周一至周五 | 9:00—22:00

期刊论文网 > 生物与环境论文 > 动物学论文 > 水产动物类论文 水产动物口服疫苗的研究进展

水产动物类论文 水产动物口服疫苗的研究进展

2018-12-19 17:11:09来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘 要 :疫苗的使用不仅能够增强水产动物的免疫水平,有效地提高水产动物对水产常见疾病的抵抗力,减少疾病的发生与传染,还能够减少化学类药物的使用,降低了对环境的污染程度,减少了治理环境的经济损失。其中注射疫苗费时费力,易损伤鱼体;浸泡疫苗需要量大,易产生强应激反应;而口服疫苗能够适用于各种体型的鱼类,避免了注射和浸泡两种接种方式存在的问题,是较为理想的免疫方式。本文综述了水产口服疫苗的现状、关键技术和发展趋势。

  关键字 :水产动物;免疫;口服;疫苗;形式

  随着社会生活水平的提高,人们对于水产品的质量安全问题和环境污染等问题也越来越重视,各种使用化学药物来预防及治疗水产动物疾病的方式也广受质疑。疫苗的使用能够有效增强水产动物对特定疾病的免疫能力,降低了死亡率;同时还能减少各种化学药物的使用,降低了环境的受污染程度以及减少了水产动物药物残留的情况,有效的减少了经济损失。因此,水产疫苗的使用也受到越来越多的关注。

  1 水产疫苗的概况

  1942年,加拿大学者Duff首次用灭活的鲑鱼产气单胞菌口服免疫虹鳟鱼并成功地使其获得相应地免疫保护力,自此,人类开始走上研究水产疫苗的道路。20世纪70年代,荷兰英特威公司使用福尔马林来灭活细菌,制造出细菌性灭活疫苗,通过注射和浸泡的方式,来防治鲑鱼弧菌病和肠红嘴病,实验结果表明,这种疫苗能够有效抑制弧菌病的发生和传播,给北美的鲑鱼养殖业带来了巨大的成功。1988年挪威法玛克公司在欧洲成功研制出一种细菌灭活疫苗用于防治冷水鱼弧菌病,此举为挪威的三文鱼养殖业挽回了巨大的经济损失;1991年该公司又开发出世界上第一例防治疥疮病的细菌灭活鱼疫苗并推向市场,这一疫苗因其良好的疾病防治效果,最后成功获得了欧洲的商业许可。据不完全统计,到2012年年底,全球商业化生产的水产疫苗数量已经有140多种。

  我国的水产疫苗研究工作开展得比较晚,始于上世纪50年代草鱼出血病土法疫苗研究 ,但是进步缓慢。据不完全统计,目前我国研究的水产疫苗种类达50余种,涉及病原近30种,但获得国家新兽药证书的水产疫苗只有5种,获得生产批文的水产疫苗仅有草鱼出血病活疫苗与嗜水气单胞菌灭活疫苗2种,与欧美发达国家还存在较大差距。

  2 水产疫苗的接种方式

  水产疫苗的常用接种方式主要有浸泡、注射和口服。水产疫苗的注射接种主要分为肌肉注射和腹腔注射两种方式。肌肉注射主要用于DNA疫苗和核酸疫苗等两种疫苗的接种,而腹腔注射主要用于传统灭活疫苗和减毒疫苗的接种。

  当前,国内主要有两类疫苗获得批准,一类是减毒疫苗,其典型代表是草鱼出血病弱毒疫苗,另一类是传统灭活疫苗,其代表主要有鱼嗜水气单胞菌灭活疫苗等;这些疫苗主要通过对鱼体进行腹腔注射从而使鱼体产生免疫能力。注射免疫可保证免疫个体数量和疫苗剂量的准确性,并能同时免疫多种抗原,减少注射的次数。但是采用注射这种疫苗接种方式在实际生产和临床试验上也存在一定的缺陷:首先,这种免疫方式对体型小的鱼并不适用;其次,这种疫苗接种方式费时费力,对于大规模的养殖场来说,工作量巨大;同时,由于操作人员的水平差异也会对鱼体造成不同程度的伤害;此外,有时伴随疫苗注射使用的麻醉剂也会影响鱼群的生命活动。

  浸泡免疫又分为四种方式,包括直接浸泡、高渗浸泡、喷雾、浸浴。浸泡免疫这一方式适用于体型较小的鱼类,省时省力,但是这种疫苗接种方式的缺点是抗原的需要量大,并且容易使鱼群产生强烈的应激反应。近年来,有研究者将超声波和浸泡免疫结合起来,可通过增强细胞渗透性来加强免疫的效果。

