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生物科学类论文 DDRGK1基因敲除小鼠在旷场实验中的行为分析

2018-12-21 11:35:49来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘 要 目的 本实验以DDRGK1基因敲除小鼠(c20h)为例,通过在旷场实验中观察其与野生型(wt)小鼠的行为表现,分析DDRGK1基因敲除小鼠的自发活动行为。方法 通过基因型鉴定区分DDRGK1敲除型和野生型小鼠,再各选取13只同期小鼠分别在其2、3、4月龄进行自发活动行为分析,初步判断基因敲除小鼠的行为活动。结果 2月龄小鼠自发活动能力无差异,3、4月龄c20h小鼠活动能力低于wt小鼠;c20h小鼠焦虑水平低于wt小鼠。结论 DDRGK1基因敲除小鼠丧失了部分蛋白酶体调控功能降低了部分生物活性,可能降低了小鼠的部分神经功能从而处于较低焦虑水平。

  关键词:旷场实验;c20h小鼠;UFM1系统;DDRGK1

  引言

  旷场实验(open field test,OFT)又称敞箱实验,是一个常用来检测小鼠自发活动行为(locomotor activity)和探索行为(exploratory behavior)的行为学实验.此实验历史悠久,是1934年由Hall等研究者发明,根据啮齿类动物兼具有畏惧空旷场地和探究新事物、新环境的天性,所以在空旷场地中其活动具有趋避性(thigmotaxis)。目前,常用的OFT系统多由一个方形盒子和一个连接电脑系统的摄像装置构成,将小鼠放在旷场内,即可自由活动,通过录像记录下其运动轨迹及运动时间和速度等各项指标以供后期分析小鼠在旷场中的活动。OFT在评价动物自发活动及焦虑状态的相关行为学实验中具有代表性,被称为经典行为学实验。

  目前,OFT被广泛使用在小鼠行为学研究中,同时也在大脑神经学与精神药理学研究方面起重要作用,在使用了抗精神病药物的例子中,常在OFT中检测药物对行动的影响、睡眠等。在行为学研究中,OFT往往用来做对照,用以反映实验动物的自发活动行为。因为其实验操作简单,所得数据量丰富,一次实验就可以对动物的自发活动、探索行为及焦虑、抑郁状态进行定量评价,所以在药物的研究与开发中得到广泛应用。

  翻译后修饰(Post-translational modifications,PTM)即翻译后蛋白质的化学修饰,蛋白质合成后其某个或某些氨基酸侧链被不同的基团或蛋白修饰,使蛋白质的结构复杂化,从而在一定程度上改变完善该蛋白的功能,也使其作用更加专一,其在蛋白质的折叠、细胞内定位、稳定性及正确行使功能等方面发挥着重要作用。我们早已熟知一些蛋白质小基团修饰,如甲基化、磷酸化、乙酰化等,均改变了蛋白质的功能使得蛋白质在参与生物系统功能时更加灵活,据最新研究发现还有一些分子量较小的蛋白质修饰,如泛素和类泛素蛋白修饰。泛素折叠修饰蛋白(ubiquitin-fold modifier1,UFM1)是近年来发现的一种类泛素蛋白(Ubinquitin-like proteins,UBL),又称为C13orf20,与泛素的修饰功能类似,即类似泛素分子同样可共价结合到其它靶蛋白上,这种现象称为ufmylation。目前发现在内质网应激、细胞稳态等生物过程中,均有ufmylation在发挥重要作用,许多疾病的发生也与其相关,如癌症、缺血性心脏病等。UFM1是一种独特的类泛素蛋白,发现其C端只有一个甘氨酸,但在细胞中不以此形式存在,而是以前体形式存在于细胞中,其C端有两个多余氨基酸,必须经过酶切处理,暴露羧基端的甘氨酸才可在细胞中发挥连接靶蛋白的作用。这个成熟过程,由UfSP1和UfSP2这两种UFM1特异性半胱氨酸蛋白酶催化来实现。UFM1先通过类泛素激活酶(E1,UBA5)激活成为有活性的蛋白,再从UBA5通过酯交换反应转移到类泛素结合酶(E2,UFC1)的Cys116,在ATP作用下,类泛素连接酶(E3,UFL1)将UFM1从UFC1上转移到底物蛋白赖氨酸上,与UFM1上的甘氨酸残基形成异肽键,完成与靶蛋白的连接。

  近期在乳腺癌发展中发现的UFM1修饰底物蛋白ASCI(Activating signal cointegrator1)。被发现当17β-雌二醇存在时,连接在E3(UFL1)上的UFM1必须先与UFBP1(UFM1-binding and PCI domain-contain protein 1,也称为DDRGK domain-contain protein 1)结合,才能连接到ASCI上。这个现象说明ufmylation可能具有两条不同的修饰途径,同时可以发现在ufmylation中UFBP1发挥着重要的生物功能。

