据。邹曙明等通过筛选获得了团头鲂良种“浦江 1 号”3 个特异的 RAPD 扩增带,将其转换成的 SCAR 标记 Sc-1 可作为检测团头鲂“浦江1 号”良种的一个重要的分子遗传特征指标。Be-matchez 等利用 RFLP 检测 mt DNA 多态性的方法鉴定了大西洋鲑的野生群体与养殖群体。Nielsen 等[8]利用微卫星标记技术对5 条丹麦河流中的大西洋鲑进行鉴定,结果发现除引进种外,这 5 条河流中仍有土著原种的分布。Barlett 等利用307 bp的Cytb 基因序列数据成功地区分了加拿大东海岸 4种有重要经济价值的金枪鱼 [大眼金枪(T. Ob-sus)、蓝鳍金枪鱼、长鳍金枪鱼和黄鳍金枪鱼]。

  2.5 水产动物 QTL 定位

  水产动物大多数经济性状属于数量性状,如生长速度、肉质、饲料转化率、抗逆性等,数量性状在连锁图上的定位分析(QTL)是水产动物遗传育种研究的重内容。当前,用于水产动物 QTL 定位研究的分子标记主要是AFLP和SSR。Nakayama 等利用 AFLP 技术和 BSA 在白化虹鳟中找到了四个与白化位点连锁的AFLP标记,并将其转化为微卫星标记,利用此标记已将白化座位定位于虹鳟连锁图谱的 G连锁群上。Sakamoto 等试图研究与虹鳟产卵时间有关的分子标记,结果发现分布于7个连锁组中的13个微卫星标记与产卵时间有关。Robison 等从219 个AFLP标记、2个微卫星标记和 1 个Alu I酶切多态标记共计222个标记中分别筛选出了与胚胎发育时间、胚胎长度、胚胎重量有关的分子标记。Ozaki 等利用121 个微卫星标记分析鲑鳟鱼抵抗感染性胰坏死病毒的 QTL,发现其中的2个标记 IPN R/S-1 和 IPN R/S-2 与IPN抗性显著相关。

  2.6 水产动物遗传连锁图谱构建

  遗传连锁图谱是基因组研究中一个十分必要的遗传工具,其在水产动物中最重要的用途就是将单基因和多基因控制的性状进行定位,然后克隆这些基因进行基因或标记辅助育种。遗传连锁图谱的构建主要采用分子标记的方法,用于水产动物遗传图谱构建的分子标记主要有RAPD、SSLP、AFLP、SSR和 SNPs 等。孙效文等利用 RAPD 技术与 SSR 技术建立了鲤鱼遗传连锁图谱。图谱中有 RAPD 标记56个、SSR 标记91个、鲤鱼基因组大小5789 c M左右,共建连锁组50个,其中最大 347 c M,最小 17 c M。Liu等利用AFLP技术比较了斑点叉尾鮰和蓝鲶的差异,其中的 53 对引物产生的2572个AFLP标记可用于鲶连锁图谱分析。 日本学者Coimbra 等将微卫星标记和AFLP标记结合起来,构建了牙鲆的第 1 张遗传连锁图谱。Gilbey 等利用微卫星构建了大西洋鲑鱼连锁图,连锁图中包含了 15 个连锁群和 11 个非连锁群,其中 15 个连锁群中共存在 50 个微卫星标记。Stickney 等采用寡核苷酸微阵列技术,构建了斑马鱼的第一幅SNPs遗传图谱,该图谱由25个连锁群组成,包括 1 930 个 SNPs,全长3 000 c M,平均分辨率为6.98 c M。

  2.7 水产动物分子标记辅助育种

  育种是指采用一定的方法将育种材料中有用的遗传变异转移到新品种中的过程。传统的育主要采用表现型选择的方法,但这种方法在新品种的培育方面往往需要花费很长的时间。育种家在长期的育种实践中不断的尝试采用遗传标记来提高育种的选择效率与育种预见性。传统的遗传标记方法由于存在着一定的局限性,因此难以满足遗传育种工作的需要。新近发展起来的分子标记辅助育种技术由于是直接通过分析相关分子标记的基因型来获得期望的个体因此可以大幅度提高育种的效率。当前,用于水产动物分子标记辅助育种的分子标记主要有 RAPD、AFLP 和 SSR 等。

