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生物科学类论文 非洲兽总目RNase2/3和RNase4的分子进化研究

2018-12-20 11:33:18来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要:RNase2/3和RNase4均属于RNase A超家族中的重要成员,并多次被用作分子进化研究的模型。基于基因组水平,我们对NCBI上现生非洲兽总目的7个代表物种开展RNase2/3和RNase4的分子进化研究。通过TBlastN和BlastN的科研方法分析每个代表物种的同源序列,共获得非洲兽总目RNase2/3序列3条(1条功能基因和2条假基因),RNase4序列8条,在土豚中为2个拷贝。这一结果揭示RNase2/3在非洲兽总目中发生了“基因丢失”和“假基因化”事件,RNase4则发生1次基因复制。对其序列比对和翻译,发现,RNase2/3和RNase4均具有RNASE A超家族成员的典型特征同时,我们还结合系统发育树和等电点开展分析,旨在探讨RNase2/3和RNase4在非洲兽总目中的进化之谜!

  关键词:非洲兽总目;RNase2/3;RNase4;分子进化;基因复制;等电点

生物科学类论文 非洲兽总目RNase2/3和RNase4的分子进化研究

  1 前言

  近年来,模式物种基因组相继公布,许多学者对生物的分子进化产生了浓厚的兴趣。RNASE A超家族作为分子进化的典型模型之一,其不同成员在各物种的数量及生物学功能方面均存在一定的差异,即使是同一成员,在同一时期不同物种或不同时期同一物种中,其数量和生物学功能也可能不尽相同。同时,非洲兽总目作为哺乳纲的一大类群,种群数量庞大,分布范围广,属于濒危物种,且物种间的关系极为复杂,在种群的划分,扩散与迁移等方面一直存在较大的争议。基于上述情况,我们主要对非洲兽总目7个物种的基因组开展核糖核酸酶4(RNase 4)和核糖核酸酶2/3(RNase2/3)的分子进化研究。

  1.1 RNASE A超家族概述

  核糖核酸酶-A(RNASE A)超家族是一类分泌型同源蛋白,为脊椎动物特有。它作为核酸水解酶(RNase)的重要家族之一,深得学者的青睐,与其它酶家族相比,其研究最为广泛,仅酶活性有关的研究就长达50年有余。研究表明,RNaseA最早是从牛的胰腺组织中进行分离纯化的,以牛胰腺核糖核酸酶-A(Ribonuclease-A,RNase-A)超家族作为它的代表。目前,关于RNASE A的研究已经有大量的报道,主要包括结构特征、生理特性和生理功能等方面,随着科学技术及经济和社会的快速发展,人们对RNASE A超家族的研究已取得了一系列研究成果。2009年,董安康等研究指出,RNASE A超家族以宿主防御作为起源的最初功能。2012年徐博宁等人对人类核糖核酸酶基因超家族研究发现,RNASE A共包括15个成员,这些成员彼此间具有一系列相同的结构特征:包括有催化活性的氨基酸残基;6-8个结构半胱氨酸;保守的功能区“CKXXNTF”;编码区由成熟肽和信号肽组成以及单个外显子构成开放阅读框等。引人注目的是,许多学者通过研究调查发现,这些成员不论是在基因序列上还是组织表达和生理功能上都存在一定的差异。

  在RNASE A超家族的15个成员中,有关RNase1至RNase8的研究较多,RNase9至RNase15的研究相对较少。比较不同物种RNase1氨基酸的等电点发现:RNase1的等电点在一些物种中较低,而在另一些物种中则较高,且存在基因复制和假基因化事件;关于这一现象——董哲等推测前者可能是RNase1与具有促进食叶食性生物的营养需求这一生物学功能而表现出的适应前肠酸性环境的生理特征;Xu等则推测后者可能是RNase1在那些物种中的生物学功能不再与消化功能相联系而与宿主防御有关所导致。同RNase1相比,核糖核酸酶5(ANG;RNase5)的晶体结构与其相似,与核糖核酸酶超家族各成员间的同源性也很高,却属于特殊的家族成员:ANG的核糖核酸酶活性很低,但在诱导血管生成方面却具有不可替代的作用(目前已有大量的报道)。与RNase5截然不同,有关RNase6分子结构特征、生物学活性和作用机理等方面的研究报道均很少,目前尚未有较深入的研究报道。董哲等的研究报告还表明,RNase7和RNase8可能是由较近的一次基因复制产生,它们结构上非常相似,但在生理功能方面却存在一定的差异。