  图1 Ufm1修饰系统示意图

  Ufm1以前体形式被合成,经过半胱氨酸蛋白酶UfSP1和UfSP2剪切,暴露甘氨酸残基被活化。随后在ATP供能的情况下,暴露甘氨酸的Ufm1被类泛素化酶Uba5激活,形成高能硫酯键;接着,Uba5将激活的Ufm1转移到类泛素结合酶Ufc1上,形成另一类似的高能硫酯键;随后,Ufc1和类泛素连接酶Ufl1共同识别靶蛋白C20orf116,Ufm1-C20orf116共价结合体可以被UfSP1和UfSP2剪切,释放Ufm1参与新的循环。

  材料与方法

  1.1试剂与仪器

  裂解液,PCR体系(上下游引物、dNTP、buffer、Taq酶、样品),10xPBE,琼脂糖,溴化乙锭;金属浴,PCR仪,凝胶电泳仪;旷场实验动物行为学分析系统。该仪器主要由一个尺寸为40cm×40cm×30cm的敞口箱子组成,用支架在箱子上部安置一架摄像机,用电脑系统关联,通过在电脑桌面上设置实验时间段录像,记录下小鼠在旷场中的活动数据,将小鼠放入旷场中,调节周围光源,使盒子中央光线偏暗,小鼠识别清晰,箱子底部被网格划分为四个角、四个边以及中央区域,四个角分别为左上、左下、右上、右下,每个角面积10cm×10cm,四个边分别为上、下、左、右,面积约20cm×10cm,箱子中央区面积约20cm×20cm,四个角和四个边之和即为周边区,上述区域可由软件系统在图像上自动分析,实验数据由OFT相关软件分析记录,OFT系统示意图见图2。

  10cm 20cm 10cm

  左:系统为敞口箱,箱子上部悬置摄像机记录动物行为;右:旷场被分为四角、四边和中央区。

  图2 旷场系统示意图

  Figure 2 Schematic diagram of the open-field system

  1.2实验动物

  DDRGK1基因敲除小鼠及其同窝野生型对照小鼠,来自南京,各13只,均为雄性,分别在其2、3、4个月龄进行自发活动实验。小鼠饲养在恒温(21-22℃)房间,实验选取时间段为14:00~18:00,非实验期间小鼠自由进食标准鼠粮及饮水。我们对该小鼠运用Cas9技术特异性敲除构建的受精卵细胞DDRGK1基因打靶载体,再将处理后受精卵细胞放入假孕小鼠体内以此获得全身敲除DDRGK1基因的小鼠,由于敲除一对基因的纯和子不易成活,得到DDRGK1基因杂合子及未敲除的野生型。

  1.3实验方案设计

  1.3.1实验概述

  使用基因敲除DDRGK1的c20小鼠,鉴定得c20小鼠DDRGK1基因杂合子(c20h)并记下基因型、编号及出生日期,同时留同期野生型小鼠作对照。分别在其2、3、4月龄时在下午同一时间段进行小鼠自发活动行为探究。

  1.3.2实验步骤

  1)实验当天11:00左右将待实验动物提前从鼠房里连同鼠笼一起拿出放在行为学实验室桌子上,适应环境3小时左右,减少动物紧张。

  2)当天14:00左右打开旷场实验装置,并确认敞箱清洁、无味道(尤其注意彻底清理上次实验留下的小鼠粪便、尿液等),设置实验箱参数及各项指标,同时在操作软件中记录小鼠的基因型、编号、日期。

  3)将小鼠从笼内取出(拎着尾巴,背向实验者),将其放在敞箱中央,实验者离开。

  4)打开录像记录系统,记录小鼠在OF内的活动,总时间15min。

  5)将小鼠放回原来的鼠笼内,用75%乙醇擦拭OF装置,清除上一只小鼠的气味,并用纸巾擦干。

  6)实验结束后将实验结果导出进行后续数据分析。

  1.4实验数据分析

  用GraphPad Prism6软件进行统计分析,并作出相关图示。

  结果

  现在以DDRGK1基因敲除小鼠(c20h)及其同窝野生型对照(wt)为例,用旷场实验装置分别检测2、3、4月龄小鼠的自发活动行为。

  2.1总体活动情况

  2个月龄的c20h小鼠在OF中15分钟内活动总路程为(4814±119)cm,wt小鼠总路程为(4592±82.74)cm,二者无显著差异(p>0.05,图3A);3个月龄的c20h在OF中15分钟内总路程(13096±210.9)cm显著(p<0.05)小于wt小鼠总路程(6505±152.5)cm(图3B);4个月龄的c20h在OF中15分钟内总路程(5179±141.3)cm显著(p<0.05)小于wt小鼠总路程(9771±549.9)cm(图3C)。

  B

  C

  A

  图3 旷场内小鼠活动总路程

  Figure 3 Total distance of mouse activity in the open field

  注:A:2个月龄小鼠总路程;B:3个月龄小鼠总路程;C:4个月龄小鼠总路程。

  2.2周边区活动情况

  周边区由四个边和四个角组成,所以周边路程即为四边路程之和加上四个角路程之和,在此我们只分析小鼠周边区活动路程。2个月龄c20h小鼠在周边区活动路程为(4625±111.7)cm,显著(p<0.05)大于wt小鼠(4274±74.04)cm(图4A);3个月龄c20h小鼠在周边区活动路程(6121±147.0)cm,显著(p<0.05)小于wt小鼠(12340 ±200.5)cm(图4B);4个月龄c20h小鼠在周边区路程(4885±125.2)cm,显著小于wt小鼠(9015±526.6)cm(图4C)。

