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动物科学类论文 牛精子获能液中添加乳链球菌素的抑菌效果研究

2018-12-06 14:08:00来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘 要

  精子在受精前必须要进行获能处理,使其在形态和生理上发生某些变化,精子机能进一步成熟之后才具备受精能力。随着体外受精技术的发展,牛精子获能处理的技术已趋于成熟。但是在体外存在着高污染因素,因此在精子获能液中必须添加抑菌剂。至今为止,抗生素作为抑菌剂被广泛使用,然而抗生素的滥用已成为当今社会的一大难题,产生诸多的副作用,危害人畜健康。而乳酸链球菌素(Nisin)是一种高效、无毒、安全、无副作用的天然抑菌剂,已被广泛的应用于食品防腐剂领域。鉴于抗生素的副作用危害,本课题旨在研究乳酸链球菌素在牛精子获能液中的抑菌效果。以牛细管冻精为试验材料,在受精液中添加不同浓度的乳酸链球菌素进行获能处理,即阳性对照组(青霉素30 µg/mL,链霉素15 µg/mL)、阴性对照组(未添加任何抑菌剂)、试验组1(Nisin 5 µg/mL)、试验组2(Nisin 25 µg/mL)、试验组3(Nisin 50 µg/mL)、试验组4(Nisin 100 µg/mL)。统计细菌菌落数分布,并进行精液品质检测。结果表明:在精液品质方面,添加25 µg/mL Nisin 和添加50 µg/mL Nisin 的试验组与阳性对照组(青霉素30 µg/mL,链霉素15 µg/mL)无明显差异(P>0.05);且添加25 µg/mL Nisin 在获能液中经获能处理后其精子活力(0.62 vs 0.38, 0.42,0.40; P<0.05)、质膜完整率(44.15 % vs 34.04 %, 35.33 %, 32.50 %; P<0.05 )、顶体完整率(86.58 % vs 75.37 %, 82.16 %, 80.76%; P<0.05)和线粒体活性百分率(44.85 % vs 35.33 %, 36.83 %, 35.13 %; P<0.05)显著高于阴性对照组(未添加任何抑菌剂)、添加5 µg/mL Nisin和添加100 µg/mL Nisin的试验组。在抑菌效果方面,添加25 µg/mL Nisin、添加 50 µg/mL Nisin和添加100 µg/mL Nisin的试验组抑菌性基本一致,且均优于阳性对照组(青霉素30 µg/mL,链霉素15 µg/mL);另外,包括阳性对照组的各组抑菌效果均明显高于阴性对照组(未添加任何抑菌剂)。由此说明,当乳酸链球菌素在受精液中的添加量达到25 µg/mL时,就可以产生良好的抑菌效果,并且保证较好的精液品质。

  关键词:牛精子,获能,乳酸链球菌素,抑菌效果

  1 前言

  自1951年,张明觉发现精子获能现象以来,精子获能处理的研究便迅速开展起来,到目前为止,已趋于成熟。由于精子获能过程中对外界环境的要求,一般会在精子获能液中添加抗生素,以维持其要求的无菌环境。尽管抗生素的应用在某些方面极大的促进了养殖业的发展,但是抗生素的长期滥用也导致了有害菌种耐药性的产生,进而对人类的身体健康产生危害。本文旨在研究,用高效、无毒、安全、营养的天然食品防腐剂——乳酸链球菌素(Nisin)代替抗生素,达到精子获能要求的抑菌效果。

  1.1 国内外研究概况

  1.1.1 乳酸链球菌素的理化特性和抑菌机理

  乳酸链球菌素(Nisin)是一种被广泛应用于食品工业的生物防腐剂。1928年,Rogers和Whittier发现Nisin能够抑制某些革兰氏阳性菌。1944年,Mattick和Hirsch首次发现并命名了Ninhibitory Substance,简称为Nisin。1951年,Hirsh 将乳酸链球菌素以防腐剂的形式首次应用于食品生产中,获得了成功;之后乳酸链球菌素便作为生物防腐剂很快应用于食品工业中。