  1.2 EAR和RNase4研究背景

  在核糖核酸酶-A超家族中,RNase2/3和RNase4均占有极为重要的地位。其中,RNase2/3为核糖核酸酶2(RNASE 2;EDN)和核糖核酸酶3(RNASE 3;ECP)的合称:EAR。在EAR中,EDN和ECP同源序列的相似性高达67%,即它们结构上很相似。值得注意的是,RNase2和RNase3的生物活性功能不同:EDN抗寄生物的活性低于ECP,但在神经毒素的毒性方面则高于ECP。此外,陶凤云等人的研究也表明,EDN能降低特定病毒的感染力,但几乎不具备杀菌能力,而ECP细胞毒性较为广泛,具多态性和杀菌功能。董哲等关与翼手目RNase 4的研究则明确指出,RNase4是家族中序列最短、最保守的成员,与RNase5同时被发现,且都是在肝脏中进行表达的。2013 年,盛静浩的研究表明,RNase4是一种与肿瘤有关的双重活性蛋白质,它能够促进肿瘤生长和肿瘤血管新生。2014年,盛静浩和许正平的研究调查又进一步发现,成熟的RNase4蛋白是单链的分泌型碱性蛋白。从整体来看,目前有关EAR和RNase4生理功能的研究报告较多,但有关生物进化的研究相对较少,揭示我们急需开展非洲兽总目RNase2/3和RNase4的分子进化研究。

  1.3非洲兽总目概述

  非洲兽总目(Afrotheria)属于哺乳动物纲(Mammalia),包括七个目,即:重脚目(Embrithopoda;灭绝),索齿兽目(Desmostylia;灭绝),食虫目(Insectivora),长鼻目(Proboscidea),海牛目(Sirenia),管齿目(Tubullidentata),象鼩目(Macroscelidea)。该类群种类和数量繁多,分布地域广阔,占据几乎整个欧洲的地理范围和马达加斯加哺乳类的三分之一,但它们都属于濒危物种,且各方面的关系都非常复杂,相关研究存在较多的争议。例如,剑齿象为长鼻目(Proboscidea)剑齿象科的重要成员之一,在19世纪70年代,它首次被Owen所记述。100多年以来,许多古生物学者曾多次对其一些种的分布、特征和性质等不断地进行修正,归纳和总结,但在其起源地、物种的扩散与迁移等方面一直存在较大的争论。2011年,古生物学者陈冠芳在对前人的研究进行了归纳和分析后,再次以剑齿象牙齿特有的典型特征作为依据对剑齿象的划分提出了自己的看法,并对分类位置还不确定的物种进行了归纳,但尽管这样有关剑齿象的分类与分布等问题依然没有得到解决。

  2 材料与工具

  2.1 研究材料

  本次研究包括非洲兽总目5个目,7个科7个物种。即:食虫目(Insectivora)金毛鼹科(Chrysochloridae)的金毛鼹(Chrysochloris asiatica)和马岛猬科(Tenrecidae)的小马岛猬(Echinops telfairi);管齿目(Tubulidentata)土豚科(Orycteropodidae)的土豚(Orycteropus afer);象鼩目(Macroseelide)象鼩科(Macroscelidea)的埃及象鼩(Elephantulusedwardii);长鼻目(Proboscidea)象科(Elephantide)的非洲象(Loxodonta africana),海牛目(Sirenia)蹄兔科(Procaviidae)的岩蹄兔(Procavia capensis)和海牛科(Trichechidae)的佛罗里达海牛(Trichechusmanatus latirostris)(表1),利用树懒亚目(Folivora)树懒科(Bradypodide)的霍氏树懒(Choloepus hoffmanni)为外群物种。

