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生物科学类论文 昭通四产地天麻中天麻素的含量测定

2018-12-19 17:05:51来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要:目的 对昭通4大产地天麻中天麻素含量进行测定分析。方法 昭通不同产地天麻素采用乙醇回流提取法提取,运用高效液相色谱法测定样品溶液中天麻素的吸收峰,色谱条件为25 ℃;波长220 nm。 结果 4个样品中天麻素含量的情况为,昭通绥江县天麻素含量最高,为0.340 ﹪;其次是彝良县,为0.320 ﹪;再次是盐津县,为0.310 ﹪;含量最低的是大关县,为0.181 ﹪。结论 各产地的天麻素含量差异显著(α=0.01)。产地进行多重比较,昭通的盐津县与彝良县不具有差异显著性,与绥江县和大关县间的差异极其显著(α=0.01)。

  关键词:HPLC色谱法;天麻素;乙醇回流;标品

  1.前言:

  天麻(Gastrodia eleta BL)是一种根叶退化不进行光合作用的兰科多年生异养寄生植物,蜜环菌为其提供充足的养分,并且被称为赤箭的天麻,早在2000多年前,东汉末年的《神农本草经》就将其列为治病圣药,从古至今草本书籍对天麻的描述从未中断,描述甚多,尤其是《本草纲目》对天麻的生长、分布、形态、药效等有较完整的叙述,而且在国内天麻还是相当珍贵的药材。块茎作为天麻的主要药用部位,其性甘,有舒筋活血、止痉功效,另外还有增智、健脑、延缓衰老、安神止痛、镇静平息的作用。据有关天麻研究表明,天麻所含有的21种成分中,主要以天麻素、天麻甘元为药理成分,其中天麻素既是天麻中的主要成分又是有效成分,而且天麻药材品质的好坏也取决于天麻素的含量的高低,可见天麻素具有很高的研究价值。天麻素化学用语为对羟甲基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷,分子式为C13H18O7,分子量为295.38。特别对大脑中中枢神经的作用显著,而且催眠缓压和抗咖啡因兴奋作用也十分有效,而且镇静催眠作用也比较显著,并能够对抗咖啡因引起的中枢兴奋作用,进而可以将催眠作用的时间加以延长。天麻素的药理作用显著,它可以增强血流惯性进而扩张血管,使得血管的收缩及舒张功能得以增强,心肌循环得以改善,心肌运输血流量也随之增强,进而提高供养能力。天麻素在脑神经的研究方面也有十分重要的地位,改善大脑皮层兴奋性,抑制过程间的不平衡,具有重要意义。中枢抑制方面如镇静、安眠和镇痛等药理作用效果好,患者耐受性强,无不良反应,广泛应用于大脑神经系统性病症(如偏头痛、三叉神经痛、枕骨大神经痛等)。

  天麻种植长期以来不能得到推广,主要是对不同产地天麻的研究较少,对天麻的生长发育规律知之甚少。其实人们是可以通过对不同产地的天麻中天麻素含量和生长条件的对比分析来把控它的规律的。

  天麻的生长发育主要受气温、湿度、土壤含水量等因素的影响,而且这些因素又会随气候、海拔、光照、生物等自然环境条件的变化而变化。地球表面的温度条件在空间上,会随横向纵向的空间变化而变化,海拔升高、纬度北移温度降低,而海拔降低、纬度南移温度升高,影响天麻在空间上的水平和垂直地理分布。天麻在各个地区的分布不同,Gastrodia elata主要分布在海拔700 ~ 2800 m的中国大陆西南山区,云南北部主要分布于1800m以上的山区,云南昭通地区主要分布在海拔1200~2000 m处。不同冷热温湿的环境条件决定了天麻的适应性特征。天麻生长发育依赖于温度这一主导因素。天麻喜欢生长于夏季冷凉潮冬季不寒冷的环境中。天麻种子萌发的营养不仅来源于周围环境更多的来源于蜜环菌,因此我们要让天麻能够更好地生长就必须保证天麻和蜜环菌生长在最适条件下。据调查研究,天麻生长的最适温度为15 ℃~25 ℃,全国天麻主产区的年降水1000 ㎜~1500 ㎜左右,空气相对湿度为80 %~90 %左右,土壤含水量为40 %~60 %左右。

