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生物科学类论文 药用野生稻和野生型水稻茎的抗坏血酸过氧化物酶活性差异分

2018-12-17 14:04:07来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘 要:茎活性,了解实验表明:本文主要研究不同的生长时期药用野生稻和野生型水稻茎的抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)差异。研究结果表明,对于白茎来说,药用10天与药用30天的抗坏血酸过氧化物酶活性分别大于WT 10天和WT30天的;而对于绿茎来说,WT 10天与药用30天的抗坏血酸过氧化物酶活性更高。通过探究不同的水稻的绿茎和白茎中抗坏血酸过氧化物酶活性的差异,从而分析植物的抗氧化能力,并能从中筛选出生长最适宜的水稻品种,加以培育,得到高品质的水稻。

  关键词:抗坏血酸过氧化物酶;药用野生稻

  1 前言

  1.1植物中的抗坏血酸过氧化物酶

  抗坏血酸过氧化物酶( APX) 是抗坏血酸代谢的关键酶。APX催化过氧化氢还原为水,不仅可以调节过氧化氢的浓度,还能调控过氧化氢,使其处于平衡的状态。酶的表达量能影响植物的耐逆能力。它和SOD、MDHAR、TaDHAR以及GR一起构成了活性氧清除系统中的酶系统,且目前被认为是叶绿体中清除的关键酶。抗坏血酸过氧化物酶能有效的消除植物中的活性氧,比如消除水稻根茎叶中的活性氧,能提高水稻抵御氧胁迫的外界环境,并提高水稻的耐氧能力,有效延缓水稻的各器官,甚至是整体植株的衰老。

  1.2植物中的抗坏血酸

  抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)是生物体重要的抗氧化剂之一,又称维生素C。抗坏血酸极度轻易被氧化,是一种多羟化合物。抗坏血酸是植物体内的重要还原物质, 对维、生物膜系统结构完整性、蛋白质结构稳定性以及防御膜脂被自由基过氧化,起着非常重要的作用。抗坏血酸除了有直接的抗氧化效果外,它也是抗坏血酸过氧化物酶的底物,这种酶对植物的抗逆性有特别重要的作用。抗坏血酸以较高的含量普遍存在于植物的各个部位中,特别是在叶绿体中的浓度可以高达20mmol/L。

  而抗坏血酸过氧化物酶是以抗坏血酸为电子供体的,APX先和H2O2结合,形成中间产物之后,有利于水稻的生长。本实验设置不同生长条件,不同的生长时期的两种水稻,分别是野生型水稻和药用野生水稻,取其茎部,测定药用10天,药用30天,野生型10天,野生型30天的绿茎和白茎的各自的 AsA 氧化速率,来计算得 APX 活性,研究环境中的氧对水稻的影响。

  2 材料与方法

  2.1 试验材料

  实验用的水稻材料:药用野生稻和野生型水稻,药用野生稻由李新昌院长提供,野生型水稻材料(中花“11”)由俞乐老师提供。

  2.2 试验试剂

  抗坏血酸过氧化物酶(APX)试剂盒

  试剂的组成和配制:

  试剂一:1 瓶液体,在冰箱4℃保存。

  试剂二:1 瓶粉剂,在冰箱4℃保存,用前加5 mL蒸馏水溶解。

  试剂三:1 瓶液体,在冰箱4℃保存。

  2.3 试验仪器

  移液枪、低温离心机、研磨仪、1mL石英比色皿、紫外光分光光度计、冰盒、钢珠和水。

  2.4 试验方法

  2.4.1 粗酶液的提取

  首先,先建议称取约0.2g的茎段组织,放入研磨管后,再加入试剂一1mL,接着放两颗钢珠之后,盖好盖子,放入研磨仪,开始研磨。研磨完成后,用移液枪吸取研磨管内的物质,13000g,4℃离心20min,取上清液,置冰上待测。

  2.4.2抗坏血酸过氧化物酶活性测定操作

  (1)分光光度计预热30 min,调节波长290nm,加蒸馏水调零。

  (2)准备3个1mL离心管,用移液枪依次在每个离心管中加入700µL已经预热好的试剂一、100µL试剂二以及100µL试剂三,做标记,写上1、2、3,避免接下来的步骤中弄混了。

  (3)用移液枪在已加入试剂1、2、3的离心管中加入上清液100µL,迅速混匀后,吸取750µL到比色皿中,在290nm测定10s和130s光吸收A1和A2,△A=A1-A2,重复3次,得到3组数据,记录。

  2.4.3 抗坏血酸过氧化物酶活性计算

  抗坏血酸过氧化物酶活性的计算,有两种方法,分别是按样本蛋白质的浓度来计算和按样本的质量来计算。

  (1)按样本蛋白质的浓度来计算的话,

  APX(µmol/min/mg prot) =△A÷(ε×d)×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T

  =1.79×△A÷Cpr

  (2)按样本的质量来计算的话,

  APX(µmol/min/g)=△A÷(ε×d)×V反总×106÷(W×V样÷V样总)÷T

  =1.79×△A÷W

  V样:反应体系中上清液的体积;

