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动物科学类论文 MITF基因在栗羽、黄羽和白羽朝鲜鹌鹑胚胎期皮肤组织中的表达

2018-12-08 11:25:19来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘 要

  小眼畸形相关转录因子(MITF)在黑素细胞的分化中起着关键调节因子的作用,所以MITF基因的表达,无论是对于动物的毛色还是对于禽类的羽色都具有相当重要的调节作用。为了研究MITF基因的表达量对朝鲜鹌鹑羽色形成的影响,本研究选择将栗羽朝鲜鹌鹑、黄羽朝鲜鹌鹑和白羽朝鲜鹌鹑作为研究对象,首先分别选择栗羽朝鲜鹌鹑、黄羽朝鲜鹌鹑和白羽朝鲜鹌鹑的种蛋进行孵化,然后在孵化的第6天时取出孵化的种蛋提取出朝鲜鹌鹑的胚胎,每间隔一天取一次样,一直取到第14天。在无菌条件下分离鹌鹑胚胎背部的皮肤组织,提取出所需的总RNA,随后经反转录合成cDNA第一条链,通过设计并合成MITF基因的特异性引物,扩增出朝鲜鹌鹑MITF基因的启动子序列。利用实时荧光定量PCR技术对MITF基因在栗羽朝鲜鹌鹑、黄羽朝鲜鹌鹑和白羽朝鲜鹌鹑胚胎期皮肤组织中的表达情况进行分析,最后利用生物信息学分析方法对实验的数据进行分析和对比并得出结论。结果发现,MITF基因在不同羽色的朝鲜鹌鹑的相同天数之间,相对表达量并不相同;MITF基因在同一种羽色的朝鲜鹌鹑之间,不同天数的相对表达量也不相同。同时,不同羽色的朝鲜鹌鹑之间的总体表达量也有区别。另外,MITF基因在第12天的时候相对表达量最高,而且在白羽朝鲜鹌鹑中的相对表达量出现下调。最后本实验也表明了MITF基因对于朝鲜鹌鹑羽色的形成有一定的影响。

  关键词:MITF,朝鲜鹌鹑,实时荧光定量PCR,基因表达分析,相对表达量

  1 前言

  1.1 鹌鹑简介

  鹌鹑在很久以前就存在于地球,它的地域分布非常的广泛,鹌鹑的品种也非常的多。由于鹌鹑的蛋、肉的口感鹌实在是美味,因此鹌鹑在很早的时候就得到了人类的关注。在很早的时候,古中国和古埃及就同鹌鹑有了一定的联系。人们在古埃及发现了鹌鹑的有关图画,并且同时发现了吃鹌鹑的相关记载。受益于中国的地大物博,为野生鹌鹑的主要生活和繁衍提供了适宜的条件,这也间接导致了中国成为世界上最先饲养野生的鹌鹑的国度之一。近来,由于其食疗作用和营养价值的发现,越来越多的国家开始重视鹌鹑的饲养;现在很多的养殖场内都建设了鹌鹑车间,鹌鹑的饲养业逐渐变得受到欢迎[1]。

  同时由于鹌鹑的生长迅速,成熟期时间短,繁殖也很迅速、对外界的变化很敏感的特点,可以被当做理想的试验动物[2]。目前为止,人们已经培养和繁殖出了诸如“SPF鹌鹑”、“近交系鹌鹑”和“无菌鹑”等具有高实用性的可应用群体,为科学的实验和研究带来了很多地便利,同时,其作为理想的实验材料得到了非常广泛的应用[3]。

  1.2 鹌鹑羽色遗传研究

  1.2.1 鹌鹑的羽色种类

  近年来,随着人们对于鹌鹑的食疗作用和营养价值的普遍关注,羽色作为禽类的一种重要遗传标记,得到了越来越多的研究。

  1979年ruax R E 等为了确定日本鹌鹑的羽毛颜色的遗传机制,通过对日本鹌鹑的羽毛颜色进行了细致的研究 ,并且得出了日本鹌鹑的羽毛颜色的类型[4]。

  1979年Chikamune T 等通过研究得出:日本的黄羽鹌鹑、白羽鹌鹑、黑羽鹌鹑之间相互杂交后将会呈现8种不同颜色的羽色,这证明了这三种羽色的日本鹌鹑之间存在一定的遗传相关性[5]。

  2012年徐华伟分别对栗羽(野生型)、浅灰羽、不完全黑羽、黑羽以及白羽、灰羽和黄羽等几种不同颜色的朝鲜鹌鹑进行了研究[6]。

  1.2.2 朝鲜鹌鹑羽色的遗传

  通过查阅鹌鹑羽色的遗传的相关文献,总结了历年来人们对于朝鲜鹌鹑羽色同相关染色体基因的研究成果,以便于明确本实验的目的,以及为本实验提供相关的科学依据,具体内容如下:

  近宗干城等通过实验证明了鹌鹑的羽色是通过三对等位基因来决定的;并且进一步研究得出这三对等位基因分别位于不同的常染色体上,分别为I和i,+和+D,以及Y和y基因;其中ii(纯合)时,不仅仅没有深色和褐色,还有野生色也不会出现;Yy+ 不仅对++有上位作用,而且还是所有黄色个体的基因型;Y是决定羽色为黄色的基因,当其为纯合子时有致死的作用[7]。

