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最新生物科学论文 液体培养褐藻酸钠降解菌的初步研究

2018-12-13 16:50:19来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要:本论文主要采集了小市场和海边的腐烂海带, 从其中用液体摇瓶培养的方法,筛选分离得到了一株褐藻酸钠降解菌。为鉴定细菌种属进行了16s rDNA的序列分析,同时构建了系统发育树。根据已知物种的培养基来推断其相似性高的近缘物种的培养基,从而获得了一定的优化方向。实验得知这株褐藻酸钠降解菌的最适培养条件为:FeSO4·7H2O 0.01g;(NH4)2SO4 5g;K2HPO4 0.2g;NaCl 25g;褐藻酸钠5g ;H2O 1000mL;25℃。通过本次的实验希望对日后高效降解率的褐藻酸钠降解菌的发现,及建立褐藻酸钠工程菌株提供一定的参考资料。

  关键词:褐藻酸降解菌;分离纯化;序列分析;系统发育树;最佳条件

  前言

  褐藻酸钠的来源

  褐藻酸钠主要来源于藻类,而对于藻类来说在自然界中无处不在,分布十分广泛。可能在你不经意之间就有藻类在你身边,他们有着超强的适应能力,有的生活在水中,有的生活在土壤中,还有的生活在雪地里,甚至你很难想象的干旱地段都有他们的身影。人们首次发现褐藻酸钠便是从褐藻中提取出来的。我们通常所说的褐藻胶便是褐藻酸钠。随着时间的推移科学家发现不只褐藻中含着丰富的褐藻酸钠资源,裙带菜和海带等藻类植物都含有相当比例的褐藻酸钠。目前来说,褐藻酸钠提取主要是用人工养殖的海带。

  褐藻酸钠的化学结构

  褐藻酸钠含有的主要成分是古罗糖醛酸和甘露糖醛酸。不管是古罗糖醛酸还是甘露糖醛酸都是一种非均一性的线性长链聚合物是由C、H、O等元素组成的多糖碳水化合物。褐藻酸钠在酸性条件下可以被水解为小分子聚糖。古罗糖醛酸和甘露糖醛酸的单糖结构如图1所示:

  图1单糖结构

  Figure 1 monosaccharide structure

  褐藻酸钠的理化性质

  褐藻酸钠的理化性质主要有三个。对于它的黏度来说,受着很多外界因素的影响,温度的高低会影响褐藻酸钠的黏度,一般情况下随着温度的逐渐升高,其黏度是不断升高的,但这也有一个限度,如果温度过高则会破坏其本身结构。其它的影响因素像水分,酸碱性,都对其有一定的影响。而对于他的另外一个特性就是凝胶性,当褐藻酸钠形成凝胶后会变得很柔软,其中含有很多的水分。它的这一特性有很多的用处,做胶囊的原料便是其一个重要用途。最后一个特性就是褐藻酸钠的溶解性,褐藻酸钠是不溶于水的但它却可以吸收大量的水,体积会膨胀为原体积的好几十倍。含有游离的梭基,它能和多种阳离子发生作用生成褐藻酸盐所以不同的褐藻酸盐在水中有不同的溶解性。

  1.4 褐钠所具备的生藻酸物活性

  褐藻酸钠的生物活性可分为四大作用:降血糖、降血脂、整肠解毒、抗氧化。对于褐藻酸钠的降血糖作用,主要是因为褐藻酸钠中的多糖可以提高有关糖代谢酶的活性,酶的活性一旦提高了糖的代谢也会加速,从而也降低了血糖的水平。据报道也可能是多糖促进了胰岛素的分泌,从而使血糖的含量降低。而对于褐藻酸钠的降血脂作用,主要体现在褐藻酸钠可以使肠道减少对固醇与甘油三脂的吸收,从而使血液中脂质含量降低,达到一定的降血脂的作用。我们所提及的整肠解毒主要是说褐藻酸钠可以在肠胃表层形成一道保护黏膜,一方面保护了肠胃蠕动时的损伤,一方面对于本就有炎症的肠胃多了一层保护。它的解毒功能主要是说,褐藻酸钠可以抑止一些重金属的积累,从而避免了由于重金属积累而带来的病痛。海藻酸钠还有一定的抗氧化作用,减少了自由基对细胞的伤害,从而对抗衰老也有一定的作用。