  亚目

  (Suborder)科

  (Family)种

  (Species)简写(Abbreviation)基因数(Gene number)RNase2/3RNase4管齿目(Tubulidentata)土豚科

  (Orycteropodidae)土豚

  (Orycteropus afer)Oa02长鼻目

  (Proboscidea)象科

  (Elephantide)非洲象

  (Loxodonta africana)La1(0/1)1食虫目

  (Insectivora)金毛鼹

  (Chrysochloridae)金毛鼹

  (Chrysochloris asiatica)Ca01海牛目

  (Sirenia)蹄兔科

  (Procaviidae)岩蹄兔

  (Procavia capensis)Pc01海牛目

  (Sirenia)海牛科

  (Trichechidae)佛罗里达海

  (Trichechusmanatus latirostris)Tl1(0/1)1外群

  树懒亚目

  (Folivora)树懒科

  (Bradypodide)霍氏树懒

  (Choloepus hoffmanni)Ch2(1/1)1注:基因数栏中,括号外面的数字表示RNase2/3和RNaase4数,括号内中斜线前与斜线后的数字分别表示功能基因数与假基因数

  注:基因数栏中,括号外面的数字表示RNase2/3和RNaase4数,括号内中斜线前与斜线后的数字分别表示功能基因数与假基因数

  Note:The number outside the parenthesis represent RNase2/3 and RNase4,whereas functional genes and pseudogenes were indicateed by the nunmber beefore and behind slashes in the parenthesis,respectively

  注:基因数栏中,括号外面的数字表示RNase2/3和RNaase4数,括号内中斜线前与斜线后的数字分别表示功能基因数与假基因数

  Note:The number outside the parenthesis represent RNase2/3 and RNase4,whereas functional genes and pseudogenes were indicateed by the nunmber beefore and behind slashes in the parenthesis,respectively

  2.2 研究工具

  本研究的工具包括:①MEGA5——“NJ系统发育树”构建软件[7],②JAVA软件,③氨基酸翻译软件,④BioEdit软件,⑤ChustalX.8.3—序列比对软件。

  3 过程与方法

  3.1 同源序列的获取

  首先,在NCBI(Nationgal Center of Biotechnology Information;国家生物技术信息中心)网站上下载外群物种和非洲兽总目各代表物种的基因组,并进行解压和重命名,以非洲象RNase2/3和RNase4的核酸序列和氨基酸序列分别作为查询序列,通过TBlastN和BlastN的方法,以E值为10-10分别搜索各代表物种基因组的同源序列,并利用Scaffold对对其进行筛选与分析。接下来,对BlastN和TBlastN搜索分析的结果分类排序,依据查询序列比对在Scaffold上的相似度及序列长度进行删减,以确定各代表物种RNase2/3和RNase4的基因序列。

  3.2 氨基酸序列的翻译与比对

  先利用MEGA5软件,完成非洲兽总目7个代表物种RNase2/3和RNase4功能基因氨基酸序列的翻译,再使用Clustal X.8.3软件进行比对和手工矫正,并在序列上标出RNase2/3和RNase4序列的典型特征和变异位点。

  3.3 功能基因等电点的预测

  通过等电点(Isoelectric Point)在线预测网站,完成洲兽总目7个代表物种RNase2/3和RNase4功能基因氨基酸等电点的预测,并分别计算出RNase2/3和RNase4的功能基因的平均等电点。

  3.4系统发育树的构建

  若RNase2/3和RNase4的开放阅读框中存在非三连体的缺失、插入或碱基突变导致终止密码子提前,则该基因为假基因,反之则为真基因。本研究,选择树懒亚目(Folivora)树懒科(Bradypodide)霍氏树懒(Choloepushoffmanni)的RNase2/3(Ch_RNase2/3)和RNase4(Ch_RNase4)作为外群,使用MEGA5软件,采用邻接法(Neighbor-Joining,NJ)分别构建非洲兽总目RNase2/3和RNase4的NJ系统发育树:使用Kimura双参数模型作为核苷酸代替模型,有缺失性状(Gap)则成对删除(Pairwise deletion),然后进行2000次自展重抽样分析。最后,结合几组试验数据进行分析和讨论,以确定非洲兽总目7个代表物种RNase2/3和RNase4各基因间的进化关系,进而揭示RNase2/3和RNase4在非洲兽总目中的进化之谜!