  庞有志等通过对朝鲜龙城系蛋用鹌鹑进行研究,第一次在试验中发现了鹌鹑的伴性羽基因的Y/y和B/b两个基因座之间存在连锁关系,它们都是Z染色体上的基因座[8]。同时他们还进一步的研究了这种作用对鹌鹑的羽毛颜色的影响机制,并作出了科学地,系统地总结[9]。

  于美琴对鹌鹑的羽色遗传机制的研究,通过使用遗传学杂交试验法进行试验,得出如下结论:H和h是一对位于常染色体上的等位基因,它们控制着鹌鹑的黑羽性状;其中B/b和Y/y两个基因座位于性染色体Z上,H/h基因座与它们两个具有一定的互作关系,同时H的等位基因h为不完全的隐性基因[10]。

  通过本次的研究,为鹌鹑种质资源的评价带来了便利,而且还培养和繁殖出了黑羽鹌鹑的新品系。对鹌鹑羽色的遗传研究有了更深的认识。

  1.3 动物黑色素的形成与几个主要调控基因

  1.3.1 动物黑色素的形成过程

  黑色素,顾名思义是一种黑褐色的色素,它储存于黑色素细胞中,主要存在于动物的皮肤或者毛发中;众所周知的白斑的形成,正是由于黑色素在某种特殊的原因下不能产生和积累,进一步导致色素的缺少和流失所引起的。而黑色素又可以划分为真黑色素和褐黑色素; 真黑色素的数量和其分布的部位对动物的毛色和禽类的羽色产生一定的影响,同时褐黑色素的数量和其分布的部位对动物的毛色和禽类的羽色也可以产生一定的影响。而无论是动物的毛色还是禽类的羽色,最终都是在两种 黑色素的共同作用下产生影响的。真黑色素与褐黑色素产生的调控模式如下图1所示[11]:

  刚开始的时候,从垂体中叶分泌α-MSH分别作用于MITF(小眼畸形相关转录因子)和MC1R(Melanocortin-1 Receptor的英文简称,中文名称为黑色素皮质素受体1)。一方面, 酪氨酸的量的多少可以受到酪氨酸基因的表达的影响,但是酪氨酸基因的表达量的多少却取决于MITF(小眼畸形相关转录因子)的调节,因此,酪氨酸的量的多少最终还是由MITF(小眼畸形相关转录因子)来决定的;在另一个方面,MC1R(Melanocortin-1 Receptor的英文简称,中文名称为黑色素皮质素受体1)可以激活与其自身偶联的G蛋白,使得没有活性的GDP转化为有活性的GTP,从而进一步激活腺苷酸环化酶系统,随着系统的激活,cAMP(环腺苷酸磷酸)的生成量增多,激活酪氨酸激酶被激活并且开始合成TYR(Tyrosine的英文简称,中文名称为酪氨酸酶)。酪氨酸可以被黑色素细胞从血液中吸收进入细胞内,然后将酪氨酸转化成为化合物多巴 ,由于这种转化作用,

  图1 真黑色素与褐黑色素产生的调控模式示意图

  细胞可以不断地合成多巴,并且导致其在细胞内不断地聚集和积累。黑色素细胞的这种功能不仅仅得益于酪氨酸基因的表达对细胞的调节作用,还得益于TYR(Tyrosine的英文简称,中文名称为酪氨酸酶)的对于细胞的催化作用,两者相辅相成,共同作用于黑色素细胞。

  关于多巴的下一步合成取决于细胞中TYR的含量。当TYR(Tyrosine的英文简称,中文名称为酪氨酸酶)的含量在细胞中过多时,多巴将最终合成为为真黑色素。但是,当TYR(Tyrosine的英文简称,中文名称为酪氨酸酶)在黑素细胞中的含量过低时,多巴则先通过转化为半胱氨酸多巴,最终合成褐黑色素。由上述表述得出,动物的毛色主要涉及到了MCR基因、TYR基因、MITF基因和ASIP基因表达产物的调控。因为鹌鹑的羽颜色毛形成机制与动物的毛色形成相类似,所以以上内容均可为鹌鹑羽色形成机制的研究提供有力的科学依据。

  1.3.2 MITF基因

  小鼠的MITF基因已经通过了实验的科学预测和测定,实验的结果表明它是位于第6号染色体上,同时它的基因组成还包含有外显子9个;它可以通过转录相关的RNA来调节和编码相关的MITF蛋白;这种特定地蛋白质经过实验的测定证明包含共有419个相关的氨基酸残基共同组成了其特殊的结构;这种蛋白质的生化特性来自于其蛋白组成中的一个包含bHLHZip的小片段结构。MITF 既可以在一个方面作为一个起主要控制作用的基因同黑色素细胞的发育和存活联系起来;与此同时,在另一方面MITF还可以作为一个起关键作用的转录因子来调节主要的黑色素蛋白;最明显的例子就是,酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白的表达受其调节和影响。MITF还被证明可以通过上调Bcl-2蛋白(一种主要的抗凋亡蛋白)的表达,来促进色素细胞的生存[12]。