  1.5 褐藻酸钠降解菌

  为何称一株菌为褐藻酸钠降解菌,关键在于它对褐藻酸钠的降解能力。作为一株高效的的褐藻酸钠降解菌,首先它可以产生降解褐藻酸钠的酶。而对于褐藻酸钠降解菌所产生的裂合酶目前可分为三类:一类是专门作用于多聚古罗糖醛酸的裂合酶。一类是专门作用于多聚甘露糖醛酸的裂合酶。一类是可以同时作用于这两个多聚糖醛酸的裂合酶。褐藻酸钠降解菌所产生的酶作用于藻类中的褐藻酸钠便产生了,藻类的腐烂现象。当前我们国家的人工养殖海带的规模越来越大,人们越来越重视海带病烂问题,同时也越来越关注褐藻酸钠降解菌。当藻类受到损坏,褐藻酸钠降解菌很轻易便能侵入其中,并以其中的褐藻酸钠作为营养物质进行大规模的生长繁殖,要想彻底解决海带病烂问题就必须控制褐藻酸钠降解菌生长。

  1.6 降解褐藻酸钠的方法

  常知的降解褐藻酸钠的方法主要有三种:褐藻酸钠的物理降解法、褐藻酸钠的化学降解法、褐藻酸钠的生物降解法。关于褐藻酸钠的物理降解法主要有辐射发,利用钴60产生的不同强度的伽马射线将固态或者液态的褐藻酸钠降解成分子量为小分子量的的寡聚褐藻酸寡糖。这种方法比较繁琐,一般情况下不怎么使用。再一个就是褐藻酸钠的化学降解法,这个方法的原理很简单就是用一定的化学药品作用于褐藻多糖的糖苷键,使其糖苷键发生断裂从而把褐藻多糖降解成小分子量的寡糖。如果再将褐藻酸钠化学降解法进行细分的话,它还可以分为酸水解法和氧化降解法。对于酸水解来说较早用来进行酸水解的是盐酸,稀酸在常压条件下便能将褐藻酸钠初步降解。而对于氧化降解法,主要是运用次氯酸钠和过氧化氢等氧化剂在一定离子催化剂的催化条件下将褐藻酸钠降解成小分子量寡糖。化学方法在过去作为主要的降解褐藻酸钠的方法,但它本身有着一定的缺点,它无法进行特异性的降解无法达到理想的褐藻酸钠降解。而且化学试剂的存在会对产物产生二次的污染,不利于产物的分离。优点是简单易行利于工厂的大规模生产。而目前倍受人们关注的是褐藻酸钠的生物降解法。生物降解法主要是运用酶来进行精准的降解褐藻酸钠来得到相应的寡糖。目前已广泛的应用于食品、医学、纺织等领域。酶我们都知道它有非常高效催化能力,化学催化效率很难和酶媲美,他可以催化一些化学催化剂无法催化的特殊物质。酶作用于褐藻酸钠的降解已经越来越得到人们的关注。而高效的产酶菌株的筛选,更是深入研究所必须的材料。

  2 材料与方法

  2.1 实验材料及主要器材

  表1 主要实验材料及仪器

  Table 1 Main experimental materials and equipment

  材料名称仪器工具名称(NH4)2SO4双人单面洁净工作台K2HPO4电子分析天平FeSO4·7H2O移液枪NaCl恒温培养箱褐藻酸钠可调温摇床琼脂粉电子显微镜自来水高压灭菌锅腐烂海带1电热锅腐烂海带2试管,锥形瓶,平板等2.1.1 固体分离平板制备

  固体分离平板培养基的组成为:FeSO4·7H2O 0.01g;(NH4)2SO4 5g; K2HPO4 0.2g ; NaCl 25g; 褐藻酸钠5g ; 琼脂粉15g; H2O 1000mL调pH7.0于1000ml三角瓶中。经高压蒸汽灭菌后倒入平板中,然后用于菌种分离。

  2.1.2 液体发酵培养基制备

  FeSO4·7H2O 0.01g;(NH4)2SO4 5g; K2HPO4 0.2g ; NaCl 25g; 褐藻酸钠5g ; H2O 1000mL用自来水水将该组分完全溶解,调节pH7.0。