  乳酸链球菌素是灰白色略带黄色的固体粉末,在不同pH下其溶解度不相同,碱性条件下几乎不能溶解。Nisin具有很好的耐酸耐热性质,其毒理学及病理研究都表明Nisin是安全无毒的。Nisin通常以Nisin A和Nisin Z两种形式存在于天然状态下,Nisin Z的抑菌能力比较强。根据乳酸链球菌素的抑菌图谱可知其只对革兰氏阳性菌起作用,但有许多研究已经证明,乳酸链球菌素在比如加热,冷冻,降低PH值等一些条件下也会对一部分的革兰氏阴性菌有抑制作用。

  关于乳酸链球菌素的作用机理,ENGELKEG等提出了“孔道形成(Pore Formation)”理论。研究表明,乳酸链球菌素通过侵入质膜内形成通透孔道和抑制肽聚糖合成的方式发挥抑菌效果。此外,乳酸链球菌素能够通过诱导细胞自溶,抑制细菌孢子的生长。

  1.1.2 乳酸链球菌素安全性及在食品中的应用

  FAO/WHO食品添加剂联合国专家委员会,在1969年将乳酸链球菌素确定为食品防腐剂。中国卫生部,也在1992年明确指出:“可以科学的认为乳酸链球菌素作为食品保藏剂是安全的”。至上世纪90年代,已经有50多个国家和地区批准乳酸链球菌素作为一种天然食品防腐剂。

  在对乳酸链球菌素的安全性问题进行探究之后发现,蛋白水解酶能够水解乳酸链球菌素,而蛋白水解酶广泛分布于自然界中,尤其在动物的消化道及细胞溶酶体内含量丰富,换言之在食用过含乳酸链球菌素的食品后,它在消化道中可很快被蛋白水解酶水解成为许多可被人体吸收利用的小分子物质——氨基酸,深入研究后发现,乳酸链球菌素被摄入人体10 min后,在唾液中即检测不到其活性,因此不会残留在体内,更加不会改变肠道中的正常菌群,是一种安全的防腐剂。

  乳酸链球菌素在乳制品中的应用非常广泛,经过巴氏消毒的鲜奶中往往还残留一些耐热性芽孢,适宜条件下,仍会引起食品的变质。而乳酸链球菌素能抑制嗜热耐热细菌和芽孢的生长及繁殖,使鲜奶在贮藏中的细菌总数增加缓慢,使得添加乳酸链球菌素的鲜奶的pH下降更加缓慢,延长牛奶的保质期。在鲜奶中添加乳酸链球菌素能够降低杀菌温度,从而保留更多营养成分。乳酸链球菌素最早用于干酪的防腐,这种应用一直延续至今,Taraka等就在2001年通过试验证明了,加入一定量的乳酸链球菌素在经过巴氏消毒的干酪中,不仅可以减少食盐和磷酸盐的添加,更重要的是可以抑制一些芽孢及其毒素的产生。

  乳酸链球菌素用于肉类制品中,能够通过减少发色剂(即硝酸盐和亚硝酸盐)的添加量,从而有效抑制肉毒梭状芽孢毒素的形成,增加对肉的防腐效果,并且对肉制品的色泽无影响。1991年,Rayman等试验证明,在烟熏火腿的生产过程中添加适量的乳酸链球菌素可以减少亚硝酸盐的添加量,使产品货架期延长,而且对其颜色、气味、味道均无明显的影响。乳酸链球菌素还可以应用于鲜肉、冷藏肉以及海鲜制品等多种肉制品的保藏。

  大量研究表明,在果汁类饮料中添加乳酸链球菌素,不仅可以降低其巴氏杀菌的加热温度,还可以有效防止果汁饮料的酸败。这是因为在果园的土壤中存在大量酸土芽孢杆菌,这些很容易被带入果汁中造成果汁的变质,而乳酸链球菌素主要抑制革兰氏阳性菌,其中的产芽孢菌对乳酸链球菌及其敏感。另外,由于乳酸链球菌素不抑制酵母菌,而对乳酸菌的生长有很强的抑制作用,因此可以将其应用于啤酒等含酒精饮料的酿造中。