  1.3.3 MC1R基因

  MC1R基因已经通过实验证明是一个非常重要的基因,它的表达可以对动物的毛色或者禽类的羽色产生影响;它的基因组成比较特殊,通过科学地观察和测量发现它居然只含有1个外显子[13]。由于该基因的特定结构,其转录和翻译生成的相关产物可以影响动物或者禽类的黑色素的合成。与此同时,正是由于该基因的这种影响,人们常常使用它作为研究对象,来研究它对动物皮毛中色素的沉积的作用[14]。此外MC1R基因还可作为主效基因来决定鸡的羽色性状。MC1R同α-MSH相结合 可以提高cAMP(环腺苷酸)的含量 ,并且可以提高酪氨酸的含量,最终合成真黑色素[15]。

  1.3.4 TYR基因

  人类酪氨酸酶基因族包括可以产生TYR、TYRPl和TYRP2蛋白的三个相关基因,它们均可催化黑色素的生成[16]。一方面,在基因结构上,人们通过科学地实验测定了TYR基因的基因结构,它的基因结构组成中含5个外显子;同时TYRPI蛋白的基因序列包含有七八个外显子;TYRP2蛋白的基因结构也被测出共含有由8种外显子。此外,科学家们通过对这3种基因的相关结合位点的区域进行了详细的分析,然后结合对这3种基因的外显子区域的研究和分析,进一步的发现了它们的结合位点除了最末的外显子区域外,其他的位点都不一样;另一方面,在蛋白质的结构上,TYR,TYRPl和TYRP2三种蛋白质有50%的相似性;最后,在功能上,TYR基因经过转录和翻译,可以合成一种名为铜粘合蛋白的蛋白质,这种蛋白质的分子量是55 KD,它必须经过糖基化的生化反应过程才能转变成一种成熟的蛋白质,发挥其特定的生物活性作用,此时其分子量增加至65—75kD 。所以TYR基因对于动物体内黑色素合成有着非常重要的作用,其表达的生成TYR具有重要的催化作用,同时TYRPl对黑色素细胞最终产生的黑色素类型也具有一定的催化和决定作用[17]。

  1.3.5 ASIP基因

  ASIP基因,即通常所说的Agouti基因,它可以作为一个主控基因对动物毛色中黑色素性状进行调控,因此它非常广泛地存在于哺乳动物中,且其对禽类羽色具有非常类似的调节机制[18]。

  ASIP通过实验证明是一种信号因子,它是由真皮乳头细胞(位于黑色素细胞的旁边)通过旁分泌的方式分泌,仅仅对毛囊的微环境发挥作用,可以在时间和空间上分别对真黑色素的合成进行调控[19]。

  1.4 MITF基因的研究现状

  周泓燕通过研究,得出了MITF是一种非常重要信号分子,它的作用非常多:作为一个转录因子,它既可以在色素细胞的信号转导过程中发挥重要作用,也可以参与多级信号的级联过程;无论是色素细胞的发育还是分化,它都起着重要的作用,甚至在色素细胞的功能上都起着重要的作用;MITF基因可以作为一个特殊标记的靶位为我们研究其他相关基因提供便利。

  白瑞等人通过研究MITF与MGF的关系,得出了MITF基因的表达同马的毛色有一定的影响,如果MITF基因的结构发生了改变,色素的聚集和积累会受到影响,进而可能会引起马的毛色发生。

  高伟会等通过实验发现了MITF基因的2号位点,9号位点,10号位点,12号位点和14号位点都含有3种基因型,分别是CT 、TT、CC,但是各个位点的基因型的频率不同;此外MITF基因的13号位点不同于其他的位点,它的基因型分别为GA、GG、AA [20]。

  牛晓艳等经测序得到MITF1、2、4、5、7号外显子内存在丰富的多态,进一步分析表明了这些多态可能同实验材料的皮毛颜有某种程度上的联系,这很有可能说明在獭兔的毛色形成过程中MITF基因发挥了一定的作用;由于MITF影响了细胞内黑色素的产生,所以编码它的基因内的脱氧核苷酸的排列顺序发生改变可能会影响到毛色,其具体的产生影响的机理,还有待深究。

  1.5 主要采用的研究方法

  1.5.1动物组织总RNA提取技术

  从动物的组织中提取总RNA是一项非常重要的实验的技能, 这种实验技能已经开始在越来越多的领域得到广泛的应用;在RNA的水平上,我们一方面可以对生物体内的基因的表达水平进行深入的科学分析和研究,另一方面,我们可以通过研究RNA的结构和数量对其调节机制进一步深入的了解,对其翻译的过程和合成的相关蛋白质拥有更深的认识。该技术的要点在于如何从动物的组织中提取得到高质量,高完整度的RNA ,因为很多实验的结果都会受到你提取的RNA的影响,如果提取的质量高,实验最后研究成功的几率就可以大大地增大,如果质量非常的差或者效果不太理想,实验就已经开始向失败的方向发展了[21]。

  1.5.2 琼脂糖凝胶电泳技术

  琼脂糖凝胶电泳技术就是一种以琼脂糖凝胶作为支持介质的电泳技术;核酸分子由于处在pH高于其等电点的溶液中,故而带上负电,然后在电场中向正极移动;核酸分子或片段移动的速率不仅与其本身带电量相关外,而且核酸分子的大小和空间构象有关(分子筛效应);综合以上因素,如果核酸分子的质量越大,由于其带电量相差不大,因此其电泳的时候迁移的速率就很慢而落在其他分子量小的后面。

