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水生动物类论文 一组水生动物原代细胞的培养

2018-12-17 14:27:58来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘 要

  水生动物包括在水体环境中生长生活的水生无脊椎动物以及脊椎动物。水生动物在全世界范围内都处于一个较为脆弱的状态,各地也对水生动物的培育及细胞学特性展开了一系列的研究。其中本文所选用的材料之一中华鳖,主要分布在亚洲大陆东南部地区的咸淡水域,不仅具有食用价值又富有药用价值,而在2000年其被世界自然保护联盟评估为易危。另一材料三角帆蚌在食品医药以及工业领域都是一个珍贵的物种,也是我国淡水珍珠产业化生产的首选材料。而近期三角帆蚌在中国及越南的数目都因为环境受破坏而不断下降中,这引起了广泛的关注。本论文以三角帆蚌和中华鳖为实验对象,探索研究关于他们的细胞培养,进行了细胞体外原代培养,并对细胞培养条件进行优化改进。

  关键词: 水生动物;细胞培养;原代培养

  1前言

  1.1 水生动物概况

  水生动物包括在水体环境中生长生活的水生无脊椎动物以及脊椎动物。水生动物在水生生态系统中具有较高的地位和作用,其经济与科研价值也相对较高。水生动物在不仅在食用以及药用方面有较高的价值而为人所周知,并且其在研究分子生物学上也有宝贵的利用价值。其中水生无脊椎动物在细胞培养方面利用较多的材料是甲壳类包括龟鳖目、贝类包括三角帆蚌以及海绵类等。本次实验的其中一种材料是三角帆蚌,三角帆蚌所产的珍珠被国内的淡水珍珠行业所广泛使用,是我国主要的淡水育珠蚌,其培育价值也相对而言比较高。三角帆蚌外套膜上的珍珠囊受到外界刺激,分泌含碳酸钙的分泌物可与异物结合覆盖便可以形成珍珠,因此其组织的细胞培养具有较高价值。石安静等人已经在八十年代初对三角帆蚌的外套膜组织培养进行了探索。但是目前贝类的组织培养研究工作展开的还是不多,也还没有突破瓶颈,贝类外套膜细胞系还尚未建立。而实验中的另一材料中华鳖作为中药材和营养保健品也为人所熟知,在龟鳖目动物中的经济价值也相对而言比较高。然而由于环境的恶化与人为过渡捕捞的情况下,水生动物包括三角帆蚌与中华鳖在内的数量正在不断下降中。另一方面,世界范围内对其进行细胞培养以及研究生物学特性的报道也相对而言较少。因此这些水生动物的细胞培养探索和改进实验,对于人工培育开发以及研究等各方面都具有重要的现实意义和发展前景。

  1.2 细胞原代培养方法

  动物细胞离体培养实验在1880年首次报道,Arnold发现在血清以及淋巴液中的白细胞均可以分裂这一现象,并阐述了白细胞(leucocytes)的分裂。有脊椎高等动物尤其是哺乳类动物的细胞培养与其细胞系的建立研究较多,也开始的较早,并且培养技术相对完善成熟。然而在水生动物中,尤其是水生无脊椎动物的细胞培养方面仍然存在不少问题和难点,与之相关的可查阅参考的文献报道也相对较少。其原代培养细胞难以形成单层并且也难以进行传代培养,培养的难点突破进程缓慢。水生脊椎动物中主要包括为鱼类的细胞培养,则相较而言进展顺利得多,细胞系的建立工作也不断展开,有近百株细胞系已经建立。目前世界上几个主要的细胞库包括美国菌种保藏中心,又称美国模式菌种收集中心(ATCC)和欧洲细胞株、微生物保藏中心(ECACC),其中淡水蜗牛(Biomphalaria glabrata)担轮幼虫胚胎细胞系BGE是首先建立的软体动物细胞系。其他水生无脊椎动物都还没有建立相应的细胞系,目前也还没有统一的和规范的有关于中华鳖以及三角帆蚌体外细胞培养的方法和技术手段。其中有关龟鳖类的染色体研究在国内外都已经开展了不少工作,然而对其细胞培养并进行生物学特性研究的却还少有报道。并且目前中华鳖的心脏培养仍大多处于原代培养阶段,传代培养少有报道,有待展开深入的探究。