  2.1.3 斜面培养基制备

  FeSO4·7H2O 0.01g;(NH4)2SO4 5g; K2HPO4 0.2g ; NaCl 25g; 褐藻酸钠5g ; 琼脂粉15g; H2O 1000mL用自来水水将该组分完全溶解,调节pH7.0。

  2.2 菌种的筛选

  2.2.1 样品的处理

  海带样品共用了两种,一种是来自小市场的海带堆,一种是来自海边的腐烂海带。将采集的样品用去离子水轻轻漂洗,去除表面泥沙。保藏于三角瓶中,至于4℃冰箱中存放。

  2.2.2样品初筛

  在无菌条件下,用剪刀把病海带组织剪成小块,将剪下的小块海带放入装有无菌海水的三角瓶中,反复洗涤3次,用镊子取出,然后置于200mL灭菌海水(500mL 规格三角瓶)中,25℃,150r·min-1摇瓶发酵培养。培养一天后,将富集了菌株的海水用灭菌海水按照10-1到10-6不等梯度进行稀释,取各稀释液0.1mL涂布到初筛分离平板上,每个梯度六个平板。分不同的温度梯度培养20℃,25℃,30℃恒温培养72h,选取在海带分离培养平板内长势较好且有透明圈的菌株进行划线法分离纯化,移入斜面保存、备用。

  2.2.3 样品复筛

  将初筛的菌株接入装有30ml液体种子培养基的100ml锥形瓶中,在20℃,25℃,30℃、150r.min-1摇床中培养24h,再接入30ml/100ml摇瓶复筛液体培养基中,在25℃、150r.min-1摇床中培养2~3天。进行简单染色和革兰氏染色。

  2.3 褐藻酸降解菌的菌株鉴定

  2.3.1 试验材料

  从病烂的海带中筛出的褐藻酸钠降解菌一株。

  2.3.2 菌种DNA提取

  一.细菌的菌液,酵母DNA提取。

  1:取约适量样品置于2 mL无菌离心管中,然后加入0.8 mL 细菌抽提缓冲液和20μL蛋白酶K,充分颠倒混匀。

  2:放在37摄氏度摇床,静置40min,每隔10-15min颠倒混匀一次;

  3:加入160μL 10% SDS,混匀。65℃水浴1 h,每隔10-15 min颠倒混匀一次;

  4:在上述溶液中加入氯仿400μL,颠倒混匀,10000r离心10min,把上清吸到另一个管内;

  5:往上清溶液中再次加入400μL氯仿,颠倒混匀,10000r离心10min;取上清,往上清溶液中加入0.6倍体积的异丙醇,颠倒混匀,静置30min,每个10min颠倒混匀一次;

  6:将上述加有异丙醇的上清溶液10000r离心10min,倒掉液体保留沉淀;

  7:往沉淀中加入75%的酒精 700μL,将溶液再次10000r离心10min,倒掉液体,重复一次;

  8:将沉淀10000r离心30s,弃液体保留沉淀,风干沉淀中残留的水分;

  9:沉淀中加入30μL 1xTE溶液(已灭菌的),先混匀,再静置30min,中间颠倒混匀1-2次,备用;

  二.PCR扩增

  细菌引物组合,引物序列见表2。

  表2使用的引物组合

  Table 2 using primer combinations

  引物名称引物序列扩增程序27F/1492R27F:AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG

  1492R:TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T94℃预变性3 min;94℃变性1min, 55℃退火1 min, 72℃延伸3 min, 30个循环;72℃延伸5 min。Ex Taq DNA Polymerase等扩增所用试剂均购自TaKaRa公司, PCR Purification Kit 购自Promega, 引物由上海生工合成。PCR仪使用Biometra公司生产的Tgradient, 凝胶成像分析仪为Bio-Rad 公司的Gel-Doc2000。

  2.3.3 褐藻酸降解菌16srDNA的序列分析及系统发育树构建

  将我们所得序列与NCBI数据库中的数据进行比对,然后采用Mega5软件的邻接法构建褐藻酸降解菌的系统发育树。由于16s rDNA序列同源性大于99%,可被认为属于同一种[25]。准备好fasta格式序列文件并保存在文件夹里,然后打开MEGA 5选择序列类型核酸(DNA)。选择之后在弹出的窗口中直接粘贴序列(如果所有序列在同一个文件中,即可全选序列,复制)。序列文件添加之后,呈蓝色背景。然后点击按钮选择Align DNA,点击OK开始多序列比对。比对完成后,截齐两端的序列最好中间没有大距离空白基因,然后保存文件建立系统树。