  电泳的时候,为了清晰而准确地了解核酸样品所处的位置,需要Gold View对核酸分子进行染色后才能确定。核酸染料可插入核酸分子的碱基之中形成一种荧光络合物 ,然后用在紫外光照射,可以发出橙黄的荧光来显示出核酸样品所处的位置。

  1.5.3 实时荧光定量PCR技术

  荧光定量PCR技术,顾名思义,就是通过荧光信号来对目标基因进行定量的技术;它是一种重要的实验技术,在实验前加入荧光染料,通过PCR反应额不断进行,被荧光染料染上的基因片段不断增加,可以发现荧光信号不断加强,然后通过其产生的标准曲线来进行分析[22] :其具体的变化过程可参考下图2 [23]:

  图2 实时荧光定量PCR荧光信号的变化曲线

  特点:实时荧光定量PCR具有灵敏,专一以及精确等优点。因此在病原体的测定、肿瘤基因的检测、免疫分析以及基因表达等众多研究领域得到了非常广泛的应用[24]。

  1.5.4 生物信息学分析方法

  生物信息学是一门综合性很强的交叉学科,包括了生物信息的很多方面,它是在使用计算机科学、综合数学以及生物学的各种工具的基础上对大量生物信息学数据进行研究,旨在了解和阐明其中所包含的生物意义[25];它的研究内容之一是序列比对(Alignment),而这同时也构成了它的基础,因此序列比对非常的重要。其中BLAST和FASTA软件就是在两个序列比对的动态规划算法的基础上编写而成的 ,这些软件在需要进行数据库查询和搜索时可以免费下载使用并且发挥重要的作用,为生物学的研究带来了很大的好处[26]。

  1.6 本研究的目的和意义

  鹌鹑是重要的经济动物,它的养殖规模在不断地扩大,也渐渐地得到了越来越多人的关注;同时,鹌鹑还是重要的实验动物,由于其具有生长快,成熟期短,繁殖迅速、敏感性强的特点,可以被当做理想的试验动物。人们通过研究鹌鹑羽色的遗传和变异一方面在探索禽类起源与演化和标记品种具有重要的意义,另一方面在进行鹌鹑育种和生产以及开展实验动物研究等方面也具有非常重要的意义[27]。目前常用的实验动物为朝鲜鹌鹑,其羽色通常分为栗羽、黄羽和白羽三种。本实验的目的是通过对MITF基因在栗羽、黄羽和白羽朝鲜鹌鹑胚胎期皮肤组织中的表达分析,可以进一步明确MITF基因对于畜禽毛色或羽色的影响。

  随着关于MITF基因在栗羽、黄羽和白羽朝鲜鹌鹑胚胎期皮肤组织中表达分析的深入,一方面:对于家禽育种者来说,可以研究和培育出符合消者者爱好的产品,从而在一定程度上更加满足市场的需求,对于养殖业的发展具有重要意义[28];另一方面对于畜禽的遗传资源有非常好的保护作用、对于产品质量的控制等方面也具有重要的意义;同时,MITF可以作为黑素细胞的一种特异性标志,用于恶意黑素瘤的研究[29];最后,由于MITF可以作为色素信号转导过程中的一个信号因子,因此我们可以把它当做一个关键性的靶位,来标记和研究其他相关的基因,为进一步研究动物毛色或者禽类羽色的遗传机制和提高动物的经济性状提供有利参考和依据[30]。

  2 试验材料和方法

  2.1试验材料

  2.1.1试验动物来源

  选择孵化期发育正常的6d、8d、10d、12d、14d的栗羽、黄羽和白羽朝鲜鹌鹑各3只,在无菌条件下分别采集翅组织,作为实验样品。然后,立即放入液氮中保存,试验中所需要的栗羽、黄羽和白羽朝鲜鹌鹑来自于河南科技大学动物科技学院实验牧场。用来分析调控羽色基因在朝鲜鹌鹑胚胎期皮肤组织中的表达情况。

  2.1.2 主要试剂

  本研究用到的主要实验试剂见表1。

  表1主要实验试剂一览表

  实验试剂的名称生产公司或厂家氯仿 天津市德恩化学试剂有限公司异丙醇 天津市德恩化学试剂有限公司无水乙醇 天津市德恩化学试剂有限公司Taq DNA聚合酶  北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司10×PCR Buffer  北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司dNTPs  北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司ddH2O 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司RNase-free ddH2O 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司琼脂糖 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司50×TAE 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司6×loading Buffer 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司DNA Marker  = 3 \* ROMAN III 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司 Gold View北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司SYBR Green I荧光染料 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司cDNA第一链合成试剂盒 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司 TransZol Up 北京全式金生物技术有限公司