  V样总:加入提取液体积,1mL;

  ε:ASA在290nm处的摩尔吸光系数2.8×103L/mol/cm;

  106:1mol=1×106µmol;

  d:比色皿(cm),1 cm;

  V反总:反应体系总体积;

  Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL);

  W:样本质量(g);

  T:催化反应时间(min),2min。

  3 结果与分析

  测定药用野生稻和野生型水稻,两种水稻的茎的抗坏血酸过氧化物酶活性,对比它们之间的差异,并进行数据分析。先测药用10天,药用30天,野生型10天,野生型30天,即不同生长条件,不同的生长时期的水稻的绿茎和白茎的抗坏血酸氧化速率,分别比较茎段的APX 活性,如下图1。

  图1 抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性

  茎

  培养时间

  APX活性

  (µmol/min/mg)

  从图1中可以看出,两种水稻的4种不同生长条件和生长时间下的白茎的抗坏血酸过氧化物酶活性均比绿茎的活性要高,特别是药用10天,WT 30天白茎的抗坏血酸过氧化物酶活性比绿茎的酶活性分别高约56.1%、47.5%,其余的白茎比绿茎的酶活高,药用30天高约11%,WT 10天高约12.8%。而且,在WT 10天到30天,相同的时间内,绿茎的抗坏血酸过氧化物酶活性变化在0.000474-0.00094之间,白茎的抗坏血酸过氧化物酶活性变化在0.00074-0.00106之间,绿茎的变化幅度比白茎的大,也就是说在自然条件,正常情况下,野生型水稻的绿茎的抗坏血酸过氧化物酶活性下降的较快。

  图2 绿茎APX的活性对比 图3 白茎APX的活性对比

  从图2中可以看出,两种水稻的4种不同生长条件和生长时间下的绿茎,每种分别各测3组数据,都显示抗坏血酸过氧化物酶的活性大小为,WT 10天>药用30天>药用10天>WT 30天,说明野生型水稻的绿茎在野生态(WT)10天到30天里,虽然随着培育时间的加长,抗坏血酸过氧化物酶的活性总体在减弱,但药用野生稻的绿茎,在水稻生长发育初期,由于生长速率不同,抗坏血酸过氧化物酶活性并不高,而随着培育时间的增长,药用野生稻的各部分逐渐发育成熟,抗坏血酸过氧化物酶的基因表达调控增多,因此,药用野生稻的绿茎在药用30天的抗坏血酸过氧化物酶的活性反而比药用10天的酶活性要强,而且抗坏血酸过氧化物酶的活性不减弱,反而增强,此时,抗坏血酸过氧化物酶的基因表达调控达到高峰,水稻的抗性和耐受性显著提高,有利于水稻的生长发育,以及提高产量。

  从图3中可以看出,两种水稻的4种不同生长条件和生长时间下的白茎,每种分别各测3组数据,都显示抗坏血酸过氧化物酶的活性大小为,药用10天>WT 10天>药用30天>WT 30天,表明对于药用野生稻的白茎,在水稻生长发育初期,生长速率较快,抗坏血酸过氧化物酶活性较高,药用野生稻的各部分发育成熟,抗坏血酸过氧化物酶的基因表达调控良好,不过随着培育时间的加长,药用野生稻的各部分逐渐开始衰老,抗坏血酸过氧化物酶的基因表达调控减弱,导致抗坏血酸过氧化物酶的活性逐渐在减弱,因此,对于白茎,药用野生稻培育的时间不宜过长,避免药用野生稻的各部分衰老,给植物的生长产生影响。

  图4 药用水稻的绿茎APX的活性对比 图5 药用水稻的白茎APX的活性对比

  从图4中可以清晰的看出,药用水稻的绿茎抗坏血酸过氧化物酶的活性,随着培育时间的增长,抗坏血酸过氧化物酶活性增大,证明随着培育时间的增长,药用野生稻的各部分逐渐发育成熟,抗坏血酸过氧化物酶的基因表达调控增多,才能对提高抗坏血酸过氧化物酶的活性起作用,从而使药用水稻对许多常见病害以及逆境等都具有抗性和耐受性。

  从图5中可以清晰的看出,药用水稻的白茎抗坏血酸过氧化物酶的活性,随着培育时间的增长,抗坏血酸过氧化物酶的活性反而减弱,说明对于药用野生稻的白茎,在水稻生长发育初期,生长速率较快,抗坏血酸过氧化物酶活性较高,药用野生稻的各部分发育成熟,抗坏血酸过氧化物酶的基因表达调控良好,不过随着培育时间的加长,药用野生稻的各部分逐渐开始衰老,抗坏血酸过氧化物酶的基因表达调控减弱,导致抗坏血酸过氧化物酶的活性逐渐在减弱,对提高抗坏血酸过氧化物酶的活性所起到的作用也越来越弱。