  口服疫苗被认为是水产疫苗最具可操作性的免疫方式,主要考虑到水生动物生活环境离不开水体,并且养殖数量较大。这种疫苗接种方式几乎适用于所有规格的鱼类,采取拌入饲料口服的方式,省时省力,但口服疫苗因为免疫鱼体数量和疫苗剂量不能得到有效保证,抗原易受消化道的影响,从而使其提供的免疫保护力在目前低于注射免疫。

  3 口服疫苗的作用机制

  鱼类的肠道黏膜分为两个部分:上皮层和固有层。在所有生物体内,黏膜表面是病原体进入的主要部位,而黏膜表面覆盖有免疫增强粘液的保护层,此保护层作为防御病原体的第一道防线,鱼的粘液中含有多种与免疫相关的因素如凝集素、粘蛋白、抗菌肽、毒素、免疫球蛋白等。通常认为鱼类口服疫苗免疫主要以粘膜免疫为主,它在鱼类疾病的防御过程中起着主导作用,但是目前对于粘液免疫作用机制的研究并不是特别清晰。

  鱼类没有器官化的淋巴结或者淋巴集结,而只有弥散性的肠道淋巴组织,这是一种在功能上与哺乳类不同的组织,但是鱼类却有大量的淋巴细胞,由淋巴产生的免疫球蛋白能够抵御病原体和防止共生细菌进入上皮细胞。

  在单克隆抗体技术的支持下,Abelli等在舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)的肠道内发现了淋巴组织,并且还发现舌齿鲈的淋巴细胞的数量从消化道到肛门呈现明显的数量梯度,并且数量梯度呈上升趋势。这种现象表明,后肠比其他任何肠道部位能产生更强的免疫应答反应,推测口服疫苗主要在后肠发挥作用。由于抗原呈递效率的不稳定性以及疫苗容易受到鱼类胃肠黏膜系统中的各种消化酶的影响,口服疫苗的发挥的免疫效果并不如理想条件下的好。一般认为,口服疫苗的效果不如肛门灌注,这是由于口服疫苗在消化道中受到消化酶的降解或破坏,使到达后肠的抗原达不到发挥预期免疫效果的数量要求。

  为了避免这种现象,研究者们运用各种手段和技术使口服疫苗免受胃酸和肠道中各类消化酶的影响,从而保障其免疫效果,同时减缓疫苗中抗原物质的释放,使之持续释放抗原物质,以产生更大程度的免疫应答反应。

  口服疫苗的种类

  由于口服疫苗需要激发局部或者全身的免疫应答,这些疫苗在到达发生免疫反应的组织之前,抗原需要被保护,以防受到破坏,影响免疫效果。实验表明,高浓度的胃酸可能在口服疫苗到达肠道淋巴组织之前就使之变性或失去活性,肠道内的蛋白酶的存在,一部分抗原会受到蛋白酶的降解。由于口服疫苗可能会在鱼类消化系统内被降解,或者当拌入饲料中时,也可能与饲料中的成分互相作用,影响饲料的适口性甚至于影响疫苗本身的应有的免疫效果,因此,口服疫苗需要得到妥善的保护,尽量避免疫苗的裸露,使之能更好地发挥免疫效果。

  4.1微囊或包裹疫苗

  现在使用的包裹材料主要有海藻酸盐、壳聚糖还有脂质体,但在一些文献中也将这些材料定义为疫苗的佐剂,在本文中将此类疫苗划分为微囊疫苗的原因在于此类疫苗主要是单独以微囊的形式发挥作用的。

  Romalde等用福尔马林灭活格氏乳球菌(Lactococcus garvieae),由海藻酸钠丙酮微粒包裹疫苗用以口服免疫虹鳟鱼。通过观察发现,在口服疫苗1~24h后,在胃和小肠中检测到该种藻酸盐微球完好无损,而位于后肠的微球直径逐渐减小。同时,在用肛门插管法接种该种疫苗16~24h后,也能在后肠检测到海藻酸盐微粒。这一结果表明海藻酸钠丙酮微粒能够有效抵抗消化道中的低PH环境和各种蛋白酶的降解。将腹腔注射相应疫苗设立为阳性对照,实验组分别投喂海藻酸钠丙酮微粒疫苗和无包裹的的疫苗,攻毒结果显示,三者的相对存活率分别为83.3%、50%、7%,这些数据说明虽然口服疫苗的免疫效果不如注射疫苗,但实验中海藻酸盐可有效保护疫苗,有效提高免疫效果。