  天麻属兰科多年生异养寄生植物,药用干茎,其含有的天麻素具有镇静安神,镇惊止痛,平肝息风等功能,而且临床上广泛用于神经性疾病的辅助治疗。天麻中天麻素的含量主要是受生长条件的影响,这就使得不同地区的天麻中天麻素含量高低各异。昭通地区的气候与地形的独特性使得该地区的天麻品质各异,再加上昭通天麻在云南又是相当优良的品种,可见对昭通天麻主要产区大关县,绥江县,彝良县和盐津县的天麻素含量的研究具有很重要的实际意义。本实验采用乙醇回流法来提取四大产地的天麻素样液,用HPLC色谱法来处理提取样液并测定天麻素峰面积,进而对天麻中天麻素的含量进行测定分析。

  2.试验仪器及材料

  2.1实验材料

  昭通大关县,绥江县,盐津县,彝良县天麻干燥茎片(由昭通神农乌天麻有限公司提供)。

  2.2主要仪器

  (表1)

  名称型号厂家高效液相色谱仪LC600北京莱伯泰仪器有限公司分析天平CP214上海奥豪斯仪器有限公司冰箱bcd-252ksa青岛海尔股份有限公司数显恒温水浴hh-s26s金坛市晶玻实验仪器厂高速组织粉碎机DS-1无锡沃信仪器有限公司分样筛180目---浙江杜甫向阳塑料五金筛厂超声波清洗机sk3200hp山海科导超声仪器有限公司电炉101a-2e上海实验仪器有限公司

  2.3试剂

  (表2)

  名称含量批号厂家天麻对照品≥98.0%1516031阿拉丁工业公司磷酸≥85.0 %;AR---西陇化工股份有限公司乙腈≥99.9 %色谱11618001阿拉丁工业有限公司乙醇95 %;AR---天津市风船化学试剂科技有限公司

  3实验内容及条件

  3.1色谱条件

  色谱柱: Kromasil C18(200 mm×4.6 mm,5 µm,100 A);流动相:乙腈-0.05 %磷酸溶液(3∶97);检查波长:220 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:25 ℃;进样量:20 µL。

  3.2供试样品的制备

  天麻块茎片放入粉碎机中捣碎均匀,称取过180目筛的天麻粉约1 g。置于锥形瓶,加入50 %稀乙醇25 ml,并称重记录,回流加热后3 h,取出,冷去,然后称重,如果减少,加50 %乙醇至原来的体重,摇匀倒入离心管,离心。量取离心后的溶液20 mL于培养皿中,蒸发浓缩至干。用乙腈-水的混合物(3:97)溶解,洗涤,定容至50 mL容量瓶中。摇匀,0.45 µm滤膜过滤,待测。

  3.3标准曲线制作

  精密称定天麻素20 mg,加流动相20 mL,配成1 mg/mL的标准溶液,再分别制备0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL的天麻素标准溶液,采用反相高效液相色谱法在25 ℃,波长220 nm下测定其吸收峰,以天麻素浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线图(图1)。天麻素的标准曲线为y = 33315x - 1448(R2= 0.9983),表明天麻素浓度在0~120 µg/mL范围内,天麻素溶液的浓度与峰面积呈良好的线性关系。

  3.4样品含量测定

  吸取样品溶液20 µL,在220nm下,测其吸收峰,根据峰面积,计算样品天麻素含量。

  3.5精密度实验

  精密吸取浓度为40μg/ml天麻素对照品溶液20 µL,测其吸收峰,得到峰面积,重复进行6次,计算RSD,结果为0.317 %,表明仪器精密度好。

  3.6稳定性试验

  精密称取处理后的样品1.0 g,按2.3方法制备,分别于1 h、3 h、5 h、7 h、9 h、12 h测定天麻素样品吸收峰,计算RSD值为1.35 %,说明溶液在12 h内成分稳定。

  3.7重复性试验

  对同一样品中的天麻粉进行了准确筛选称取1 g分6份。根据样品制作过程,测得天麻素含量的RSD值为1.12 %,表明该方法是可行的。

  4结果

  4.1天麻素峰的判定

  将处理好的大关、盐津、绥江、彝良的天麻样液各吸取20 ul,用反相高效液相色谱仪在220 nm处,测得天麻素峰的出峰时间,得图2、图3、图4、图5。

  图2 大关天麻中天麻素的RP-HPLC色谱图 图3盐津天麻中天麻素的RP-HPLC色谱图

  图4彝良天麻中天麻素的RP-HPLC色谱图 图5绥江天麻中天麻素的RP-HPLC色谱图

  从图2~5可以看出,各样品天麻素的出峰时间都在10 min左右。

  4.2不同产地天麻素的含量

  根据峰面积与样品溶液质量浓度间的线性关系,可以得到4组样品天麻素得含量,结果见表3。

  从表3中可以得知,绥江县地区的天麻素含量最高;大关县地区的天麻素含量最低;而盐津县与彝良县天麻素含量相当。

  表3不同产地天麻素的含量

  产地大关含量(%)0.180.1810.1810.1820.1790.1850.181绥江含量(%)0.3280.350.3410.3430.3450.3350.34盐津含量(%)0.3140.3130.2990.3080.3140.3110.31彝良含量(%)0.3130.3110.330.3210.3280.3140.32