  1.1.3 乳酸链球菌素的应用前景

  随着研究的深入,乳酸链球菌素的应用范围也在不断扩展,例如造纸业、食品的活性包装、食品洗涤、免疫学、医学移植等,在农业方面的应用仅仅局限于饲料添加。由于反刍动物的瘤胃在消化过程中会产生较高水平的甲烷,因此一般在饲料生产中会添加一定量的亚硝酸盐,以降低瘤胃中甲烷的产生。但是,亚硝酸盐在动物体内累积会影响机体的新陈代谢。研究表明,在饲料生产过程中添加适量乳酸链球菌素能够有效降低亚硝酸盐的添加量,同时维持较低的甲烷产生量。虽然乳酸链球菌素在消化道中能很快被水解,但是其存在于瘤胃中抑制产烷微生物发酵时,会保持较长时间的活性,不会很快被水解。

  尽管乳酸链球菌素的应用很广泛,但是在畜牧业生产中的应用在国内外均仍为空白。

  在体外受精技术的过程中由于长期使用抗生素,使得细菌耐药菌株增多,传递速度加快,耐药性增强,抗生素的疗效降低,疗程延长,用量逐渐增加。如今某些细菌性疾病已经成为一些动物的主要传染病,有些动物还会出现多重耐药性病菌,直接影响畜禽健康和畜产品安全。同时,由于畜产品内产生药物残留,食用药物残留的畜产品,会使人类产生过敏反应、慢性中毒等危害。如何控制或减少抗生素滥用的危害已经成为畜牧业研究中的一大热点。寻求一种天然、无害的抑菌剂来替代抗生素以期达到良好的抑菌效果成为当下的研究热点。根据生物制剂的研究现状,作为天然食品防腐剂的乳酸链球菌素,不论从其理化性质还是生产实践方面均可被考虑替代抗生素,在精子获能液中作为抑菌剂,发挥其生物学效应。

  1.2 本试验研究的目的和意义

  受精前精子必须要经过获能过程,使精子在形态和生理上发生某些变化,机能进一步成熟,才具备受精能力。随着精子体外获能技术的不断发展,体外受精技术已经获得了广泛的成功。由于体外环境的污染程度高,作为抑菌剂,在获能体系中添加抗生素对体外受精技术成熟有重要作用。然而时至今日,抗生素滥用却成为当下一大难题,引起的副作用已然不容忽视。而乳酸链球菌素(Nisin)作为一种无副作用、绿色、高效、安全、无毒的天然抑菌剂,已被广泛的应用于食品防腐剂领域。乳链球菌素属多肽类,由乳酸链球菌(Streptococcus lactis)的发酵产物中提取。乳酸链球菌生产菌株无毒,能抑制各种革兰氏阳性菌及其芽孢。研究表明,Nisin对革兰氏阳性菌营养细胞的作用是引起细胞损伤,造成重要细胞内溶物渗出,甚至导致细胞溶解。同时,Nisin通过在芽孢萌发前及其膨胀期破坏芽孢膜,可以抑制芽孢的发芽过程。

  而目前为止,在牛精子获能液中添加的均为抗生素,长期使用抗生素不但使抗生素的疗效降低,用量逐渐增加,疗程延长,而且会有药物残留,产生耐药菌株,从而危害人畜健康。

  目前,添加乳酸链球菌素在牛精子获能液中对抑菌效果的影响还未报道,为此本试验将探讨在牛精子获能液中添加不同浓度乳酸链球菌素的抑菌效果以及最适浓度,从而减少抗生素在试验、生产范围的应用,对畜禽和环境产生无害影响。

  2 材料与方法

  2.1 试验材料

  2.1.1 牛细管冻精的来源

  本试验所用牛细管冻精均来源于洛阳市白马寺种公牛站

  2.1.2 仪器

  超净工作台 型号:SW-CJ-2D,苏州净化

  电热恒温鼓风干燥箱 型号:101-2-BS 上海跃进医疗器械厂

  二氧化碳培养箱 型号:Forma3110 购自美国

  电子天平 型号:EL104 梅特勒-托利多仪器有限公司

  倒置显微镜 型号:NIKON2000-U 购自日本

  冰箱 型号:BCD-212TD 海信(北京)电器

  Sigma离心机

  2.1.3 试剂

  乳酸链球菌素(Nisin)(Sigma N5764),考马斯亮蓝G-250(BLOSHARP),4%多聚甲醛(SOLARBIO),线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1试剂盒)(碧云天),