  余俊红等分别将全细胞浓缩疫苗和微胶囊疫苗拌料投喂鲈鱼鱼苗,免疫一周后,进行注射攻毒,结果表明两组的免疫保护力分别为51%和56.2%,而对照组的死亡率高达95%,这表明微胶囊疫苗可以提高抗原的保护性。

  孙翰昌等用生物可降解材料聚丙烯酸树脂来制备肠型点状产气单胞菌(Aeromonas punctata f.intestinalis)的微粒疫苗,并用其口服免疫草鱼。攻毒实验结果表明,佐剂疫苗、全菌疫苗和微粒疫苗的免疫保护率分别为71.4%、66.7%和52.4%。DNA疫苗可以提高鱼体对疾病的防御能力,但是口服裸露的DNA疫苗的免疫效果比较低。因此,需要给鱼类口服包裹后的DNA疫苗。Heras等将一种表达衣壳蛋白VP2基因的DNA疫苗包裹在海藻酸钠微球内避免其受到消化系统的影响,并用该疫苗免疫虹鳟鱼。结果显示,在接种该疫苗的早期,衣壳蛋白VP2基因在虹鳟鱼的不同器官内均有表达。该疫苗能诱导先天免疫反应,相较于在接种7-15天后再接种空质粒疫苗,该疫苗能提高鱼体内IFN的表达量,并且高达十几倍。

  还有研究者也将重组DNA技术与微囊疫苗结合起来对鱼类进行口服免疫。

  Caruffo等发现,HE(hemagglutinin-esterase,血凝素酯酶)病毒的表面蛋白与F蛋白(来源于具有不同传染性的鲑鱼贫血病毒(ISAV)毒株)的保守区域借助于一个表达载体在酵母中被克隆合成为核苷酸被优化的基因。酿酒酵母体内的优化基因表达的抗原被细胞粉碎机暴露出来,它与ISAV分段蛋白被包裹在一个阳离子多糖基质胶囊里。将该疫苗混入三文鱼配合饵料中,使最终浓度为6mg疫苗/鱼,连续投喂10天,其存活率相较于对照组的6.7%,疫苗组的存活率高达66.7%。

  任燕等用壳聚糖-海藻酸钠包裹哈维氏弧菌(Vibrio harveyi,Vh)重组外膜蛋白OmpK,制备复合微囊疫苗,口服免疫斜带石斑鱼,两周后加强免疫。免疫30天后,腹腔注射1.0× 107 CFU /ml 的哈维弧菌进行攻毒实验。结果显示口服微囊疫苗组的RPS(相对存活率)达到62.5%,高于OmpK蛋白组(P<0.01)。这证明,这种微囊疫苗口服免疫斜带石斑鱼后,能使鱼体产生较好的免疫保护力。

  Saurabh等将迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的外膜蛋白A包裹在壳聚糖纳米微粒(NP)中,形成纳米微粒重组外壳蛋白(np-rOMP),免疫缨野鲮(Labeo fimbriatus),以灭活全细胞大肠杆菌(iwc-nt)疫苗、空纳米微粒疫苗作为对照组。攻毒实验结果显示np-rOMP疫苗组、iwc-nt疫苗组、空疫苗组的存活率分别为73.3%、48.28%和为23.33%。表明np-rOMP疫苗较iwc-nt疫苗能在鱼体内产生更高的免疫水平,从另一方面也说明了壳聚糖微粒在疫苗呈递过程中起的保护作用。

  4.2生物载体疫苗

  口服疫苗通常是拌入饵料中或者用人工合成的材料进行包裹,这样就可能造成饵料的适口性不佳,导致疫苗的摄入量较低,不能达到预期的免疫效果。为了解决这一问题,许多研究者尝试采用天然的生物饵料作为疫苗的载体来增强疫苗的摄入。

  余俊红等在用微胶囊疫苗口服免疫鲈鱼时,对疫苗进行了两种形式的处理,即直接拌入饲料和卤虫携带。在免疫结束一周后,用活菌进行攻毒实验,结果表明,相较于其他疫苗,卤虫携带生物微胶囊疫苗能够在鲈鱼鱼体内发挥最好的免疫效果,其对应的疫苗组在一周内的相对存活率高达75%;直接口服的微胶囊疫苗次之,其疫苗组一周的相对存活率约为63%。这一现象表明口服生物-载体疫苗的免疫保护率优于直接口服微囊疫苗。