  2.4降解菌最佳培养基预测

  KOMODO可以很好的进行相似度高的近缘物种的最佳培养基预测,方法是先进入KOMODO在16S data右边的框里输入FASTA格式的序列当你填写完整之后,点击左下角的提交按钮后耐心的等几分钟就可得预测结果了。网站会根据你填写的信息给出推荐的不同培养基,这样就可以直接下载PDF版的培养基配方了。里面有详细的培养基成分及其所用比例。

  3 结果与分析

  3.1 细菌的筛选结果

  同一时间段相同培养基相同温度下不同海带腐烂菌的培养结果如图所示:

  图2 褐藻酸降解菌的筛选结果

  Figure 2 Screening results of alginic acid decomposing bacteria

  把各种腐烂的海带碾碎后放液体培养基里在20℃,25℃,30℃恒温摇床培养,发现了只有一株菌在25℃产生了很明显的浑浊,其他锥形瓶中的菌在20℃,30℃下没有产生明显的浑浊,图中是同一时间段相同培养基相同温度25℃下不同海带腐烂菌的培养结果,很明显右侧锥形瓶中很是浑浊,由于我们的培养基只有褐藻酸钠这一种碳源可以降解,所以锥形瓶中产生明显浑浊的这株菌,是可以降解褐藻酸钠的菌,而这株菌也正是我们所需要的那株菌。

  3.2 细菌细胞的形态特征观察

  3.2.1 简单染色

  简单染色结果如下图所示:

  图3.细菌简单染色结果

  Figure 3 Simple staining bacteria

  通过染色、水洗、干燥、镜检,观察到视野中我们筛选出的菌分布很均匀没有杂菌的存在,右图是在40倍物镜下的观察结果,左图是在油镜下的观察结果,从左图可以观察到这株菌的的形态特征为杆状,所以筛选出的细菌是一株杆菌。

  3.2.2 革兰氏染色

  对这株褐藻酸钠降解菌的革兰氏染色结果:

  图4革兰氏染色结果

  Figure 4 Gram staining results

  简单染色结果为杆菌,为鉴定它是革兰氏阳性杆菌还是革兰氏阴性杆菌,进行了革兰氏染色,图为染色结果,这株褐藻酸钠降解菌被染成了红色,得出这株褐藻酸钠降解菌是一株革兰氏阴性杆菌。

  3.3 褐藻酸钠降解菌的鉴定

  3.3.1 褐藻酸钠降解菌1的16s rDNA序列扩增结果

  褐藻酸钠降解菌的DNA提取结果及PCR扩增结果如图5及图六所示:

  图5 DNA提取结果 图6 PCR 扩增电泳结果

  Figure 5 DNA extraction result Figure 6 PCR amplification electrophoresis

  图5为褐藻酸钠降解菌的DNA提取结果,从图中可以看出提取的降解菌的DNA亮带位于大于2000bp的位置。图6为PCR扩增结果,以27F/1492R为引物进行16SrDNA序列扩增后的电泳结果,亮带位于250bp到500bp之间。纯化扩增的DNA后便可以进行DNA的测序。

  3.3.2 褐藻酸降解菌的系统发育树构建

  表3 NCBI比对结果

  Table 3 NCBI alignment results

  编号最相似菌株登录号相似度细菌-1 Cobetia pacificaNR_113402 99%细菌-2 HalomonasNZ_AXCA01000085.198%细菌-3 Halomonas elongataNC_014532.198%细菌-4 Halomonas xinjiangensisNZ_JPZL01000008.197%细菌-5 Halomonas anticariensisNZ_KE332381.197%细菌-6 Halomonas spNZ_JXYB01000060.196%细菌-7 Halomonas salinaNZ_CDGR01000013.196%细菌-8 Halomonas boliviensis LC1NZ_JH393258.195%细菌-9 GammaproteobacteriaNZ_JNVT01000096.194% 通过用已筛选出的褐藻酸钠降解菌的16SrDNA序列与NCBI数据库中的已知菌属的序列做比较,得出与我们实验筛出的最相似的菌株是Cobetia pacifica相似度高达99%,与之相比其次的是Halomonas和Halomonas elongata相似度为98%。