  Elo 等利用 RAPD 分子标记技术对大西洋鲑和褐鳟进行了杂交实验的研究,结果发现 RAPD 技术是一种非常有效的标记辅助育种手段。刘云国等利用61对AFLP引物组合扫描了牙鲆感病群体和抗病群体各20个个体,扩增出3200条带,8 条AFLP带在2个群体中显示了极大的差异,其中2条带是在抗病群体中出现的高显性基因频率的标记,另外6条带是在感病群体中出现的高显性基因频率的标记,推测这些标记很可能是与抗病性相关的候选标记,这些候选标记的获得为实现牙鲆分子标记辅助育种和抗病基因克隆奠定了一定基础。鲁翠云等利用微卫星标记辅助进行镜鲤家系的建立及选育,通过对亲本遗传结构及遗传差异进行分析,预测产生优良家系的最佳配组。用 28 个微卫星分子标记评估松浦镜鲤亲本群体的遗传潜力,结果显示,群体处于高度的遗传多样性水平,具备进一步繁育筛选优良群体的潜质。

  三、研究意义及前景展望

  目前分子标记技术已飞速发展,并被广泛应用于水产生物的遗传研究中,但总体来说,不管是国内还是国外,在水产动物方面的应用仍处于初始阶段。我国水产生物技术起步较晚,基础薄弱,但应用前景广阔,分子标记技术是我国海水养殖动物持续发展的重要保证技术之一,建立在分子标记基础上的性别相关标记辅助选育技术也已在部分养殖品种的选育上发挥重要作用,取得了显著成效。分子标记技术和传统遗传选育技术相结合,必将在水产养殖生物种质改良中发挥越来越重要的作用。

  水产生物性别决定的分子标记研究具有重要的理论和现实意义。首先,鉴定海洋和水产生物性染色体,进一步探讨性染色体进化的模式并协助克隆性别决定基因,对脊椎动物性染色体的起源和性别决定模式的进化等理论问题的研究有积极意义。其次。研究性别决定的分子标记,实现单性养殖,是提高生长速度或控制生态环境的有效育种方法之一,可以大大提高经济效益。最后,水产生物性别分化受到环境温度、环境中的外源激素等条件的影响,从而导致天然水体中的水产生物产生性逆转和性比例失调。性别相关分子标记的研究为遗传性别的鉴定提供了有利手段。例如,在野外调查中发现美国哥伦布河中的大鳞大麻哈鱼雌性异常增多。通过性别特异的分子标记证实,很高比例的雌性实际上是遗传上的雄性,由于河流中外源性激素等的污染,导致一些大麻哈鱼个体成长中自仔鱼阶段开始就性别发育异常。这样的环境问题在我国很可能也存在,但是相关的分子水平的研究还有待起步。

  水产生物性别决定的研究还有许多问题有待解决,主要有:①由于海洋和水产生物性染色体分化程度较低,加之染色体细小而数目众多,凭借目前的细胞遗传学显带技术,开展更多性染色体标记和鉴定还有较大困难;②具有良好性染色体分化的海洋和水产生物较少,而且这些种类的研究成果不一定适合于更原始的性别决定类型。

  随着分子生物学的飞速发展,新的研究思路以及新的分子细胞生物学和分子遗传学研究方法不断成熟,对水产生物性别决定的分子基础研究将会有很大促进作用,海洋和水产生物性别决定的分子遗传研究领域也正在不断地深入和拓宽。尽管海洋和水产生物性别决定有复杂与多样的一面,但是也有其优势。例如,具有雌雄同体和雌雄异体等性别系统;性别分化期对激素很敏感,因而人工诱导性转换相对容易;另外,一些水产生物如青和剑尾鱼繁殖周期短,它们是研究性别决定的良好模型。另外,河纯和斑马鱼等模式生物基因组序列与人类基因组序列一起,可以作为水产生物的性别决定候选基因或相关序列片段进行同线性比较的模板。

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