  魏克强等通过基因重组技术研制白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)重组囊膜蛋白亚单位疫苗,其成分为表达rVp28和/或rVp19囊膜蛋白的蚕蛹匀浆,口服免疫克氏原螯虾(Procambarus clarkii)长达75天,在免疫35天后分别进行口服和注射攻毒实验,观察鱼体在接种疫苗后对WSSV的抵抗能力。结果表明,在20d内rVp28、rVp28+ rVp19疫苗组的累积死亡率均为36.67%,免疫保护率(RPS)均达59.26%;注射攻毒后,rVp28疫苗组的累积死亡率最低,相对存活率较对照组有很大的提高;在第二次口服攻毒实验后,rVp28、rVp28+ rVp19疫苗组的RPS分别达到63.16%、68.42%,与对照组相比具有较好的免疫效应;说明这种类型的重组蛋白亚单位疫苗可有效提高克式原螯虾的免疫能力。

  任鹏丽等用枯草杆菌作为表达草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus,GCRV)衣壳蛋白VP4的载体,并以此制备口服疫苗。用含有重组芽孢CotC-VP4的疫苗口服免疫草鱼,以口服CotC空载质粒组作为阴性对照,以注射草鱼出血病商品疫苗组为阳性对照。向草鱼注射GCRV两种类型的病毒液,实验结果显示,就累积死亡率而言,在两周以内,阴性对照组的死亡率均高达90%以上,阳性对照组仅为10%,而口服重组芽孢疫苗组分别为45%和60%。从实验结果来看,此类生物载体口服疫苗的免疫效果虽然不如注射疫苗的效果好,但是也能够使草鱼鱼体对GCRV产生一定的疾病免疫能力。

  贾晓会等利用鱼腥藻7120(Anabaena sp. PCC 7120)作为表达主要包膜蛋白VP28的载体,口服免疫凡纳滨对虾(L. vannamei)仔虾,观察此种疫苗对WSSV的抗原免疫能力。实验者将仔虾分为5组,1组和2组投喂未经处理的饲料;3组口服含野生型鱼腥藻的疫苗,4组口服无鱼腥藻的疫苗,5组口服含VP28蛋白的突变型疫苗,各组持续投喂10天,对2-4组进行5小时的WSSV浸泡攻毒实验。攻毒实验结果显示,1-5组的存活率分别为100%、0%、15.5%、20.6%、68%,重组生物疫苗能够使凡纳滨对虾产生抵抗WSSV的较好的免疫保护力。

  张毅等利用PCR重叠延伸技术将蛋白转导域TAT序列与vp28基因融合,以原核宿主大肠杆菌作为表达载体,表达TAT-VP28融合蛋白。将VP28,TAT-VP28蛋白包被饲料后,口服免疫克氏原螯虾(Procambarus clarkii),分别连续免疫7天和14天后,进行WSSV攻毒实验。实验结果显示,10天内对照组的死亡率超过90%,VP28,TAT-VP28蛋白疫苗组的死亡率分别为36.7%、43.3%;50.0%、60%。攻毒实验结果表明,相较于VP28亚单位疫苗,TAT-VP28重组亚单位疫苗对WSSV具有良好的抵抗效果,且其免疫保护率较高。

  4.3复合型疫苗

  此类疫苗结合了两种或两种以上的疫苗形式,包括微囊结合佐剂、载体结合佐剂等;免疫佐剂是指一种能够增强机体的特异性免疫反应的物质,但其本身并不会引起任何特定的反应,它是一类免疫类增强剂。

  生物被膜(biofilm,BF)有时也被用作口服疫苗的佐剂。生物被膜是一些附着在生物或非生物表面的微生物细胞的聚集膜样物,这些微生物附着的表面经常被细胞外聚集物质(EPSs)包裹,EPSs作为生物被膜中的微生物的保护屏障,可增强它们对环境压力的耐受性,如干燥,渗透压,紫外线辐射,消毒和抗生素治疗等。将生物被膜运用在口服疫苗上,可以保护疫苗中的抗原成分在到达肠道淋巴组织的过程中免受消化液的影响,使其发挥应有的免疫功能。

  如丁诗华等采用复乳挥发法制备含嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)被膜或灭活菌体的聚乳酸-乙醇酸共聚物(poly-(1actide-co-glycolide),PLG)疫苗微粒,口服免疫草鱼。实验结果显示,被膜疫苗微粒疫苗组、全菌疫苗微粒疫苗组及空微粒组在攻毒后的相对存活率分别为46.7%、36.7%和6.7%,被膜疫苗和全菌疫苗能使草鱼对嗜产生水气单胞菌一定的抵抗力。