  进行细胞体外原代培养的方法有多种,哺乳动物获取原代细胞时常选择机械分离法,这一方法适用于细胞间连接较松散的组织,操作步骤为用力将组织挤出筛网,以使得细胞分散,处理后再置于培养瓶中培养。也可以采用胞酶消化法,可使用胰酶作消化,完成后去胰酶后再加入培养液,最后于培养瓶中培养,这一方法适用于绝大多数组织器官。组织块固定法则适用于组织量不大的情况,将组织剪成小块后按一定密度均匀地将组织块贴于培养瓶壁,再加入适当培养液浸没组织。不同类别的水生动物或者同一类别不同组织来源的水生动物细胞培养会采用不一样的体外培养方法。在培养基的选择上,常用的哺乳动物细胞培养基包括RPMI-1640、DMEM、MEM 等等。在对水生动物细胞原代培养研究时,可以借鉴参考脊椎动物如成熟的哺乳动物细胞培养技术,但应在哺乳动物常规细胞培养的基础上,同时也必须关注自身的特殊性,对培养条件进行改良,包括根据培养物的特性对培养基的选择优化以及培养环境的调整。由于水生动物生活在水体环境,本实验使用的三角帆蚌生活的开放环境会使得其组织携带更多的细菌病毒,使得水生动物在进行原代培养过程中更加容易被细菌微生物所污染而难以进行。而污染防治对于细胞体外培养至关重要,所以在处理水生动物组织时需要关注到这一困难,从而要在操作过程中严格规范操作并提供无菌室以及谨慎处理各种取材工具和培养液,取材过程也应要在经过紫外线照射2小时后的实验室无菌操作。在进行原代培养之前,首先需要对实验器材进行高温高压灭菌。操作要严格规范,并需要在超净工作台完成。提供原代培养用的培养基和盐溶液等也都要事先经过灭菌。在培养基的配置过程中需要添加抗生素,确保不被细菌所污染。机体的处理要先使用双蒸水进行反复多次的处理清洗,然后再使用70%酒精处理,以杀灭所附着于机体本身的细菌以及微生物。也可采用密度梯度清洗的方法来有效地防止污染。在水生动物细胞培养中,添加双抗能够对微生物的生长起到较好的抑制作用。所以在清洗时可以适当加入一定浓度的双抗以防止组织被细菌污染。

  本文将对三角帆蚌和中华鳖的细胞进行体外原代细胞培养研究,现将结果予以报道。

  2 三角帆蚌外套膜细胞的原代培养

  2.1 材料和方法

  2.1.1 实验材料

  本实验所选用的三角帆蚌采购于金华三角帆蚌养殖基地,实验开始前暂且置于实验室水族箱中,在此期间不断用充气泵增氧。

  2.1.2 实验试剂

  参照石安静[4]改良配方,配置平衡盐溶液:

  NaCl 4.00g KCl 0 .20 g

  CaCl2 0.07 g MgCl2·6H2O 0.05 g

  MgSO4·7H2O 0.05 g KH2PO4 0.03 g

  Na2HPO4 0.08 g 葡萄糖 0.50 g

  酚红 0.01 g(PH值指示剂)取上述药品将其于1 L双蒸水中溶解,并进行高温高压灭菌,时间控制在15至20 min左右,并用已灭菌的 2 mol/L NaHCO3来调节盐溶液的pH为6.8至7.0,其中以酚红作为PH值的指示剂。

  配置经改良后的培养基如下:

  58% DMEM液体培养基 20%胎牛血清

  10%自制三角帆蚌血清 10%盐溶液

  2%抗菌-抗真菌剂 10 ng bFGF 本实验最后使用的改良培养基是以普通DMEM培养基为基础参考后再加入bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、蚌血清以及钙镁离子等而成的。添加源于三角帆蚌血窦中的经过灭菌的自制蚌血清后,能够有效地提供接近于生物体内的培养环境,更适合三角帆蚌细胞的体外原代培养。添加的bFGF具有较强的促细胞分裂增殖活性,可以促进细胞分裂,因而可以一定程度上有效地促进三角帆蚌细胞的体外生长分裂。添加抗生素则可以在一定程度上防止细胞体外培养过程中被微生物所污染。添加盐溶液是为了给细胞生长提供所必须的金属离子,在改良后的培养基中添加了适量浓度的钙镁离子加入时要注意用量,以防止在高浓度时的毒害作用,这对于细胞内DNA的复制和蛋白质的生物合成有所帮助。

  2.1.3 组织块培养法

  选取生长健康良好、生活力强的三角帆蚌,用肥皂水洗刷干净蚌外壳部分,再用清水冲干净,最后蒸馏水反复洗涤。洗净后在无菌室用已经高温高压灭菌后的双面刀片将其闭壳肌割断,打开外壳然后剪下外套膜边缘,于双蒸水中反复洗涤 3至5 遍,然后于70%酒精溶液中停留不超过10s。清洗过后将组织置于用平衡盐溶液配置并已经过灭菌的抗菌溶液(青霉素 4000 单位/mL,链霉素 5000单位/mL)中浸泡约 15至30 分钟。之后将组织继续进行梯度清洗,其清洗顺序如下:先于平衡盐溶液5 分钟后,于含 2% 抗菌-抗真菌剂的盐溶液5 分钟,于10%抗菌溶液5 分钟,再于4%抗菌溶液5 分钟,再于平衡盐溶液5分钟,接着于70%酒精溶液中停留不超过10s,最后于平衡盐溶液10 分钟。

  清洗操作结束后,将已获得的组织用已灭菌的双面刀片切碎成约1 mm3大小的小块,并取适量小块均匀贴于培养瓶内。然后将培养瓶倒置于26℃恒温培养箱中培养 ,24 小时后,将培养瓶缓慢翻向并加入 5 mL培养液使得完全浸没组织片,继续在恒温条件下培养,每 2至3 天进行培养基更换,具体示细胞生长情况而定。

  2.1.4 细胞培养

  根据上述的组织块培养法获得组织块,将组织块进行2000r/min离心清洗2至3次,再加入约 2 倍胰酶于37℃恒温摇床上以120r/min速率进行组织块消化 30 min,当组织碎片基本悬浮在胰酶中不再下沉时,加入约 1 / 4 胎牛血清培养上清液进行终止反应,1000 r/s离心5 分钟,将上清液倒去,沉淀用已灭菌的双蒸水清洗,重复三次操作后加入至培养基中,而后移入培养瓶内,置于 26℃恒温培养箱中培养,24 小时后进行一次培养基的更换。继续在恒温条件下培养,每 2至3 天进行培养基更换,具体示细胞生长情况而定。

  观察细胞生长情况并进行显微拍照记录。

  2.2结果与分析

  2.2.1光学显微镜观察结果

  实验结果表明,本实验中三角帆蚌外套膜原代细胞培养良好。其原代培养细胞在使用不断优化调整后的培养基上,能够快速生长分裂。说明这一优化调整创造了外套膜细胞原代培养更为适应的体外培养环境,这一改进有利于细胞的生长分裂。细胞游离出组织的时间较短,细胞迁出率较高,迁出的细胞在组织块周围密度相对较大并成团生长。在倒置显微镜观察下发现,组织块在培养基中培养细胞迁出速度快和数量多,且由10倍下的照片也可以看出细胞集中分布在组织块周围再向外扩展,细胞呈现出集中生长的趋势,出现了细胞团块。40倍显微镜下可以看出细胞的形状较为规则,且细胞多为圆形或椭圆形,明亮且透明。由显微观测照片也可以看出,本实验中的原代培养细胞表现出较为优良的生长状态。