  胎牛血清FSC(四季青生物工程有限公司)其他试剂除特别注明外均购自Sigma Chemical Co。

  2.1.4 溶液配制

  表1 磷酸缓冲溶液(DPBS)配制

  试剂规格 NaCl0.8 g KCl 0.02 g Na2HPO4 0.115 g KH2PO4 0.02 g 葡萄糖0.1 g 丙酮酸钠 0.0036 g 蒸馏水 100 mL注:配制后调整PH至7.2~7.4并用0.22 µm滤器过滤,保存于4℃下,限两周内使用。

  表2 低渗液配制

  试剂规格柠檬酸钠0.735 g 果糖1.35 g 三蒸水 100 mL

  注:配制后调整PH至7.2~7.4并用0.22 µm滤器过滤,存与4℃下,限两周内使用。

  表3 磷酸缓冲溶液(PBS)配制

  试剂规格 NaCl8 g KCl 0.2 g Na2HPO4 3.63 g KH2PO4 0.24 g 蒸馏水 900 mL

  表4 考马斯亮蓝G-250的配制

  试剂规格 考马斯亮蓝G-250 100 mg 95%乙醇 50 mL 85%磷酸 100 mL

  表5 LB培养基配制

  试剂规格胰蛋白胨1 g 酵母浸粉0.5 g NaCl1 g 琼脂粉1.8 g蒸馏水100 mL

  2.2 试验方法

  2.2.1 牛细管冻精解冻

  将牛的细管冻精从液氮罐中取出,并立即置于38 ℃水浴锅中解冻约10 s,用润湿酒精的纸巾擦拭细管冻精,而后剪开细管冻精将精液置于EP管中,备用。

  2.2.2 牛精子获能处理

  采用上游法处理精子,首先取12支尖底离心管分为两组,其中每组6支,试管编号:1、阴性对照组(未添加任何抑菌剂);2、阳性对照组(青霉素30 µg/mL,链霉素15 µg/mL);3、试验组1(Nisin 5 µg/mL);4、试验组2(Nisin 25 µg/mL);5、试验组3(Nisin 50 µg/mL);6、试验组4(Nisin 100 µg/mL)。向12支尖底试管中分别加入2 mL含不同浓度Nisin和阴、阳性对照组的受精液,再将这12支试管分别放入培养条件为38.5 ℃,5 % CO2,100 %饱和湿度的CO2培养箱中平衡2 h,之后用移液枪将解冻后精液缓缓地加入试管底部,每支试管底部分别加入一支细管冻精,最后将试管置于CO2培养箱(温度38.5 ℃,5 % CO2,100 %饱和湿度)中上游处理45 min。

  2.2.3 精液处理

  将经过获能处理的各组试管取出,分两部分进行操作处理。

  一部分利用LB培养基涂板法检测Nisin的抑菌效果。具体操作步骤为:每支试管取出约1500 µL的上清液,置于灭过菌的EP管中,编号为:1上,2上,3上,4上,5上,6上;另将离心管尖底底部的卵黄、死精子等溶液也全部取出,置于灭过菌的另外6个EP管中,编号为:1下,2下,3下,4下,5下,6下。将这12个装有液体的EP管均用Sigma离心机8000 rpm离心5 min,之后去除上清液,留下约100 µL的液体混匀,涂板待用。

  另一部分用来检测精液品质参数且进行革兰氏染色初步观察Nisin的抑菌性。具体操作步骤为:每支试管取出约1500 µL的上清液,置于已灭菌的10 mL离心管中,1500 rpm离心5 min,取1000 µL上清液后,留下约500 µL活精子滴,随后进行精液品质相关参数的评定。另外,取出的上清液置于灭过菌的EP管中,用Sigma离心机8000 rpm离心3 min,去除悬液,留下约80 µL液体,混匀后取约10 µL滴于洁净载玻片上,并用枪头小范围画圈,涂匀后进行革兰氏染色。