  4.3不同产地天麻素含量的分析

  为了进一步验证大关、盐津、绥江及彝良四地天麻中天麻素含量的差异,将不同产地样品的天麻素含量进行比较,经方差分析与显著性检验得F=756.33,查F临界值表[19],当α=0.01,v1=df1=3、v2=df2=20时,F0.01(3,20)=4.94,可知F>F0.01(3,20),说明四产地天麻中天麻素的含量存在差异显著性(α=0.01)。见表4:

  表4

  变异来源平方和自由度均 方F 值处理间0.555430.1851291.67处理内0.0203320.0006总变异0.575735

  对大关、盐津、绥江、彝良四产地天麻素含量进行多重比较,结果见表5,从表中可以看出,绥江县处于第一档、与其他三个地区品种差异显著(α=0.01),盐津县、彝良县处于第二档,大关县处于第三档,各档间的差异显著,说明不同产地对天麻素含量的影响显著。

  表5不同产地天麻素含量的PLSD的检查结果

  不同产地天麻素的显著性水平产地均值5%显著水平1%极显著水平绥江县0.3403aA彝良县0.3195 b B盐津县0.3098 c B大关县0.1813 d C

  5讨论

  天麻的生长离不开两种主要的真菌一种是促进萌发的小菇属,一种是为天麻生长提供营养的蜜环菌,而且这两种真菌需要适宜的自然条件才能很好地生长,这样使得天麻在生长过程中避光性、向湿性、向气性的特征比较显著。天麻在10~30 ℃下生长良好,最适温度为20~25 ℃,最佳年平均气温为12~14 ℃左右,湿度为50 %~55 %,ph值为5~6。即偏酸性的环境,而且海拔较适于400~1200 m,坡度25º以下,土质富含腐殖质、疏松、排水良好的土壤这样的条件使得天麻的种植受到了制约[16]。根据研究调查发现这四个产地的自然条件为,绥江县海拔为550 m~1100 m,平均气温16.20 ℃,土壤含水量为60 ﹪;大关县海拔为600~2560 m,平均气温18.5 ℃,降水量1250 mm;彝良县海拔为800~1100 m,平均气温18.1 ℃,降水量1220.8 mm,相对湿度80 ﹪;盐津县海拔为600~1160 m,平均气温18 ℃,降水量1226.3 mm,相对湿度72 ﹪。不难发现绥江县的自然条件与天麻生长的最适条件比较相近,这就为天麻的生长提供了良好的外部条件,由此也可以看出天麻中天麻素的含量高低与外部自然条件有着必然的联系。本实验为了研究昭通不同产地的天麻素含量,分别选取了昭通绥江县,大关县,彝良县,盐津县四个产地的天麻进行试验,这样的话就提高了天麻中天麻素测定的差异性。各地不同的环境因素造成了天麻中天麻素含量有所差异,绥江县天麻素含量最高,与它当地的环境因素有关,低纬度高海拔,昼夜温差大,使得天麻中天麻素的含量比起其他三个产地更高。

  通过这方面的研究分析,可以为未来的天麻种植提供参考,而且可以根据天麻的最适条件,模拟出一个完整的天麻种植生态系统,进而使得天麻种植技术得以优化,进而得以推广,这方面的研究,对天麻种植有着重要的实际意义。

  依据大量天麻素含量测定的实验基础,采用50 %稀乙醇为溶剂,微沸状态,加热回流3h,该提取方法简便可行,天麻素提取效率高,实验重复性好。在实验过程中,发现有水蒸气附着于冷凝管的外壁,当水蒸气冷凝后形成水,会沿着外壁流入锥形瓶,使溶液回流后重量有所增加,故回流前后均对溶液进行称量,以此增加实验的可靠性。

  在实验过程中,除了考虑天麻品种的差异性和提取方法的准确性、可靠性外,还要考虑所用测定方法-----反相高效液相色谱法的情况,在测定过程中,由于高效液相色谱仪在运行过程中会产生一定热量,这会影响色谱柱的柱温,进而影响天麻素的测定结果,因此采用间断式测定法(测定6~9组样品停用1 h)来达到准确测定天麻素含量的目的。

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