  2.1.3 主要仪器和设备

  本研究用到的主要仪器和设备,还有它们的型号,以及生产厂家或地址,可详细地参见下面的表2。

  表2 主要仪器设备一览表

  仪器和设备名称型号生产厂家或地址1200万像素数码照相机AV205三星PCR扩增仪PTC.100TM型BIORAD公司超净工作台SW-CJ-1B苏净集团安泰公司大龙移液器系列1,000 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, 2.5 µL北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司电热恒温鼓风干燥箱DHG-9140上海贺德实验设备有限公司高压蒸汽灭菌锅YXQ-SG48-280S上海博讯实业有限公司恒温恒湿培养箱LRHS-250B上海贺德实验设备有限公司凝胶成像仪WD-9403A北京市六一仪器厂冷藏冷冻冰箱BCD-2691HC河南新飞电器有限公司冷冻高速离心机Hema TGL-16R珠海黑马医学仪器有限公司气浴恒温振荡器ZD-85A江苏金坛白塔新宝仪器厂台式高速离心机Anke TGL-16B上海安亭科学仪器厂微电脑全自动孵化机SWKQ-8D合肥市三巨科技有限公司微波炉WP700乐金电子电器有限公司稳压稳流电泳仪DYY-Ⅲ型北京市六一仪器厂液氮生物容器GPH-0702成都新凤液氮容器有限公司

  2.1.4主要试剂的配制

  本研究用到的主要试剂的配制见表3。

  表3 主要配制的试剂及其用途一览表

  配制的试剂名称 用途配制过程 75%乙醇的配制  提取RNA现用现配,用无水乙醇和RNase-free ddH2O水配制(RNase-free ddH2O:无水乙醇=1:3),混合均匀,-20 ℃保存。引物溶液的配制  PCR先4 ℃点动离心30 s,然后轻轻打开引物管管盖,加入适量的灭菌双蒸水后盖上管盖,充分振荡充分溶解,最后置于-20 ℃保存。  1×TAE电泳液的配制 电泳量取10 mL的50×TAE,用蒸馏水稀释,500 mL容量瓶定容,常温保存。 高锰酸钾消毒液的配制

  消毒称取1.0 g的高锰酸钾,用蒸馏水溶解,500 mL容量瓶定容,常温保存。

  

  2.2 试验方法

  2.2.1 朝鲜鹌鹑种蛋的孵化以及样本的采集

  朝鲜鹌鹑种蛋孵化的孵化质量,是决定实验成功与否的关键所在。因此,我们应该特别注意朝鲜鹌鹑种蛋的挑选,孵化条件等。以便我们可以获得高质量的朝鲜鹌鹑胚胎。为此,我们通过参考相关的文献[31]和结合相应的实际操作,对朝鲜鹌鹑种蛋的孵化总结了以下的步骤:如下面的流程图3所示:

  对朝鲜鹌鹑种蛋进行筛选

  (挑选新鲜,具有质量好特征的种蛋。)

  妥善的保存朝鲜鹌鹑种蛋

  ( 朝鲜鹌鹑的种蛋贮存室应该保持良好的通风 ,室内没有蚊子、苍蝇、老鼠的危害,室内有害气体的含量应该在标准规定以下。)

  彻底消毒朝鲜鹌鹑种蛋

  (本实验使用高锰酸钾消毒,将朝鲜鹌鹑种蛋放入事先经高锰酸钾熏蒸消毒处理过的孵化器)

  孵化温度要适宜

  (孵化温度应该严格要求相对稳定在37.8—39℃。)

  控制孵化的湿度

  (由于本实验需要的是朝鲜鹌鹑的胚胎。不必将其孵化出蛋壳,故只需将相对湿度设定为:孵化的前期相对湿度为60%,孵化的中后期相对湿度为50%。)

  6.及时的通风换气

  (本实验分别于孵化的第6天、第8天、第10天、第12天和第14天采样)

  定时翻转蛋盘

  8.熟练进行验蛋

  图3 鹌鹑鹅孵化过程

  最后,于孵化的第6 天开始对栗羽的、黄羽的和白羽的朝鲜鹌鹑的种蛋进行采样,并且编号标记,随后每两天采样一次,直到14天结束。为了充足的准备后续的实验,编号标记如下表4所示:

  表4 样本编号顺序及意义

  羽色6 d8 d10 d12 d14 d栗羽朝鲜鹌鹑L1,L2,L3L4,L5,L6L7,L8,L9L10,L11,L12L13,L14,L15黄羽朝鲜鹌鹑H1,H2,H3H4,H5,H6H7,H8,H9H10,H11,H12H13,H14,H15白羽朝鲜鹌鹑B1,B2,B3B4,B5,B6B7,B8,B9B10,B11,B12B13,B14,B15

  2.2.2 朝鲜鹌鹑胚胎期皮肤组织总RNA的提取

  使用TransZol Up试剂盒分别提取栗羽、黄羽和白羽朝鲜鹌鹑胚胎期皮肤组织的总RNA。根据试剂盒说明书的说明,提取的步骤如下面流程图4所示:

  第一步:组织样品的采集。在无菌的条件下,分别打开不同孵化天数的鹌鹑蛋,取出胚胎置于锡箔纸上,用灭菌的剪刀剪取背部组织分别置于1.5 mL RNase-free EP管中,快速放入液氮进行保存;