  2.2.4 LB培养基涂板

  首先配制400 mL的LB培养基,分装在两个锥形瓶中,进行高压高温灭菌处理后在65 ℃烘箱中放置约3h,取出培养基使其温度下降到约50 ℃后,每200 mL培养基中加入4 mL的灭活后牛血清(灭活血清提前经过37 ℃培养箱预热处理),轻轻混匀后倒板,注意不要产生气泡,约30~45 min后待培养基凝固即可进行涂板。分别将经过处理的编号为:1上,2上,3上,4上,5上,6上以及1下,2下,3下,4下,5下,6下的12个EP管中的约100 µL液体全部取出,分别进行涂板。另外再解冻一支细管冻精直接进行涂板操作,编号为7,涂板后,将所有培养皿置于37 ℃培养箱中培养35h,取出后进行拍照及菌落数统计。除编号为7的培养皿中的菌落数可直接统计为一支冻精的菌落数,其余各组按照编号为n上和n下的两个培养皿中的菌落数之和作为编号n的试验组中的菌落数进行统计,并记录。菌落在培养皿中的分布如图1。

  图1 LB培养基涂板培养菌落图

  2.2.5 精液品质检测

  2.2.5.1 活力评定

  精子活力是指在显微镜下作直线前进运动的精子占总精子数的百分率。本试验采用目测法在100倍镜下进行评估。用移液枪吸取约10~15 µL精子悬液滴置于洁净载玻片上,在显微镜下进行评定。评定精子活力的等级,一般采用0~1.0的十级评分制,即所观察到的精子100%呈直线前进运动的评为1.0分,90%的评为0.9分,以此类推。

  2.2.5.2 质膜完整性检测

  本实验以低渗肿胀法进行精子质膜完整性检测,方法参照李晓霞,孵育结束后取出10 µL滴片,置于400倍相差显微镜下观察统计,若精子尾部没有形成圆环则为质膜损伤的精子,若精子尾部形成圆环则为质膜完整的精子(如图2),每次至少统计200条精子。

  图2 牛精子质膜完整性检测

  注:红色箭头表示质膜完整的精子,黄色箭头表示质膜不完整的精子

  2.2.5.3 顶体完整性检测

  本实验以考马斯亮蓝G-250染色法检测精子顶体完整性,具体操作参照李晓霞,染色完毕后的载玻片缓慢冲洗去染液,自然干燥后在1000倍油镜下观察并统计顶体完整率。若精子顶体区不着色或者着色较浅则为顶体破损的精子,若精子顶体区为蓝色并且顶体边缘光滑为顶体完整的精子(如图3),每次至少统计200条精子。

  图3 牛精子顶体完整性检测

  注:红色箭头表示顶体完整的精子,黄色箭头表示顶体不完整的精子

  2.2.5.4 线粒体活性检测

  本试验利用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1试剂盒)检测精子的线粒体膜电位。具体操作参照李晓霞,将染色后的精液,涂片后置于荧光显微镜(10×40)的蓝光下观察不同颜色状态的精子。在精子尾部中段有桔红色或黄绿色荧光的为高膜电位(HMMP)精子,即线粒体有活性的精子;在镜子尾部中段呈绿色荧光的为低膜电位(LMMP)精子,即线粒体无活性的精子(如图4),每次至少统计200条精子。

  图4 牛精子线粒体活性检测

  注:红色箭头表示线粒体有活性的精子,黄色箭头表示线粒体无活性的精子

  2.2.6 革兰氏染色技术

  乳酸链球菌素主要抑制革兰氏阳性菌。各处理组精子在经过获能处理后均取1µl进行革兰氏染色,将各试验组染色后的细菌菌落分布情况与对照组进行对比,筛选出最适浓度的Nisin。

  所述其具体步骤操作如下:

  A制片:取15 µL 重悬液滴于载玻片上,用枪头小范围画圈涂匀后在酒精灯火焰上干燥、固定。

  B初染:滴加草酸钠结晶紫染色液数滴将涂片部位覆盖,染色约1min后用蒸馏水冲洗。

  C媒染:用碘液冲去玻片上残留的水分并使其覆盖菌痕,处理约1min,蒸馏水冲洗。

  D脱色:吸干玻片上的残水,将玻片倾斜,用滴管缓慢滴加95%的乙醇进行脱色,使在白色背景下紫色完全消失,用蒸馏水冲洗。脱色时间约20~30s。

  E复染:用沙黄染液对脱色的部位进行复染约2min,蒸馏水冲洗。

  F镜检:酒精灯上干燥玻片后,置于显微镜观察。染色结果蓝紫色的为革兰氏阳性菌,粉红色的为革兰氏阴性菌。

  2.3 试验设计

  试验设两个处理组,每个处理组均设有4个试验组和2个对照组,其不同在于受精液中抑菌剂种类或浓度的不同,具体分为:阳性对照组(青霉素30 µg/mL,链霉素15 µg/mL)、阴性对照组(未添加任何抑菌剂)、试验组1(Nisin 5 µg/mL)、试验组2(Nisin 25 µg/mL)、试验组3(Nisin 50 µg/mL)、试验组4(Nisin 100 µg/mL)。各组精子上游法获能后分别进行以下相应的处理。

  (1)第一处理组的各离心管内的液体分为两部分(含大量活精子的上清液;含有弱、死精子和卵黄等的下层混合液),均利用Sigma离心机高速离心(8000 rpm离心5 min),弃上清,留100 µL混匀后进行LB培养基涂板。

  (2)第二处理组的各离心管内仅取含有大量活精子的上清液,低速离心(5000 rpm离心5 min)后取上清液,留下的活精子滴从精子活力、质膜完整率、顶体完整率、线粒体活性百分比四个方面进行精液品质检测,重复6次。取出的上清液再高速离心(8000 rpm离心3 min)后弃上清,余下液体混匀后取10 µL均匀涂抹在洁净载玻片上,进行革兰氏染色,通过1600倍镜检观察其各自的抑菌效果,重复6次。

  2.4 统计分析

  每组试验均重复六次,收集试验数据,并将数据进行相应的转化,使所有数据符合正态分布,转化后的数据运用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析,以平均数±标准差(Mean±S.D)表示,显著水平为0.05。

  3 结果与分析

  3.1乳酸链球菌素抑菌效果研究

  本试验以LB培养基涂板培养后各个组的菌落数为主要统计对象,以革兰染色后在1600倍油镜下观察的菌落为辅助统计对象,以期通过统计分析对比得出各浓度乳酸链球菌素的抑菌效果。

  将经过处理的悬液,分别进行涂板和培养。 其中各组依次记作:1、阴性对照组(未添加任何抑菌剂);2、阳性对照组(青霉素30 µg/mL,链霉素15 µg/mL);3、试验组1(Nisin 5 µg/mL);4、试验组2(Nisin 25 µg/mL);5、试验组3(Nisin 50 µg/mL);6、试验组4(Nisin 100 µg/mL);7、原精处理组。

  图5 LB培养基涂板菌落数统计图

  通过图5可知,添加25 µg/mL Nisin的平均菌落数相对较少,且与添加50 µg/mL Nisin 和添加100 µg/mL Nisin 的试验组相比平均菌落数相差较少,即它们之间的抑菌效果相似,而添加Nisin的各试验组的抑菌效果均优于添加青、链霉素的阳性对照组。另外,不论添加乳酸链球菌素的试验组组还是添加青、链霉素的阳性对照组都比未添加任何抑菌剂的阴性对照组和原精处理组有更好的抑菌效果。阴性对照组与原精处理组的平均菌落数几乎无异。说明当乳酸链球菌素浓度上升至25µg/mL之后,可产生较为良好的抑菌效果,这种抑菌效果比添加抗生素的抑菌效果更加明显。

  图6 革兰氏染色图

  注:红色箭头表示革兰氏阳性菌,黄色箭头表示革兰氏阴性菌

  另外,通过革兰染色滴片的观察,可发现除在阴性对照组(未添加任何抑菌剂)可以观察到相对较多的被染为蓝紫色的革兰氏阳性菌外,添加Nisin的试验组几乎只能观察到若干被染为粉红色的革兰氏阴性菌,而由于乳酸链球菌素的抑菌图谱表明其主要抑制革兰氏阳性菌的生长,因此可以辅助说明乳酸链球菌素起到了一定的抑菌效果。