  4 结果与讨论

  4.1氨基酸序列分析

  通过鉴定,非洲兽总目7个代表物种获得的RNase2/3和RNase4序列情况如表1所示。从表1可以看出,获得RNase2/3序列共3条,包括1条功能基因(Ee_RNase2/3),2条假基因(La_RNase2/3ps;Tl_RNase2/3ps);共获得8条RNase4序列,全部属于功能基因,其中,在土豚中为2个拷贝,命名为Oa_RNase4A和Oa_RNase4B。对表1进行分析:RNase2/3在非洲兽总目各物种中发生了不同程度的缺失,仅在埃及象鼩中存在一个功能基因,在非洲象和佛罗里达海牛中则为假基因;RNase4表现较保守,除在土豚中检测到2个真基因外,其它物种中均只检测到1个功能基因。

  经比对翻译后,非洲兽总目7各代表物种的 RNase2/3和RNase4的氨基酸序列情况如图1所示。从图1可以看出:(1)非洲兽总目代表物种的3条RNase2/3序列长度是462bp-477bp,功能基因长度是462bp,比对后是495bp,包括完整信号肽1bp-72bp和成熟肽73bp-495bp,比对翻译后蛋白质的氨基酸个数为165个;(2)8条RNase4序列长度是429bp-444bp,比对后是489bp,包括完整信号肽1bp-105bp及成熟肽106bp-489bp,经比对翻译后,氨基酸为163个;(3)非洲兽总目的RNase2/3和RNase4序列具有RNASE A超家族成员的典型特征——①具有3个催化氨基酸残基;②具有“CKXXNTF”功能区;③8个结构半胱氨酸,并形成二硫键。但是,在埃及象鼩中RNase2/3氨基酸的丝氨酸(S)被酪氨酸(Y)替代,金毛鼹中RNase4氨基酸的丝氨酸(S)则被天冬酰胺(N)替代,而这一结果可能会对蛋白质的结构和功能产生重要的影响,故推测其可能与RNase2/3和RNase4基因的功能分化有关。

  图1 非洲兽总目RNase2/3和RNase4的氨基酸序列对比.箭头:催化活性氨基酸(K:赖氨酸;H:组氨酸);三角形:半胱氨酸;水平的长方形:功能区“CKXXNTF”;竖直的长方形:结构半胱氨酸形成的二硫键

  4.2 等电点分析

  一个基因的功能与其等电点的高低有着密切的联系。研究表明,RNASE A各成员的生物学功能在生物的生命活动中占有举足轻重的地位,等电点高的成员,其功能可能与宿主防御有关,而等电点低的成员则可能已丢失原有的生物学活性而产生了新的功能。

  经预测,非洲兽总目7个代表物种RNase2/3和RNase4功能基因氨基酸的等电点(表2)。除Oa_RNase4B氨基酸的等电点为8.76明显较低外,其它成员的氨基酸等电点均在9.20-9.90之间,通过对比Oa_RNase4A与Oa_RNase4B氨基酸的等电点,得到差为0.62,差异较大,这一结果揭示发生基因复制的2个拷贝(Oa_RNase4A和Oa_RNase4B)功能可能发生了分化,是物种进化的一种表现,这对物种更好的适应生存环境具有重要的生物学意义。通过计算非洲兽总目7个代表物种RNase2/3和RNase4功能基因氨基的平均等电点,得到以下结果:在NCBI上公布的现生7个非洲兽总目代表物种中,仅在埃及象鼩中被检测到RNase2/3的功能基因,且为单拷贝,其氨基酸等电点为9.32;RNase4功能基因氨基酸的平均等电点为9.30,除Oa_RNase4B氨基酸的等电点为8.76,Tl_RNase4氨基酸的等电点为9.84,与平均等电点相差较远外,其它物种RNase4功能基因氨基酸的等电点均在平均等电点附近。

  但从整体来看,非洲兽总目7个代表物种RNase4功能基因的等电点在8.70-9.90之间,与董哲等关于翼手目RNase4的研究发现翼手目各代表物种的氨基酸等电点在8.80-10.80之间相一致[11]。

  表2 RNase2/3与RNase4功能基因的等电点

  物种基因等电点

  Ee_RNase2/39.32Ca_RNase49.32Et_RNase49.25Ee_RNase49.41Oa_RNase4A9.41Oa_RNase4B8.76Pc_RNase49.20Tl_RNase49.84La_RNase49.26外

  群Ch_RNase2/38.57Ch_RNase49.10

  4.3 系统发育树分析

  非洲兽总目RNase2/3和RNase4的系统发育树分别如图2和图3所示。由图2可看出:拓补结构支持RNase2/3在非洲兽总目7个代表物种各科间形成独立的进化分支,象鼩科先分离,海牛科和象科聚集成姐妹群(NJ BS=100%),且进化枝相对较长,两者均属于假基因,这就揭示RNase2/3在佛罗里达海牛和非洲象中假基因化后,可能不再具有RNASE A特定的生物学活性,未受到选择压力,进化速率较快。至于在其它的物种中并没有检测到RNase2/3这一结果,推测RNase2/3在非洲兽总目其它几个代表物种中由于不具有生物学功能而发生了丢失,或该基因在其他几个代表物种中的生物学活性可能已被RNASE A超家族其它基因取代。