  系统发育树的构建结果如图7所示:

  图7系统发育树构建结果

  Figure 7 phylogenetic tree construction results

  在系统发育树中筛选出的褐藻酸钠降解菌简称HD,从发育树中可以很清楚的看出,主干分为两支干,一支干的第一个分支是我们筛出的这株褐藻酸钠降解菌,另一支干的第一个分支是为100%的Cobetia pacifica ,它们的相似度是最大的对于Cobetia pacifica,它是盐单胞菌是一种非模式菌株,下面是对它的介绍:

  表4Cobetia pacifica菌的介绍

  Introduction Table 4 Cobetia pacifica bacteria

  主要用途研究特征特性革兰氏阴性、无芽孢的杆状。菌落为黄色,隆起,边缘完整,表面光滑,菌落不透明,好氧,化能异养。最适生长温度为28℃。具体用途在含12%NaCl的LB固体培养基上可以生长,在含12%NaCl的LB液体培养基中可以生长。

  经过比较可以看出预测菌和我筛选出的细菌都是革兰氏阴性菌,好氧菌,最适温度在25℃左右,在NaCl的LB固体培养基上可以生长,在含NaCl的LB液体培养基中可以生长,是一株盐单胞菌。与我筛选出的褐藻酸钠降解菌不同在温度,Cobetia pacifica菌的最适温度是28℃,而我筛出的是在25℃下筛选出来的,在28℃能否更好的生长还需要进一步的实验探究。

  3.3.3 序列分析

  PCR扩增产物经Promega PCR Purification Kit纯化后,测序。序列结果如下:

  >HD褐细菌

  3.4 最佳培养基预测结果

  3.4.1 条件及序列输入结果:

  3.4.2 培养基预测结果:

  4 总结与讨论:

  本实验通过对来自烟台小市场的腐烂海带上的褐藻酸降解菌进行了分离,纯化。从中分离出一株具有较强酶活的菌株。并对其进行了形态学和16s rDNA序列同源性比对,系统发育树的构建和最优培养基的预测。纵览全文,本实验研究主要得到以下结论:

  本株褐藻酸钠降解菌是,通过通过在20℃、25℃、30℃的摇瓶培养,在培养条件为FeSO4·7H2O 0.01g;(NH4)2SO4 5g; K2HPO4 0.2g ; NaCl 25g; 褐藻酸钠5g ; H2O 1000mL;25℃,的摇瓶中获得了一株褐藻酸钠降解菌。通过简单的染色油镜观察其为杆菌。通过革兰氏染色结果为红色得知其为革兰氏阴性杆菌。

  通过对褐藻酸降解菌的16s rDNA的序列分析,以及系统发育树的构建。将所得序列与NCBI数据库中的序列进行Blast(Basic Local Alignment Search Tool)对比,结果发现褐藻酸降解菌1的16s rDNA部分序列与Cobetia pacifica 菌99%相似我们得出了它是盐单胞菌是一种非模式菌株。

  通过KOMODO处理结果,实验使用的培养基和根据已知培养基的物种来推断其相似性高的近缘物种的培养基结果,还是有一定出路的,它所用的很多元素没有用上,像SrCl2和KBr,H3BO3,NaF等。而且不同的近缘物种最适的NaCl含量不同。再者他们的主要碳源是蛋白胨和酵母膏,本实验用的唯一碳源就是褐藻酸钠,根据其近缘物种所用的最适培养基,改变现有培养基后其活性是否会有大幅度提高,还需要进一步实验探究。

  褐藻酸酶它作为一种海藻工具酶越来越受到重视。近年来的研究发现,褐藻胶裂合酶用于降解褐藻胶产生寡聚糖醛酸,应用于制备海洋药物、保健食品、植物生长促进剂、化工原料和食品添加剂。而本实验对建立褐藻多糖解菌菌种库,不同地域来源的海藻多糖进行高效降解起了一定积极作用。同时便于应用生物化学及酶工程等有关实验技术手段,建立工程菌株,利于对菌株产酶过程进行逐步探究提高产酶效率。

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