  第二步:从液氮容器中取出组织样品,放入盛有液氮的研钵内,加入1 mL TransZol Up,充分研磨成粉末状,用金属药勺将充分研磨的组织转入1.5 mL RNase-free EP管中,再向EP管中加入1 mL的TransZol Up。颠倒混匀,室温下静置作用5 min;

  第三步:向EP管中加入200 µL氯仿,剧烈振荡30 s,室温孵育3 min;

  第四步:10,000 g 4 ℃离心5 min,此时溶液分为水相(上层)、中间层和粉红色有机层(下层)RNA分布在上层水相中;

  第五步:小心吸取上层水相转移至新的1.5 mL RNase-free EP管中, 加入650 µL异丙醇,颠倒混匀,室温孵育10 min;

  第六步:10,000 g 4 ℃离心10 min,弃上清;

  第七步:加入1 mL 75%乙醇(DEPC处理的水配制),用力摇晃EP管,使溶液充分混匀;

  第八步: 10,000 g 4 ℃离心5 min,弃上清,室温静置5~10 min,加入50 µL RNA溶解液溶解沉淀;

  第九步:RNA的保存。将获得的RNA立刻保存于液氮中,或立即用于反转录。

  图4 鹌鹑背部皮肤组织总RNA的提取过程

  2.2.3 试验引物的设计与合成

  通过GenBank查询得到已报道的日本鹌鹑MITF基因序列,使用Primer 5.0软件设计引物,然后送去由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成。引物信息见下表5:

  表5 试验引物信息表

  引物

  名称引物序列(5′~3′)退火温度(℃)PCR产物长度(bp)用途MF3AAATGACCCGGATATGCG 5099荧光定量AGTTCCTTGGTGCGTTGC ACTTGACCTGACGGACTACCTC5294内参基因CTCCTTGATGTCACGCAC

  2.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测核酸样品

  表6 RNA质量的检测过程

  实验步骤实验操作

  首先:制胶

  用电子称称取1.2 g琼脂糖粉,放入锥形瓶内,加入100 mL 1×TAE电泳缓冲液,放在火炉中加热3 min至溶液均匀透明,置于石棉网上冷却至不烫手时,加入4 µL Gold View核酸染料,混合均。

  将琼脂糖溶胶倒入洁净的制胶器中;

  待胶完全凝固后,将胶板移走,同时,将做好的胶放进已经加满1×TAE电泳缓冲液的槽内,没有样孔的一端放到正极附近。

  

  其次:加样

  取5 µL待检测核酸样品加入1 µL 固定的Buffer,充分混合;

  将样品与Marker分别加到样孔中,每孔的量控制在4µL-6µL。

  

  然后:电泳

  将检查无误的仪器电压调到100V(5 V/cm),开关打开,开始电泳,期间每隔几分钟,观察蓝色条带的移动情况,直到条带清晰可辨为止。

  最后:拍照

  然后,把仪器开关关掉;

  观察凝胶中条带的数目、亮度以及是否存在拖尾现象等以确定核酸样品的质量,质量合格可以应用于下一步的试验,质量不合格需要重新提取或扩增。

  

  2.2.5 cDNA第一链的合成

  通过使用北京鼎国昌盛生物技术有限公司生产的cDNA第一链合成试剂盒将朝鲜鹌鹑胚胎期皮肤组织的总RNA合成出cDNA第一链。

  RT-PCR的反应体系:在RNase-free的0.2 mL无菌 EP管中依次加入以下表6中物质:

  表6 cDNA第一链合成的反应体系

  实验试剂体积(µL) 总RNA

  2 µL Random primer1 µL dNTPs1 µL

  5×First-stand Synthesis Buffer 4 µLSuper M-MLV Reverse transcriptase RNase H-  0.5 µL

  RNa inhibitor2 µLRNa-free ddH2O 9.5 µL

  

  然后经历短暂的离心,混匀反应体系中的组分。反应的程序如下表7所示:

  表7 cDNA第一链合成的PCR反应

  反应步骤反应温度反应时间第一步42 ℃60 min

  第二步95 ℃5 min第三步4 ℃1 min

  2.2.6 实时荧光定量PCR技术

  使用反转录合成的cDNA第一链,进行qRT-PCR;其中使用的内参基因为ACT,其反应体系为: 总体积 20µL

  cDNA第一链 1.0 µL

  10×PCR Buffer 2.0 µL

  dNTPs 0.8 µL

  上游引物 0.7 µL

  下游引物 0.7 µL

  Taq DNA聚合酶 0.2 µL

  ddH2O 14 µL

  SYBR Green I 0.7 µL

  PCR程序:

  94 ℃ 4 min

  0 ×

  94 ℃ 30 s

  退火 30 s 40 ×

  72 ℃ 30 s

  72 ℃ 10 min

  其中退火温度根据所用引物的Tm值来设定。

  2.2.7 数据分析

  在朝鲜鹌鹑胚胎期皮肤组织中, MITF基因相对表达量的分析,在这里,引用2- ∆ ∆CT法,以ACT基因作为内参基因进行标准化。然后,在不同发育时期朝鲜鹌鹑背部基因表达量的显著性检验,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。同时,采用Duncan法对基因的相对表达量进行多重比较[32]。