  Josepriya等发现固定化抗原(iAg)可作为抗隐核虫(Cryptocaryon irritans)感染的保护性抗原,并把热休克蛋白70C(Hsp70C)作为固定化抗原疫苗的佐剂,提高鱼体对于隐核虫感染的抗原免疫保护力。将iAg与Hsp70C的cDNA共同和相对独立封装在壳聚糖纳米粒子中,作为抗隐核虫感染的口服疫苗免疫石斑鱼,攻毒试验表明,口服免疫32天后第一次攻毒,含iAg和Hsp70C的疫苗组和含iAg的疫苗组RPS为100%;在第一次攻毒实验结束10天后进行第二次攻毒实验,含iAg和Hsp70C的疫苗组、含iAg的疫苗组RPS分别为51%,15%。试验结果表明,Hsp70C作为固定化疫苗的佐剂能够增强石斑鱼对于隐核虫感染的抗原免疫保护力。这类复合型疫苗成功地提高了石斑鱼的存活率,这一结果对于制备防治隐核虫感染的疫苗提供了一种新思路。

  Chen等发现鳗弧菌(V. anguillarum)可作为抗神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)亚单位口服疫苗的生物佐剂,卤虫幼体可作为该疫苗的载体。该实验以NNV的外壳蛋白作为抗原,鳗弧菌的热休克蛋白60基因作为启动子,运用基因重组技术,获得重组外壳蛋白,将重组的鳗弧菌灭活并由卤虫幼体携带,阳性对照为大肠杆菌口服疫苗组,口服免疫石斑鱼。攻毒后,鳗弧菌疫苗组的RPS为51.3%,大肠杆菌口服疫苗组的RPS为23.1%,鳗弧菌作为该疫苗的生物佐剂起到了积极地辅助作用。

  Rivas-Aravena等用病毒的DNA复制酶(Ad)作为佐剂与灭活的ISAV(V)包裹在壳聚糖纳米微粒(NP)中,连续7天口服免疫三文鱼。30天后腹腔注射ISAV毒液进行攻毒,结果显示,NP-V疫苗组可提供40.4%的免疫保护率,NP-V+NP-Ad疫苗组能提供77.9%的免疫保护率。这些数据表明实验中的DNA复制酶作为佐剂能提高三文鱼的存活率,而DNA复制酶与NP结合更能显著增强三文鱼抵抗ISAV的免疫能力。

  4.4其他的一些口服疫苗

  Companjen等制备了一种特殊的口服疫苗,该口服疫苗主要为融合蛋白,由肠粘连分子和植物病毒肽组成,肠粘附分子结合在肠道内,植物病毒肽作为抗原诱导体液免疫反应。在实验中运用融合的肠道粘附分子和表达于马铃薯块茎的B和T细胞的抗原表位,二者具有良好的异源线性,通过口服疫苗,随后在鲤鱼的后肠中发挥免疫功能,介导体液免疫反应的发生。

  付天增等制备了迟缓爱德华菌菌蜕疫苗,并与全菌灭活疫苗分别口服免疫罗非鱼(Oreochromis niloticus),首次免疫后14天再采用相同方法增强免疫。攻毒结果显示,灭活全菌疫苗和菌蜕疫苗的RPS分别为60%、77%,两者的相对保护率相较于对照组明显偏高(P<0.05),证明菌蜕疫苗相比于灭活全菌疫苗能够在罗非鱼感染爱德华菌病时提供更高的免疫保护力。

  5 总结与展望

  疫苗口服是一种较为简单快捷的免疫方式,它避免了注射疫苗和浸泡疫苗存在的一些问题,减少了劳动强度和人工投入,更重要的是减少了注射免疫带来的强应激反应。这种免疫方式并不受鱼体大小,种类,地点,时间等的限制,是一种较为理想的疫苗给予方式。口服疫苗在消化道中主要以粘膜免疫为主,但是就目前的研究来看,其粘膜免疫的具体机制尚不清楚,因此,在后续的工作中应该就粘膜免疫这方面展开更深入的研究。

  口服疫苗一个不可回避的问题就是怎样避免消化道对抗原的影响,怎样维持疫苗在到达后肠前的稳定性和完整性,以及抗原的释放问题。就目前处于实验室研究阶段的口服疫苗其免疫效果仍然与注射疫苗的免疫效果有差距,甚至有时只能达到注射疫苗免疫效果的一半。因此,在疫苗生产中抗原的处理方式,有效剂量,疫苗的包裹材料、载体、佐剂等的类型、疫苗形式以及免疫时间、免疫次数、实验鱼的生理发育阶段等都需要研究者们做出进一步详尽的研究,不断攻克水产口服疫苗的关键技术,切实提高口服疫苗的免疫效果,为水产养殖的健康保驾护航。

栏目分类