  图6 野生水稻的绿茎APX的活性对比 图7 野生水稻的白茎APX的活性对比

  从图6,图7可以看出,野生态的白茎和绿茎中抗坏血酸过氧化物酶的活性,随着培养时间的增加,都呈现不断下降的趋势。绿茎中抗坏血酸过氧化物酶的活性下降的较快,而白茎的则下降的较慢。说明野生态的白茎和绿茎中,白茎的抗坏血酸过氧化物酶的抗氧化能力较好,而且衰老的速率较绿茎的慢。而绿茎的抗坏血酸过氧化物酶的抗氧化能力较弱,酶活性不高。

  4 结论

  由图1可以看出,无论是水稻的绿茎还是白茎,在其整个生长过程中,白茎的抗坏血酸过氧化物酶活力都远高于绿茎的抗坏血酸过氧化物酶活力。因此,这两种水稻,药用野生稻与野生型水稻中,白茎的抗坏血酸过氧化物酶的活性都很占优势,并且随着培育时间的增长,酶活性下降的速率较慢,有效的抵御的不良环境,有利于水稻的生长发育,以及能提高水稻的品质。

  由图2,图3可以看出,水稻的绿茎在野生态(WT)10天到30天里,虽然随着培育时间的加长,抗坏血酸过氧化物酶的活性总体的趋势趋向于减弱,但药用野生稻的绿茎,在水稻生长发育初期,抗坏血酸过氧化物酶活性并不高,而随着培育时间的增长,药用野生稻的各部分逐渐发育成熟,抗坏血酸过氧化物酶的基因表达调控增多,对外界不良环境与病害都具有抗性和耐受性。因此,药用野生稻的绿茎在药用30天的抗坏血酸过氧化物酶的活性反而比药用10天的酶活性要强,而且抗坏血酸过氧化物酶的活性不减弱,反而增强,此时,抗坏血酸过氧化物酶的基因表达调控达到高峰,植物的抗氧化能力显著提高,有利于水稻的生长发育,以及提高产量。

  对于水稻的白茎,在野生态(WT)10天到30天里,同样是随着培育时间的加长,抗坏血酸过氧化物酶的活性总体的趋势趋向于减弱。但对于药用野生稻的白茎,在水稻生长发育初期,生长速率较快,抗坏血酸过氧化物酶活性较高,药用野生稻的各部分发育成熟,抗坏血酸过氧化物酶的基因表达调控良好,不过随着培育时间的加长,药用野生稻的各部分逐渐开始衰老,抗坏血酸过氧化物酶的基因表达调控减弱,导致抗坏血酸过氧化物酶的活性逐渐在减弱。因此,对于白茎,药用野生稻培育的时间不宜过长,避免药用野生稻的各部分衰老,给植物的生长产生影响。

  与白茎恰恰相反,对于药用水稻的绿茎,应延长培育的时间,这样抗氧化的效果也会更明显,抗坏血酸过氧化物酶的活性下降的速率能明显减慢,当培育的时间延长到一定程度,水稻各部分生长逐渐成熟,基因表达水平提高,抗坏血酸过氧化物酶的活性就会逐渐增强,甚至比刚开始培育时的水稻的抗坏血酸过氧化物酶活性还要高,此时,抗坏血酸过氧化物酶的基因表达调控达到高峰,植物的抗性和耐受性显著提高,有利于水稻的生长发育,以及提高产量。

  对于这个实验,通过分析数据,可以得出,药用野生稻和野生型水稻的白茎都是随着培育的时间的延长,而抗坏血酸过氧化物酶的活性不断减弱,只是下降的速率不同,药用野生稻的酶活下降的明显比野生型水稻的酶活下降的慢。说明在培育初期,药用野生稻就能顺利的适应不良环境,具有较高的抗氧化能力和耐受性,在生存上占优势。

  而药用野生稻和野生型水稻的绿茎有明显的不同,野生型水稻的绿茎的抗坏血酸过氧化物酶的活性,还是随着培育的时间的延长,而不断减弱,但药用野生稻的绿茎的抗坏血酸过氧化物酶的活性,在培育初期,酶活性较低,药用10天的绿茎的酶活甚至比WT 10 天的还要低,而当培育的时间延长到一定程度,这时药用野生稻的绿茎的抗坏血酸过氧化物酶的活性甚至会增强得比在前期培育时的水稻的酶活性还要高。说明在培育后期,药用野生稻的绿茎,具有较强的适应环境的能力,并且生长状况会越来越好,具有发展的潜力,但在培育初期,就需要小心的照料,避免酶的活性下降的速率过快。

  综上,如果使APX的活性明显的提高,就可以让超氧阴离子自由基(O2-)产生的速率明显的下降,从而降低对水稻生长的消极影响。因此,植物体内的抗坏血酸过氧化物酶活性很重要,甚至决定了植物是否能茁壮地成长,水稻也是如此,抗坏血酸过氧化物酶活性高,体内产生的超氧阴离子自由基的量明显减少,不仅仅是延缓茎部的衰老,对水稻整体植株的抗氧化和耐受性都能起到明显的作用,使水稻更能适应环境。由此看出,大力开发提高抗坏血酸过氧化物酶活性的探索与研究都非常有必要,这也是本次实验的宗旨——希望能重视抗坏血酸过氧化物酶的抗氧化作用,并能用于水稻的生产实践中,有效保证水稻健康的生长,提高水稻的产量。

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