  1

  2

  图2-1 三角帆蚌外套膜细胞体外原代培养状况图

  注:1:三角帆蚌外套膜细胞培养状况(40X);2:三角帆蚌外套膜细胞培养状况(10X)

  1

  2.2.2荧光染色结果

  A

  D

  C

  B

  本实验使用DAPI作为荧光染料染色,DAPI可以透过细胞膜与胞内DNA结合,常被用来染色活细胞和固定细胞。取体外原代培养单层细胞用平衡盐溶液漂洗约5分钟,用改良后的缓冲液配置的DAPI染色液染色约10至20分钟左右,再经过缓冲盐溶液漂洗后封片。染色后用于荧光显微镜观测,根据荧光强度来观测确定DNA的量,并且拍照记录实验结果。观察细胞状况,照片中可以显示三角帆蚌体外原代培养细胞的生长状态良佳,细胞密度大,细胞多表现为聚集生长并向外扩散。由荧光染色照片可以看出,其细胞核大多呈的是较规则的圆形或椭圆形,为正常细胞。

  A

  图 2-2 三角帆蚌原代培养细胞DAPI染色荧光检测图

  3 中华鳖心肌细胞的原代培养

  3.1材料和方法

  3.1.1实验材料

  实验所用的中华鳖采购于绍兴养殖基地,体重约为100g ,暂时保存于恒温水族箱中饲养一周左右。实验室开2小时紫外灯进行消毒。

  3.1.2培养基

  RPM I-1640培养液 20% 小牛血清

  1% 双抗 (青霉素100U/mL,链霉素 100U /mL) 1% 谷氨酰胺培养基以RPM I-1640培养液为基础,添加小牛血清可为细胞培养提供一定的生长因子、促细胞贴壁因子以及其他活性物质。添加双抗使中华鳖心肌细胞在培养过程中能一定程度地抑制微生物的生长,防止细胞被污染。添加谷氨酰胺一方面可以作为细胞培养过程中的能量来源,另一方面也可以参与蛋白质合成以及核酸代谢。谷氨酰胺容易分解,分解后产生的氨对细胞有毒害作用,所以注意要在使用前再加入。再用NaHCO3将培养基 pH调节至 7. 0至7.2左右 。

  3.1.3培养方法

  用生理盐水清洗鳖的体表,再用酒精进行体表消毒后,用已经高温高压灭菌的镊子刀片在无菌室的超净工作台取出中华鳖的心脏 ,在含双抗 ( 青链霉素1000 U /mL)的磷酸盐缓冲液 ( PBS )中反复清洗 3次,以去除血细胞,再用 RPM I- 1640培养液清洗 1次。取洁净已灭菌的剪刀在培养皿中将其剪碎成约 1mm3大小的组织块,并取适量均匀涂抹于培养瓶中贴壁,然后将培养瓶倒置于30℃ 恒温箱内培养, 24小时后,将培养瓶缓慢翻转,补充数滴培养液,再继续恒温培养 3至4天后,加入 5mL培养液使得完全浸没组织片继续进行培养,每天观察细胞形态及监测 pH值的变化。

  3.2结果与分析

  中华鳖的原代细胞培养所需时间较其他动物细胞体外培养时间长生长较缓慢,一个原因可能是龟鳖目动物本身生长就比较缓慢并且被体外培养环境而影响,另外也有可能是龟鳖端粒染色体较短有关。中华鳖细胞体外原代培养30至40小时左右,可以看到细胞开始贴壁生长。随着时间推移,在体外培养约5天时,可以观察到约有一半以上的细胞已经形成汇合层。继续培养在10天左右时,细胞逐渐向组织块外扩展生长,并且可以发现细胞呈放射形排列于组织块周围。镜下观察可见此时细胞胞体大且呈纺锤形、多角形和扁平星形以及不规则的形状且有分支,形态表现为不太规则平整,其细胞核一般只有一个并多位于细胞中部,且细胞核较大并呈规则的卵圆形或椭圆形,具有突起,轮廓清晰、透亮、颗粒少,立体感强。继续培养观察到细胞渐渐地向外扩散生长,时间约为 1个月,并形成了致密的细胞单层。