  3.2添加乳酸链球菌素对精液品质的影响

  在精子获能液中添加如试验设计中所述的各浓度试剂,记作:1、阴性对照组(未添加任何抑菌剂);2、阳性对照组(青霉素30 µg/mL,链霉素15 µg/mL);3、试验组1(Nisin 5 µg/mL);4、试验组2(Nisin 25 µg/mL);5、试验组3(Nisin 50 µg/mL);6、试验组4(Nisin 100 µg/mL)。在经过45 min获能处理后,分别从精子活力、质膜完整率、顶体完整率、线粒体活性百分比四个方面对精液品质进行评估,将观察统计和分析的数据记录下表6。

  表6 添加不同浓度Nisin对精液品质的影响

  处理精子活力质膜完整率(%)顶体完整率(%)线粒体活性(%)阴性对照组0.38±4.45b34.04±2.42b75.37±2.48c35.33±2.13c阳性对照组0.57±4.79a41.49±1.71a86.20±1.85a40.77±2.18b5 µg/mL Nisin0.42±4.42b35.33±3.35b82.10±2.71b36.83±2.11c25 µg/mL Nisin0.62±4.45a44.15±1.37a86.58±2.19a44.85±1.71a50 µg/mL Nisin0.55±4.92a44.70±0.69a87.22±1.62a43.15±1.12ab100 µg/mL Nisin0.40±5.27b32.50±1.64b80.76±1.99b35.13±1.81c注:同一列中含有相邻不同字母上标的表示差异显著(P<0.05)

  从表6可以看出,添加25µg/mL Nisin 和添加50µg/mL Nisin的试验组,在精子活力(0.62,0.55 vs 0.38, 0.42,0.40; P<0.05)、质膜完整率(44.15%,44.70 %vs 34.04%, 35.33%, 32.50%; P<0.05 )、顶体完整率(86.58%, 87.22%vs 75.37%, 82.16%, 80.76%; P<0.05)、线粒体活性百分比(44.85%, 43.15%vs 35.33%, 36.83%, 35.13%; P<0.05)四个方面的品质均显著高于未添加任何抑菌剂的阴性对照组和添加5 µg/mL Nisin、添加100 µg/mL Nisin的试验组 ,而与阳性对照组(青霉素30 µg/mL,链霉素15 µg/mL)差异不显著(P>0.05)。说明当在受精液中乳酸链球菌素的添加量达到25 µg/mL时,可以达到与添加青、链霉素相似的精液品质效果。

  4 讨论

  精子体外获能技术如今已经趋于成熟,获能液中的成分研究也基本趋于完善,现在的体外获能技术中普遍在获能液中添加咖啡因、肝素、钙离子载体等以增强精子的运动能力,提高精子的体外获能效果。同时,在获能液中添加抗生素以达到良好的抑菌效果,维持精子的体外获能环境。

  在获能液中抗生素的添加是必不可少的,但是抗生素残留的危害也日益显著,不仅造成环境污染,影响人体健康,也会对畜牧业的经济利益造成损失。尽管抗生素的残留是微量的,但是长时间的累积,也会对人体组织器官造成不可挽回的伤害,其中主要的危害有以下几种:一、毒性作用,使人体主要产生急性或慢性中毒反应。二、“三致”作用,即致癌、致畸、致突变,有研究表明,抗生素可能造成染色体畸变和基因突变,从而产生“三致”作用,这对人体有很大的潜在威胁。三、过敏反应,尽管过敏反应针对少数个体而言的,但是过敏反应的后果是很严重的,例如青霉素的致敏反应重者可导致致死的过敏性休克。四、产生耐药菌株,长期使用抗生素可能导致耐药菌的产生,而耐药菌可能在整个生态圈进行传递,从而使得抗生素在某些情况下不能有效的治疗人类或者动物的传染性疾病。五、引起肠道菌群失调,抗生素的残留可能造成肠道内正常菌群的死亡或者抑制其生长,使肠道菌群紊乱,人体会因此而产生一些不良反应,如严重腹泻等。六、对生态环境的质量产生影响,在人类和动物的排泄物中可以检测到有活性的抗生素,若用有抗生素残留的动物粪便施肥,这土壤中的抗生素浓度会升高很多,对土壤中的微生物产生影响。