  A

  C

  B

  图4 旷场内小鼠活动周边区路程

  Figure 4 Distance of mouse peripheral area in the open field

  注:A:2个月龄小鼠周边区路程;B:3个月龄小鼠周边区路程;C:4个月龄小鼠周边区路程。

  2.3中央区活动情况

  2月龄c20h小鼠中央区活动路程(188.5±10.59)cm,显著(p<0.05)小于wt小鼠(255.2±15.54)cm(图5A);3月龄c20h小鼠中央区活动路程(383.7±7.469)cm,显著(p<0.05)小于wt小鼠(756.6±12.43)cm(图5B);4月龄c20h小鼠中央区活动路程(293.4±17.40)cm显著(p<0.05)小于wt小鼠(755.4±48.54)cm(图5C)。

  A

  B

  C

  图5 旷场内小鼠中央区路程

  Figure 5 The distance of mice in the central area

  注:A:2月龄小鼠中央区路程;B:3月龄小鼠中央区路程;C:4月龄小鼠中央区路程。

  讨论

  本文用全身敲除DDRGK1基因的c57系列小鼠及其同窝野生型小鼠作对照,在OFT系统内记录分析小鼠的自发活动行为,比较分析基因敲除小鼠的活动能力及精神状态。旷场中总路程被视为反映小鼠自发活动的主要数据。OFT的设计原理是来自于小鼠的趋避性,具体意思是指将小鼠放入陌生环境,小鼠畏惧开阔、未知、可能存在潜在危险的场所,因而其有“贴墙”活动的天性。

  OFT实验中总路程主要用来反映小鼠的自发活动能力,从图3可以看出来2月龄小鼠自发活动能力没有区别,而3、4月龄小鼠野生型活动能力明显强于c20h小鼠,且3月龄小鼠活动能力最强,小鼠在不同年龄阶段基因型表现不同,2月龄小鼠还比较小,而4月龄敲除基因的杂合小鼠可能开始产生一些缺失基因型的表现从而造成活动能力相对偏低。中心区域路程和周边区域路程主要是用来判断小鼠的焦虑程度,当中心区域活动相对越多时,小鼠的趋避性和焦虑程度越低,反之则越高。从图4,图5可以看出2月龄c20h小鼠相对于wt小鼠中央区活动较少,焦虑水平较高,而3、4月龄c20h小鼠周边区路程和中央区路程均小于wt小鼠,焦虑水平较低。随着小鼠年龄增大,c20h小鼠与wt小鼠运动能力出现变化,同时发现3、4月龄小鼠c20h与wt运动能力出现明显差距,基因敲除后小鼠运动能力低于野生型小鼠,且DDRGK1基因敲除小鼠更具有“冒险”精神,倾向于在中央区运动,焦虑水平低于野生型。

  研究发现DDRGK1在蛋白质折叠、蛋白质稳定性或蛋白质转运等方面有较为重要的生物学功能,其相互作用蛋白主要参与蛋白酶体通路、ATP合成、细胞周期、缺氧反应和血红素合成等途径。UFBP1对其相互作用蛋白有提升、稳定、降低3种调控方式,不同蛋白调控方式不同,对小鼠的生长发育造成多种影响。通过本次旷场实验仅仅观察到2、3、4月龄小鼠的自发活动行为,粗略来看DDRGK1基因敲除小鼠焦虑水平低于野生型小鼠,运动能力也偏弱。

  本实验操作主要是通过肉眼观察及后期数据分析,操作技术相对简单、应用比较广泛,但同样易受到一些相关因素的影响,因此在实验过程中要格外注意。例如小鼠饲养环境、性别、食物及饮水、背景、昼夜节律等。注意在同一时间段选择同样月龄的雄性小鼠进行旷场实验,因为雌性小鼠受性激素影响较大,增加了实验的影响因素。运用同样的方式拿出小鼠并放置在敞箱中。小鼠具有记忆能力,一般每只小鼠最多进行一次旷场实验。每做完一只小鼠一定要将敞箱清理干净,清除上一只小鼠的气味,且实验者在室内要保持安静不要发出大的声响,以免造成小鼠惊慌,从而影响了实验数据的可靠性。

  自该实验发明以来应用广泛,可作为其它行为学实验的对照实验、研究探索行为的实验、研究焦虑和抑郁的实验。该实验对小鼠各方面影响较小,一般先进行旷场实验,再进行强迫游泳、水迷宫、高架十字等相关实验以获取更多小鼠相关行为数据,根据要研究的方向不同采取不同的实验设计,本次实验仅仅通过小鼠自发活动的路程简要分析小鼠行为。

  综上所述,本文简要介绍了DDRGK1基因敲除小鼠相较与野生型小鼠的行为变化,初步得出基因敲除后小鼠活动能力减弱同时焦虑水平也偏低。为了获得更多的数据可以在小鼠生长一定月份后继续探究以获得更多相关信息。

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