  图 3-1中华鳖原代细胞培养显微镜观察图

  4 总结与讨论

  水生动物的体外细胞培养技术可以广泛应用于水生动物的养殖生产、水生动物病毒学方面的检测与分离 ,同时水生动物细胞培养技术可以在药物学和毒理学等等的研究方面起着重要作用。包括这次实验中所选用的材料三角帆蚌在育珠方面的经济价值以及对于中华鳖在鳖病毒的探究方面以及作为食补材料方面等都有较高的利用价值。21世纪可以称得上为海洋的世纪,研究水生动物与水体环境之间的相互关系是一个热点。从水产养殖例如其中的优良品种的研究培育以及水生动物疾病防治监测等等这些探究中,应用生物技术能够不断推进海洋经济的发展。

  目前,水生动物的细胞系已经建立的数目仍然相较而言是不足的,其培养的成功与否是与培养基选择配置和培养环境息息相关。在实验中对所选用的实验材料在进行其细胞生理及代谢等方面基础知识的深入了解消化后,再不断深入探究和改良完善对于水生动物的细胞培养方法,在借助了一些已获得成功成熟的脊椎动物以及其他无脊椎动物包括昆虫类的细胞离体培养经验下,进行培养基成分选择、培养环境、培养方法以及污染防治的尝试与不断优化。水生无脊椎动物在原代培养时就极容易失败,与上述的这些因素都息息相关。本实验取材为三角帆蚌外套膜组织细胞,配置了添加钙镁离子的平衡盐溶液以及改良后的DMEM液体培养基,更适于蚌类的体外培养。采用组织块培养法较其他方式对细胞的损失和消耗相对较少,并且这也有利于细胞的贴壁生长。另一种选择为胰酶消化法,这种方法相较而言,细胞培养的速度有所提高,但是获得的细胞贴壁性欠佳。中华鳖的原代培养取材于心脏,心脏组织细胞是中华鳖机体上最具有活力的细胞,容易进行体外原代培养。以RPM I-1640培养液为基础并添加一定小牛血清以提供适当的生长因子,从而有利于细胞的生长。其中生长因子的选择也至关重要,在本实验中为三角帆蚌外套膜组织细胞体外培养选择了bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)和蚌血清,为中华鳖心肌细胞培养选择了小牛血清。这些生长因子在一定程度上促进细胞生长的同时也有较大可能因为其中一些不确定的成分,而阻碍限制了细胞的生长分裂。所以在细胞培养领域,现在的一大重要研究课题,即无血清培养基正在不断地探索中,无血清培养可以有效避免血清中一些成分对细胞的污染和产生毒性等负面影响作用。同时,目前对于水生无脊椎动物细胞增殖与凋亡机制、分子调控机理以及水生动物特殊的细胞生理研究都还不够透彻,这一点也很大程度上制约了水生无脊椎动物细胞培养的进程。在进行原代培养时,可以发现细胞极容易被微生物所污染,这可能与操作环境、机体处理、培养过程中的化学及物理因素以及培养基成分都有关。同时在操作时要注意避免细胞的交叉污染。实验进行前检查对器材以及培养基的灭菌情况,实验操作要谨慎规范并在已经过紫外消毒后的无菌室中进行,在每一个环节都需要小心。在进行本次实验过程中,根据细胞原代培养结果以及出现的问题,不断改进调整培养方法,找出原因并进行针对性的措施以保证了实验的进行。

  虽然关于水生动物的这些细胞培养技术仍然还不够成熟,改进和探索仍然在不断的进行中,但随着不懈的进展与发现,一些难以培养的水生动物细胞一定会有所突破。因此对三角帆蚌外套膜组织细胞以及中华鳖心肌细胞的培养,能为深入研究各种其他水生动物的原代细胞培养积累一定的经验。

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