  3 结果与分析

  3.1 朝鲜鹌鹑胚胎期皮肤组织总RNA的检测

  从朝鲜鹌鹑胚胎期皮肤组织中提取所需的总RNA,然后用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测,检测的结果如图3所示,样本电泳条带清晰,28S和18S两条带清晰可见,而5S条带相对的比较模糊,这说明所提取的总RNA质量较好,达到合格的标准,可以放心进行下一步的试验。

  图3 鹌鹑皮肤组织总RNA检测电泳图

  3.2 基因表达的检测与分析

  从下图5中可以得出以下结论: MITF基因在朝鲜鹌鹑栗羽中的相对表达量,在不同的天数时基因的相对表达量存在差异,没有相对表达量相同的天数;其中,MITF基因在第12d的相对表达量,同第4d、6d、8d、10d和14d的相对表达量相比,差异显著(P<0.05); MITF基因在第10天的相对表达量,同第4d、6d、8d、14d的相对表达量相比,差异显著(P<0.05);同时,MITF基因在第4d、6d、8d和14d的相对表达量之间相互比较,差异不显著(P>0.05)。

  注:不同字母表示差异显著(P<0.05)

  图5 MITF基因在朝鲜鹌鹑栗羽皮肤组织中的表达变化

  从下图6中可以得出以下结论: MITF基因在朝鲜鹌鹑黄羽中的相对表达量,在不同的天数时基因的相对表达量存在差异,没有相对表达量相同的天数;其中,MITF基因在第12d的相对表达量,同第4d、6d、8d、10d和14d的相对表达量相比,差异显著(P<0.05); MITF基因在第14天的相对表达量,同第4d、6d、8d、10d和12d的相对表达量相比,差异显著(P<0.05);MITF基因在第10天的相对表达量,同第4d、8d、12d和14d的相对表达量相比,差异显著(P<0.05);MITF基因在第4d、8d的相对表达量,同第10d、12d和14d的MITF基因的相对表达量相比,差异显著(P<0.05);MITF基因在第6天的相对表达量,同第12d和14d的相对表达量相比,差异显著(P<0.05);同时,MITF基因在第6天的相对表达量,同第4d、8d和10d的相对表达量相比,差异不显著(P>0.05)。

  注:不同字母表示差异显著(P<0.05)

  图6 MITF基因在朝鲜鹌鹑黄羽皮肤组织中的表达变化

  从下图7中可以得出以下结论: MITF基因在朝鲜鹌鹑白羽中的相对表达量,在不同的天数时基因的相对表达量存在差异,没有相对表达量相同的天数;其中,MITF基因在第8d的相对表达量,同第12d和14d的MITF基因的相对表达量相比,差异显著(P<0.05);MITF基因在第8天的相对表达量,同第6d和10d的相对表达量相比,差异不显著(P>0.05);同时,MITF基因在第12d和14d的相对表达量同第8d的相对表达量相比较,差异显著(P<0.05);MITF基因在第12d和14d的相对表达量同第6d和10d的相对表达量相比较,差异不显著(P>0.05);而MITF基因在第6d和10d的相对表达量同第8d、12d和14d的MITF基因的相对表达量比较,差异不显著(P>0.05)。

  注:不同字母表示差异显著(P<0.05)

  图7 MITF基因在朝鲜鹌鹑白羽皮肤组织中的表达变化

  4 讨论

  4.1 鹌鹑孵化技术及样本采集对实验影响的讨论

  在本实验中,鹌鹑孵化技术是一项非常重要的技术手段,为了保证实验材料的可靠性和高质量,必须保证实验动物即朝鲜鹌鹑的正常孵化。但是,鹌鹑蛋的孵化还是会受到了多种不利因素的影响:例如,适宜的孵化条件,对鹌鹑胚胎期各个组织的正常发育是至关重要的,而不适宜或者不稳定的孵化条件对于鹌鹑胚胎期的组织发育有着重要的不利影响;同时,如果对孵化器进行的消毒不够彻底,也可能会导致鹌鹑蛋受到污染而无法正常的进行胚胎发育;综上所述,不管是孵化条件的不稳定,还是外界污染等因素,都会对实验结果的准确性和精确性产生不可逆的影响, 对实验的可参考性也都有着重要的不利影响,最终导致实验误差的产生。

  在本实验中,采用的是微电脑全自动孵化机,利用智能操控,通过设定温度、湿度、时间等变量,来调控孵化环境的温度变化、湿度变化等因素;鹌鹑蛋在这种全自动的孵化条件下,一方面可以避免人工的直接控制导致孵化条件改变而引起的偶然误差,另一方面,通过这种自动化的孵化过程,降低了孵化过程中不稳定的外界环境因素的影响,可以将实验结果的准确性提高。但是,微电脑全自动孵化机并不是可以解决所有的问题,这个装置的本身也有一些固有的问题,而这些问题可能会产生无法避免地系统误差:例如,这个微电脑全自动孵化机装置不能自动加水,一旦装置里的水被消耗殆尽,孵化环境势必会发生改变,装置内空气的湿度会大幅度下降,而鹌鹑的孵化条件中对湿度有着严格的要求,这样一来,胚胎组织的正常发育会受到不利的影响;此外该孵化装置必须插上电源才能正常使用,不带有蓄电池,一旦发生停电这种情况势必会造成装置的运行中断,从而造成试验样品的浪费,不但浪费了实验经费,还浪费了大量的人力和物力。这些情况都会在一定程度上对实验结果产生不利的影响,造成实验的系统误差。