  由图3,我们得到以下结论:(1)马岛猬科与象鼩科(NJ BS=55%)、象科和海牛科(NJ BS=42%)分别形成姐妹群;(2)在土豚中检测到的2个拷贝以物种的形式集聚,(NJ BS=100%)支持率较高,这说明RNase4在土豚中发生了一次独立的基因复制事件,时间是在各物种形成之后才发生。

  基于非洲兽总目7个代表物种所形成的拓补结构:(1)不论是基于非洲兽总目RNase2/3构建的NJ系统发育树还是基于非洲兽总目RNase4构建的NJ系统发育树,外群物种均独立位于非洲兽总目的基部;(2)基于非洲兽总目RNase2/3构建的NJ系统发育树中,海牛科和象科聚集成姐妹群。令人惊奇地是:拓补结构除在以姐妹群形式聚集成簇的2个分支(图2中的海牛科和象科;图3中土豚的2个拷贝)中(NJ BS=100%)支持率较高外,其它进化枝支持率均较低(NJ BS≤60%),据此推测可能是因为我们研究的7个非洲兽总目代表物种中的RNase2/3和RNase4序列长度太短,碱基数不足600;同时,我们研究对象的物种数目不多,导致系统树整体的支持率较低。下一步,我们将以更多的代表物种作为研究对象,以揭示RNase2/3和RNase4在非洲兽总目中的进化之谜!

  图2 基于非洲兽总目RNase2/3构建的NJ系统发育树

  图3 基于非洲兽总目RNase4基因构建的NJ系统发育树

  Fig3 Reconstructed Neighbor Joining tree based on Afrotheria RNase4

  图3 基于非洲兽总目RNase4构建的NJ系统发育树

  5 展望

  RNASE A超家族在不同物种中遗传与进化的方式各不相同,进化模式多样。有关RNASE A超家族生物学功能的免疫学研究也表明,该基因超家族生理功能独特,在抑制病毒和肿瘤治疗方面有着令人可观的前景。截止目前,一些RNASE A成员的生物学功能机制尚不明确,有的甚至连生理功能也还不清楚。

  本文对非洲兽总目7个代表物种的RNase2/3和RNase4分别进行了氨基酸序列、等电点及NJ系统发育树分析,并初步探讨了RNase2/3和RNase4在非洲兽总目7个代表物种中的数量与遗传进化情况。但从全文来看,由于我们研究对象的物种数目不多,致使RNase2/3和RNase4的NJ系统树发育树整体的支持率较低,且并未对洲兽总目7个代表物种的RNase2/3和RNase4进行更深入的分析,即有关RNase2/3和RNase4在非洲兽总目中的一些重要问题仍未得到解决:(1)RNase2/3在非洲兽总目中发生“基因丢失”和“假基因化”事件的原因是什么?(2)非洲兽总目代表物种中,Oa_RNase4B与Tl_RNase4氨基酸的等电点为什么会明显偏离平均等电?(3)Oa_RNase4A与Oa_RNase4B之间的关系究竟是怎样的?它们是怎样产生的?因此,下一步,我们将在本次研究成果的基础上,以本文的研究方法为前提,把更多的非洲兽总目代表物种作为研究对象,采用更加完善、系统的研究方法(借助RaxML软件,通过最大似然法(Maximum Like hood,ML分别构建非洲兽总目RNase2/3和RNase4基因的ML系统发育树;采用前人常用的“选择压力分析”等手段),继续探究RNase2/3和RNase4在非洲兽总目中的进化之谜!

  总之,本研究为RNASE A超家族中RNase2/3和RNase 4在非洲兽总目中的基因序列,在鉴定RNase 4和EAR数目的基础上展开分子进化研究,旨在探讨RNase 4和EAR在非洲兽总目中的进化之谜,为进一步系统认识该基因在动物进化中适应性进化的遗传机制奠定基础。同时,也为其他学者对非洲兽总目和核糖核酸酶A超家族进行更深层次的研究提供一定的理论依据。

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