  从多个角度进行分析,尽管抗生素在畜牧业生产中发挥了很大的作用,但是其产生的副作用也是不容忽视的,长期使用抗生素确实对人体会产生很多不良的影响,而本试验建议将受精液中添加的抗生素,替换为有相似抑菌效果的乳酸链球菌素。由于乳酸链球菌素是乳酸菌代谢产生的一种多肽类物质,食用后在肠道内能很快被酶降解为氨基酸,因此不会有残留,也不会影响肠道菌群,更不会像抗生素一样使细菌产生抗性。另外,使用乳酸链球菌素作为抑菌剂,在人类和动物的排泄物中不会产生有害有残留,不存在对生态环境有危害的污染物。乳酸链球菌素作为天然、高效、无副作用、安全、绿色的食品防腐剂,在食品工业已经有了广泛的应用,这些实际应用更加证明了乳酸链球菌素作为防腐剂的安全性,更多相关内容在此前已经论述过。因此,将乳酸链球菌素应用于本试验中确实可以减少抗生素的使用量,同时降低抗生素产生的副作用。

  乳酸链球菌素是用作为食品防腐剂的唯一的细菌素,因此在选择性试剂食品级质粒转化中是可以被接受的。乳酸链球菌素的免疫基因(NISL)来自生产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌菌株,它已作为食品级载体被使用。NISL和乳链球菌抗性基因NSR载体可使细胞抵抗≥ 5 µg/mL Nisin。本试验将Nisin应用于精子获能液中,旨在抑制精子获能过程中细菌的产生,使精子达到良好的获能效果。由于获能液中精子密度较大,细管冻精中又存在较多的卵黄等对细菌有营养作用的杂质,因此本实验从5 µg/mL Nisin开始,进行梯度设计,这种设计是可行的。

  本试验通过进行LB培养基涂板培养后菌落数的统计及革兰氏染色后菌落的观察来说明不同浓度乳酸链球菌素的抑菌效果,再从精子活力、质膜完整率、顶体完整率、线粒体活性百分比四个方便说明不同浓度乳酸链球菌素对精液品质的影响。结果表明:在精液品质方面,添加25 µg/mL Nisin 和添加50 µg/mL Nisin 的试验组与阳性对照组(青霉素30 µg/mL,链霉素15 µg/mL)无明显差异(P>0.05);且添加25 µg/mL Nisin 在获能液中经获能处理后其精子活力(0.62 vs 0.38, 0.42,0.40; P<0.05)、质膜完整率(44.15 % vs 34.04 %, 35.33 %, 32.50 %; P<0.05 )、顶体完整率(86.58 % vs 75.37 %, 82.16 %, 80.76%; P<0.05)和线粒体活性百分率(44.85 % vs 35.33 %, 36.83 %, 35.13 %; P<0.05)显著高于阴性对照组(未添加任何抑菌剂)、添加5 µg/mL Nisin和添加100 µg/mL Nisin的试验组。在抑菌效果方面,添加25 µg/mL Nisin、添加 50 µg/mL Nisin和添加100 µg/mL Nisin的试验组抑菌性基本一致,且均优于阳性对照组(青霉素30 µg/mL,链霉素15 µg/mL);另外,包括阳性对照组的各组抑菌效果均明显高于阴性对照组(未添加任何抑菌剂)。由此说明,当乳酸链球菌素在受精液中的添加量达到25 µg/mL时,就可以产生良好的抑菌效果,并且保证较好的精液品质。

  5 结论

  本试验通过在牛精子获能液中添加不同浓度的乳酸链球菌素替代抗生素,同时筛选出最佳的乳酸链球菌素添加量,使牛细管冻精能更加有效的进行获能处理。经综合对比分析试验数据,得出结论,当精子获能液中乳酸链球菌素添加量达25 µg/mL时,能达到优于抗生素的抑菌效果,并且保证与添加抗生素相似的良好精液品质。

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