  在组织样本的采取过程中,选取的组织部位是否具有代表性,对实验的结果的好坏也有非常大的影响[33]。本次实验中,并没有将整个鹌鹑胚胎作为实验样本,而是统一采集鹌鹑胚胎的背部皮肤组织作为实验样本,其原因如下:其一,统一采集背部皮肤组织,是避免在采样的过程中因采样部位不同而引起的实验误差,这样可以降低实验中的偶然误差;其二,将背部皮肤组织作为实验样本,是因为在胚胎期的发育过程中,背部组织的毛囊发育相比于其它组织发育的更早,更完整,代表性更强。这样更加符合本实验的目的:研究MITF基因在不同羽色朝鲜鹌鹑胚胎期皮肤组织中的表达情况。

  4.2 RNA提取过程及提取质量对实验结果影响的讨论

  朝鲜鹌鹑胚胎期背部皮肤采集完毕后,出于对实验样本质量的保护,一般都会先提出实验样本的RNA,然后反转录合成cDNA;一方面反转录合成的cDNA可以长期在液氮中,而组织样本不可以在液氮中保存,因此它可以延长实验样本的使用期限,另一方面组织样本很容易受到外来污染,且其中RNA很难保存,而反转录合成的cDNA稳定性比较好,正好可以解决这个问题。

  在本实验提取鹌鹑总RNA的时候,首先将提取过程对实验结果的影响进行讨论。在RNA提取的时候,第一步就是从液氮中拿出组织样本,然后充分地研磨,但是常常因为实验的经验不足,实际操作能力不行,造成组织样本没有得到充分的研磨或者因发力不均而造成研磨的不是特别均匀,这些因素都会对降低提取的RNA的质量和纯度,对其产生不利的影响;同时,由于组织样本大小各有差异,在组织样品研磨的过程中,存在损失;此外,在离心,取上清,弃上清,添加试剂等方面都存在着一定的差异,这些因素都会对RNA提取结果造成影响,进而影响实验的最终结果。

  其次,将展开总RNA的质量对于结果的影响的讨论。本实验的核心技术之一就是动物组织总RNA的提取技术,并且相对应的琼脂糖凝胶电泳技术就是为了用来鉴定RNA的质量,以确保后续试验的成功进行;RNA质量的好坏是关乎实验成败的一个决定性因素,后面的反转录合成RNA以及进行实时荧光定量PCR都是在RNA的基础上展开的,如果RNA的质量有问题,将会导致非常大的实验误差,降低实验成功的可能性[34]。

  4.3 MITF基因表达检测结果的讨论

  对于实验数据的分析和处理有非常多的方法,本实验通过采用2- ∆ ∆CT法,将内参基因ACT作为一个参考标准,对实验数据进行标准化处理,随后对处理的数据进行单因素方差分析;其中,在单因素方差分析中,不管是“差异极显著”还是“差异显著”都不能认为其绝对有价值,也不能片面的理解相差很大,它们的意义只是一个概率事件,但其概率永远在0和1之间,不能真的为0或者1;“差异显著”是表面上有如此大的差异的可能性小于0.05,而“差异极显著”是表面上有如此大的差异的可能性小于0.01,它们均来自于同一总体,而且已经达到了它们所在的总体平均数不相同的显著水平[35];同时应该注意的是,对于有些实验,虽然它们的结果数据有差异,但是并不能得到差异显著水平的结论,这是由于实验过程中存在较大误差造成的,因此应该客观地对数据进行分析,从多种因素更全面地对结果进行讨论。

  在本实验中,MITF基因在栗羽、黄羽和白羽朝鲜鹌鹑中的相对表达量,在不同的天数相对表达量不一样,且变化的区别也较大;其中,MITF基因在朝鲜鹌鹑白羽中的相对表达量,与朝鲜鹌鹑栗羽、黄羽相比,相对表达量多;再分别观察栗羽、黄羽和白羽朝鲜鹌鹑在不同天数的相对表达量,第12d的栗羽相对表达量与其它天的相对表达量有区别;第12d、14d的黄羽相对表达量与其它天的相对表达量有区别;白羽的第8天同12d、14d相对表达量有区别。

  5 结论

  本实验成功的从孵化的鹌鹑蛋中采集了栗羽、黄羽和白羽朝鲜鹌鹑的胚胎期背部皮肤组织作为样本,并成功的提取出了总RNA。

  在本实验中,通过利用MF3S和 MF3AS引物,通过实时荧光定量,成功测到目标片段。

  (3)通过实时荧光定量测得的数据,运用统计学知识进行数据分析,得到MITF基因分别在朝鲜鹌鹑栗羽、黄羽和白羽胚胎期皮肤组织的相对表达情况。同时,通过对比还可以得出,在相同的孵化天数,不同羽色的朝鲜鹌鹑之间的相对表达量不同;在同一种羽色的朝鲜鹌鹑之间,不同天数的相对表达量也不一样。另外,MITF基因在第12天的时候相对表达量最高,而且在白羽朝鲜鹌鹑中的相对表达量出现下调。

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